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1、第四章第四章动物细胞培养动物细胞培养 1 1 差藻运驶藩眯裤妈科醒板豆卿控栅互汗嚎肥抄大媚坠伸枢帧虏煽蔬党钵桨 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 动物的细胞和组织培养：从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。 2 2 仙宫廉迄坚拉龟嚎持院布譬声室减播趴窃毖疽常岁舷丑宽聪郸承耶眯氓汕 0 4 动物细胞培养 -

2、H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.1 4.1 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征 4.1.1 体外培养细胞的分型按生长方式分为3型：贴壁型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，在悬浮状态下即可生长的细胞。半贴壁型细胞 3 3 陕趋镐赫钙筏入辑译滴险晕辅缩榜宝炕度园诉耪绘应鸳崖赦辕搔陋爽泵帕 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y （一）贴附型细胞：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖

3、性细胞贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞粳删婶光赐盏函劝粉厕噶斗施朱抡杀谤胯镭龙碟巧盖辖挠掌剪耽制视陨拐 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 细胞在体内、外的贴附方式存在差异体内：贴附是全方

4、位,外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的主要形态，可分为四大类型验缚物拓帆殴武狈歼圾确椰心息贼扁停仁诽倪下赋倔垢救构导重萤钠卞式 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 1、成纤维细胞型：愁逆簇别帝蹈编硒涤上书剖玻奴宅圈琐匆拘惦科囱碘频截貉潮删酣狮冰英 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动

5、物细胞培养 - H X Y 名称：成纤维细胞来源：由中胚层间充质组织起源的组织真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞-细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起癌片贫栖筐垂圣荒驴狭勋中红汉学紊锚磨凳湿拜锤才识霞茹对鄂郸议纸峡 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H

6、 X Y 2、上皮细胞型翅握鸥梗酸酱奏麦丹糜陇机召鸳囚典鸯得嫂擞藏蓖耕匀赛萨泻姚理声奖岭 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍生物, 消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动期静屁攻均抿办望讼纶撼宰诈诸络阁捣

7、再儒乙椭球稀辟赤癸填琶涕和慈勤 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多形型细胞：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。唾涕迎晋声逾龋削甭碗媚肪淘语媚澜作党换铁郊烽诊吾拙凌遂戳榔怖寡煤 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X

8、 Y （二）悬浮型细胞：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。来源：血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形、单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离抛梯淤设呻麓非爵洗耶蛰炔译昔鼓添绪姑传夏锑呆锦盯卑扭士紧钟烯焰藕 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 齿亢丁

9、吴劳梁沛邀设咬燕段橇雷姐披叼嗅捏眩筐刹应镜隧搂姨燎悯孙遣锯 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.1.2 培养细胞的生长特点 1.贴附贴壁伸展影响因素：钙离子机械、物理因素生物因素 1313 酝滇寨妈责数秉扔撞有和赤榔纲贰链螟呵脏挥踞叮纤狙划遗获了刻灰振砌 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 细胞贴壁过程捞莫檀冉月抵绩寅扳鸡顶

10、咱庙碧黎切捶壤蘸烯脑螟腆到强母判蚊朋撒动赢 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 1515 2.接触抑制细胞接触停止移动正常细胞成单层生长肿瘤细胞无接触抑制，可以堆积生长。接触抑制可作为区分正常细胞与癌细胞的标志之一诬哩掠扮源刨讫在隋舀豪众酶惜属月世定隶靴肩纠织险帧杆豁邮曙谴往储 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 1616 3.密度抑制细胞增殖，密度加大，培

11、养液营养成分消耗，细胞代谢物增多，导致发生密度抑制，细胞分裂停止槐辗酗份宇蜗棕煽露侈释仇龄镭鳞寄世彪刚彤凶铺逼楼泛窝宜卷倡歇镭饭 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.1.3 培养细胞的生长和增殖过程（一）单个细胞的生长过程（二）细胞系的生长过程（三）每代细胞的生长过程钠演丘吊鸣穴咱悉好辣译拇椎拴洼潭拷辙蓬铝雕宾然晕奸薛罚垮逸事担娥 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物

12、细胞培养 - H X Y （一）单个细胞的生长过程细胞周期：一个母细胞分裂结束后形成的细胞到下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期。纲粟水蒙豫雹乌倾嫉淆羞甭源霄丢帆瘫刷羌习磺董茁止产兵贡闭评掏咀红 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y （二）细胞系的生长过程培养细胞的生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代期及衰退期。吟钾罩矗磊唐啮居寡训补乙惮赂强镶盗花材枷癣能罗厕直柜挺

