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1、酸性磷酸酶的 分离纯化和动力学分析,李 平 法,临床生物化学教研室,踪鞘鸽侣恩圾绷熟墟淋瘪峦鸥裂狐散盂囱碍绩饼笛渺乏翻蹄译懂帆欲菌巢酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,概 述,酶在物质代谢及调节中的重要意义； 常用的酶蛋白分离纯化方法； 酶类检测在临床生化检验中的意义； 酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。,翁罩闹漾编鞘冰兵之族怠蘑帝沽廓堪趋英獭辟涪销俞橇凑扰展磋著栗枷砒酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,目 的 要 求,1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选
2、择和方法建立。,簧循雹更茨片刚堤磅柜摸估协碴黔汇民仕烟吉捷赫塔破消尤亨良费谨质魁酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,试剂与器材,一、ACP的分离纯化试剂：见实验教材P31；,二、ACP动力学分析试剂：见实验教材P35；,三、器材：普通离心机，721分光光度计，恒温水浴箱，研钵等。,钱衰桃孪枫贼二诺蛙绑层碾滓尖磊归碟激事贿杨本族臭闯邵环唆审帛硅匙酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,实 验 内 容,一、 ACP的分离纯化,二、 ACP的比活性分析,三、 ACP的动力学分析 1. 时间进程（t-V ）曲线 2. 酶浓度-速度（E-V）曲线 3. pH-酶活性 （pH-V）曲线 4.底物浓度-速度（S-V）曲线 5.抑制
3、剂-速度（I-V）曲线,汉比巩相谅铅网足才疆葫东蔓紧孤桐御勾舞啸渐谎帆栏串狱腮绽戴趾絮璃酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,一、 ACP的分离纯化,1.概况： ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广,上峨穗准苹写受月浓为妈满蚌仇性股却逾舟评吨览靛宋百替道闰背详汰蘑酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,2. ACP的分离纯化方法, 根据ACP的理化性质，可以用层析、电泳、透析等多种方法分离纯化。 本实验采用分级离心+分段盐析法： ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以次逐步离心分离； ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70C仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变
4、性沉淀和分段盐析。,呼七泰雅你迭峰辟偏邮园窟屁寿赔擅欠巩春奥斡麦宙挝恐烹埋霜孽窜蓝翼酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,3.ACP分离纯化的步骤流程,小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水,滤 液,研碎，4层纱布过滤,3500rpm，10min离心,上清液 I,4000rpm，10min离心,1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液 I,上清液 II,（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）,缓慢搅拌,材人痛厉氖挣经谢官汛严缓龋绥殃散才荤炊挽缝羔裤聂啃篇冀吩忱唁呸冲酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,4000rpm，8min离心,上清液,5000rpm，10min离心,饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液
5、II,上清液 II,（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）,4000rpm，8min离心,上清液 III,70C水浴2min 冷水浴3min,饱和硫酸铵 51ml /100ml上清液 II,沉淀（酶粗提物）,（ 沉淀ACP）,缓慢搅拌,缓慢搅拌,绪邀舀二遥埃悔郁年究挂涕稿赎竣河涛彝釉苯菊购化煌蔓哥荤募甫维烂瑞酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,4000rpm，10min离心,约1/3上清液 III蒸馏水，溶解，洗涤,（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）,4000rpm，10min离心,上清液 IV,沉淀（酶粗提物）,（ 沉淀ACP）,EDTA9ml，饱和硫酸铵10ml /100ml上清液 IV，2倍体积预冷甲醇,沉 淀（
6、酶纯化物）,4000rpm，10min离心,蒸馏水溶解，洗涤,上清液 V （酶液）,缓慢搅拌,瓮茧颓包艇总皇氓鲁饺醒蝴自侯削育掌念盐庭址暗巷伴卿实背狈嘎携当奉酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,1.各上清液中蛋白质含量测定 原理：染料结合比色法CBBG-250，max=595nm； 步骤：标准曲线制作 各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。,二、 ACP的比活性分析,服腕赞更禄抡磨樊葡功亨真竞任酥蚤脖标船养拟舞屯桶哆寝宅葡昌妮变霍酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,2.各上清液中ACP活性测定 酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4-AAP缩合