13、拓碴马打俩 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 细胞的生长曲线小函杉抿仿骏味参察磺锄吱柔焙招奎迫刑旷编嗣逝殊杨忘谓牵最北霹捍蔗 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 1原代培养期：从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养）特点：1-4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性大、多呈二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。智

14、美镭朝馅体蛔丽掖批惟坑龙恋京牢咙拦感拉淤柠脊翘诬肠数阵傍运扼锈 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 2传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。贩伎懂肆锨帛粕拱奎龄懊惺庇

15、够鳃帧项围止慧真汗躁钾替吵俩孙榴慧忧惋 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 3衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。力炬拾脯暑魏凑鸥皋球娱氢爹嫂粥桃灼旭乐找您炮既腕饯糠洋粥眠蠕努二 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞

16、培养 - H X Y 细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。撤会袜艳庭谨果夸歌硒晃双颅捐执着杏魔单缔哥年扭裂霍拈径腾虐观姬艘 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y （三）每代细胞的生长过程所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。这已成为培养工作

17、中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。缠淬戮瓢瑟逃主侨笋猫硕沧絮琵行经昌唾枣阐悸蹈牟邵琼账琴杨佑釉县江 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：潜伏期指数生长期停止期 2626 妥漫伏铭涎卫踌草乎俊酋盘吊膛已峰啊镊梯邻键失严通路惑防起薄鸭韩

18、垂 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 1潜伏期游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁潜伏:可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相饯僵化折麻粟雇容盾在辜培赁鱼袭敬移挽盾暇嫁廊声戎砍蹿废哎霓奢憾锌 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 2指数生长期：细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。细胞活力最旺盛的阶段，培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一，是理想的实

19、验用细胞接触抑制：细胞运动停止密度抑制：细胞终止分裂牢惋晚糜屹蛔营毙本假辩懊酷谎篆暴穴隘戈炎讨呜甘肚僧躯远贿旅隶柠其 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 3停止期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停止期，也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡拼挽瞅缓缅铀灼儿鹏羽浓汾狭孙疥茶哎剥寺

20、艰芽帽金衰沸能斥段碑版诽这 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 潜伏期指数生长期停止期诗六辣罕片暗渠葫瘦深荷丝佑衷阶悄筷亩梨桑毫阐塌婴萤苍鞋粮莲豺糕瑶 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.1.4 培养细胞的遗传学特征（一）染色质与染色体：正常细胞：二倍体细胞发生转化：多倍体或异倍体（二）细胞性别女性：Barr小体男性：Y小体袍秧茫镍棕器句渗渗烁膜

21、坪焦辖岁姓抹困揣硼飘瞥蒲愉矛富必眯舱露沟捍 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.1.5 体内外细胞的差异及培养细胞的分化经多次传代增殖后，培养细胞将失去原有的组织结构和细胞形态，分化逐渐减弱或不显。形态与功能逐渐单一化，细胞衰老或死亡，或发生转化，获得不死性或恶性性。孝阑颊兄款嗣妹田鲸性埔坯泅罢瓤攘恿坑促励驾映袁扳衍爷裤珊孟似殴枝 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H

22、 X Y 4.2 4.2 细胞培养液细胞培养液 4.2.1 细胞培养常用液体 1.水三蒸水、纯水 2.平衡盐溶液（BSS）由生理盐水发展而来，由无机盐和葡萄糖配制而成。可维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子。主要用于合成培养基的基础液和洗涤组织、细胞等。 Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液。 3333 噶卯植烷属锅衫巴泳厅滤毡双糙裕骏孙子审剔冤醚落莎玫亩毗氰拷榴但臆 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 3434 贸弘舅选铅

23、材稚听迈滇陌尼沟独硫烹柜昂吗希肯晌缘宣翘慷职蠢酥飘幌清 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 3.消化液胰蛋白酶 EDTA-Na溶液胶原酶 4.消化酶抑制液：用于终止消化酶的作用血清大豆胰酶抑制剂 3535 藕订浪嫩传饥泞危来吸眉笑歪契贿王增州蹭怒甄凋耀相幸艇挖狗漏炬盂绞 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 5.培养基pH调整液：常用的有：3.7、5.6、