7、最终生成红色醌类化合物，max = 510 nm； 注意：显色过程中两种缓冲液： 柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供ACP反应条件 碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件,酬葵聂没从寺诵添疾更娥藻怒纱赌沼宿媳卷淄补索防馈芳级棒史舆烂杭村酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,3.各上清液中ACP比活性分析 ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚即nmol/minml为1个活性单位；,纯化倍数=,各上清液中ACP的比活性,上清液I 中ACP的比活性,比活性=,酶活性 U/ml,蛋白质含量mg/ml,酶的回收率=,各上清液中ACP的活性 总体积,上清液I中ACP的活性总体积,还可以计算蛋白回收率
8、，反映纯化效果，代表方法的特异性。,锯睦捌笔删普员棒攀肌赘养扔同瘸雨莉浚峙惰僧佰啤企周弛阑荧易屯琐咽酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,三、 ACP的动力学分析,1. 时间进程（t-A ）曲线,A,ACP的 t-A 曲线,灵鼎淆瞻徽筐捍举逐饵春楷只赌梳充恢缝蜒除贴金豫肄弓念悟桨郡承性呢酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,2. 酶浓度-速度（E-A）曲线,酶蛋白含量（E）,反应速度,V,ACP 的 E-V 曲线,罗裴霸嗡伪喊沼各佬堆饭质福漓雷栋犁扛谋舌喀藏潜桂驯尘傀来双慢碟北酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,3. pH-酶活性 （pH-V）曲线,pH,反应速度,V,最适pH,ACP的pH-酶活性曲线,矮统饵栏彝惮访靴兄锥灭
9、紊奖婆剔剖滨仆沥笋物流壹翱喝吩蛛吮骄尹溃诺酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,1.影响方式： 当S较低时，V随S的 增加呈正比例增加 当S较高时，V随S的 增加减慢 当S增大到某一值时，V 达到最大反应速度Vmax,2.影响曲线：,V,S,Vmax,（矩形双曲线）,Km,4.底物浓度-速度（S-V）曲线,遭臣厦乳蝇逻筐匹抖醇漫赂钙惮峰伶欢装镐鹏腥笋饥舷戊谐愿枉癸财瓜钱酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,曲线方程米-曼氏方程,（1）米-曼氏方程： V=,VmaxS,Km + S,V： 某一时刻的反应速度,S：某一时刻的底物浓度,Vmax： 反应系统能够达到的最大反应速度,Km：米氏常数,随景涯咽硕氓稼沾溶灸愿绚猫置
10、涩示岩蹲哨赡致绵吴勤则腺荡干涌碎劳现酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,Km和Vmax的测定： 双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数得 1 1 1,V Vmax S Vmax,=,+,1 V,1 S,纵截距=,Km,Km,Vmax,斜率=,Vmax,1,横截距=,1,Km,-,潜鸽谅脾坐勒伟浑美玛渐粉兼司阵治器匙渺墩婚犬线隋滨花啊挂字勉矢唱酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,1.抑制剂的概念： 抑制剂（inhibitor）：能使酶的催化活性下降而 不引起酶蛋白变性的物质,2.抑制作用的分类：,抑制作用,不可逆性抑制,可逆性抑制,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,5.抑制剂-速度（I-A）曲线,兵钻测监饿米隶休
11、产海球抡酥求继鹰搜打署柿勤垣妮代像射抓寞律敌瓷俱酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,竞争性抑制的动力学变化,米-曼氏方程变化为： V=,VmaxS,Km（1+I/Ki） + S,此时， Km增大， Vmax不变,1/V,1/S,E + I EI,Ki,无抑制剂,有抑制剂,笆遇怔值击笼至饱螺此携曹胞蓝摊巩勾厂统邦由璃纫番卡碧谨域亢喳沛沫酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,KH2PO4对ACP 的抑制分析,1/V,1/S,无抑制剂,有抑制剂,分析抑制类型,KH2PO4对ACP 的抑制作用,式顽狐己然瞧威拔渭衍搓芯蕉宋沪画占拷鲜胰翔靴轿蹬谷父泽棒蒙溃活子酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,实 验 安 排,1. 实验分组,2. 实验时间安排,3. 实验内容选择与分工,4. 实验报告书写,兹律蠕叹燎蚜臻纂辰跪遥攻盒辛帮蝶虾掺扳弦挑严编珍磷正谦厅溉丢勇回酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,颅痛市颇搅倍蚀写虑拼舟悯荷篱划璃退茵斌港珊基杆溉柴隧肤蕊署辗畴吵酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,谢 谢 指 导,喳玫钧焚氟倾接祟庚耸论羽癣凡拯棚珐狈筑搏狮确减墨但豹齿突齿坷巍识酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的,