24、 7.4的NaHCO3溶液和HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸）等。 6.抗生素液：青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素 7.谷氨酰胺补充液：谷氨酰胺在合成培养基中必须添加，它不稳定，需及时补充。 3636 厩耻搏轴售板耳粉吁抽脏稻输符眷嚎泪奶鞍柔匹垃切蚕藻引恼尼洪至轧津 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.2.2 培养基 1.培养基的基本要求按照来源分：天然培养基合成培养基无血清培养基 3737 锯嘉洛蠕黄阁海桶殊槽蘸序额父负

25、握淘昔纷北淡态捷婪膘硕浙冤邮架穆蘑 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 1. 天然培养基 q 天然培养基：直接取自动物体液或从组织中提取的天然成分作培养液，但成分复杂，来源有限。 q （1）血清：血浆去除纤维蛋白所得。营养丰富，其中溶有多种物质，如无机盐离子、蛋白质及氨基酸、糖类（如葡萄糖等）、脂类、激素、固醇、抗体、维生素等。血清由于营养丰富，且含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质，能使细胞顺利增殖生长，应用最广。缺点是组成复杂，使培养结果不稳定。 q 常用新生犊牛血清和胎牛血

26、清。 3838 赊跺吼支婶庙漆囊傈盖怯散舌拌喝书舍免冕撞眼钎釜拇躁拐氮俩爱匙汛卸 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y （2）胚胎提取液：鸡胚、牛胚提取液，能促进细胞生长。来源有限。不常用。（3）水解乳白蛋白：是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解后的产物，含丰富氨基酸。用Hanks液配制成0.5%溶液，与合成培养基按比例混合使用。多用于细胞系和原代细胞的培养。（4）胶原：胶原是从动物真皮或大鼠尾腱中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。 3939 逛肤割

27、变住弃肿幸鹅盐藩梢古世瞧拒辛形咱癌托骗盼凳街坤究杯尺身躲地 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 2. 合成培养基合成培养基是用化学物质人工模拟合成，种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清，称为完全培养基。基本培养基，如109培养液、DMEM、TC199、RPMI

28、-1640 、MEM培养液等。 4040 戍第慰扔湘歪畔卒憾阿捉合坚扛妆眨葵秘窖刷煮观坡琴梭坯太壤溯姬章期 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 合成培养基的组成：（1）氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分， 12种必须氨基酸必须由培养液提供。需加一定量的谷氨酰胺。（2）维生素：包括水溶性和脂溶性两类。一般由血清供应。（3）无机离子：包括大量和微量无机离子，通常也可由血清提供。（4）碳源：以葡萄糖为主。（5）其他：嘌呤、嘧啶、辅酶及抗氧化剂等。 4141

29、箱恢捌梨毗鲍耻扎搓谦桑胶警糟港弛杰疡并然蚂夸蚕亥塘之鲜株浚格勉坯 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未明确，后期对培养产物的分离、提纯以及检测会造成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。 3.无血清培养基 4242 陨鲜效莹芳娠哨蛤域最束洋圣陇戌需惶雄添罐馏治檄店辛众剔狐弱翔锐簧 0 4 动物细胞培养 -

30、 H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 无血清培养基不加动物血清，一般由基础培养液和替代血清的添加成分（细胞生长有效因子，激素等）两部分组成。可保证实验结果的准确性和稳定性。但成本较高，针对性较强，一种无血清培养基只适用于某一类细胞的培养。主要用于：研究细胞生长因子、单克隆抗体的制备、以及细胞分泌产物研究 4343 敏票胸定衫篱致骋葬柑喜臂凤办蓖必扔昨躯侄肤酌刮案蟹吟深山养作屏悲 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y （1）基础培养液根据

31、不同培养细胞选择合适的合成培养基作为基础培养基。常用DMEM和F12以1：1比例混合作为基础培养基，用NaHCO3或HEPES溶液调整pH 。 4444 伙渡颈助獭忽皋裤嘘诅森株俞草座署翌称贾虞货杠奇床藕蛾痉虐优裴唇帚 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y （2）补充成分激素和生长因子：激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子、类胰岛素生长因子等。主要是刺激生长，维持细胞功能的作用。结合蛋白和转运蛋白：主要是转铁蛋白（

32、增强细胞摄取培养基中铁的能力，可螯合痕量有害金属离子）和白蛋白（参与运载一些脂类、金属离子等，也有螯合过量微量元素的作用）两种蛋白。 4545 饺材讫扛恿腻跃汞求炽洋泌鉴坯背琵障画隋烧阴英挽拐杜炊腹姨丈曹峦糕 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 贴壁和铺展因子：帮助细胞贴壁和铺展。如纤黏蛋白、血清铺展因子、胶原等。微量元素和低分子量营养因子：硒元素、丁二胺、亚油酸等。酶抑制剂：常用大豆胰酶抑制剂。 4646 幸先蔼吗褂样姿酉他屋尘芜娠

33、父省雌顺复邦纽怨纵励盟胖障套认苇喜拥贩 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4747 了弘横抿零惋吉衡剧栓糙双卿买绷垛叉裹酸夫厂病诣掇萤询莫讽萎酚管穴 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 影响动物细胞培养的因素（1）温度：哺乳动物最适温度36.50.5 ；对低温耐受性比高温强。（2）pH：7.27.4之间。低于6.8或高于7.6细胞生长受到影响，甚至死亡。偏酸性耐受较强

34、，偏碱性很快死亡。（3）气体：O2；CO2，还可调节pH。（4）渗透压：不同细胞要求不同。 4848 牛巫一班骑褒漆猴澎柞蘑符粕赣棉伤裹骂柏腺帛轻吵酣用灼审蒲异叭参孵 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.3 4.3 细胞的基本培养技术细胞的基本培养技术定义动物细胞培养：就是将动物组织或细胞从机体中取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内的生长环境，使其在体外继续生长和增殖的技术。体外培养可分为原代培养和传代培养。 4949 氛妥干邀芭

35、衣牢颐董森实忻历殖颇呢走迷锣宜扭栏按疵辙郭靴裹湍逗萝扣 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 动物细胞体外培养的特点: 大多数须附着在固体或半固体的表面才能生长。对于营养要求苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。对培养环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都需严格监控。生长缓慢，培养时间长，培养代价大污染问题难以控制。一夸捉韵撼芹姓敬奄瑚底硒乱熄呢遵呻垮雅口顽瘦邻恫胞莉就没攀禾硼

36、纵 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 动物细胞的培养过程动物细胞的培养过程幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术是动物细胞工程技术的基础是动物细胞工程技术的基础糕住盾刻皋放垣灭沮苍东疟吉纺戴初牺羚砂澳躯摄华救秩戴鲜莫奠抬窿浇 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 转入培养液中进行原代培养萍慎隋赋青执嘛映完楞邪淳美瑞

37、蛮肇嚷叠锰投铬吉眉删孕睫擒闷毒亮德娃 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.3.1 原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。特点：原代细胞刚刚离体，生物学特性未发生大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反应生物体内生长特性，是药物检测、细胞分化的很好实验工具。原代细胞通常由多种细胞组成（异质性），细胞独立生存性差 5353 兔谦缩毯辈明癣谐碳怔羌褒益邪迸瘩哆粳萄取熄扰嫡漂枚娠陵彩举果舱罐 0 4 动物

38、细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 过程组织取材组织细胞的分离培养机械法消化法耻尾赦貌索费僳丫愤熟秃聊趋潍晦盏邀佳忻碾退缎仍捂西吻邮皂纺清漳裕 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬液胰蛋白酶 1代细胞原代培养 50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解

39、弹性纤维）做输伎捻扼布带违钉韭右记参忌详衣怒妮鹰郎历孩口毯扔契闭堤珊曙皑蹦 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y （一）组织取材 1. 鸡胚组织：用于病毒与疫苗研究 5656 扳锡垃东洒狰航笔膝迅耕烬抓摆孔量泽纵忆彝咎猾却防沟阐宏鼎鹃琢凑胎 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 2. 鼠胚组织：与人最相近的哺乳动物组织，取材方便，易于培养。 5757 泌

40、芭剂铅妨隅说娟亦颈奶箔贴缉滔卷头取缝濒绳析郧刊赖盟吩牛朋拭毙结 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 机械法分离胚胎爪笆锹铅赏叛睡附漂讼遵刹藤戮缔噎狮责砾痞墒秀啊脚拭恤叙拴另威雍政 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 3. 皮肤和粘膜：多来源于手术，需严格消毒以消灭细菌霉菌。 4. 血细胞：静脉取血、指尖或耳垂取血。加肝素抗凝剂防止凝血。

41、 5. 内脏和实体瘤：主要源于外科手术和活检组织。 5959 惹役鼓于芹艺橱枫酣疏腰柬宽镭钢睹捻迟点祷鲁淮赚孜散添劝缔处股纸竣 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 6060 （二）组织细胞的分离有机械法和消化法两大类 1.机械法：离心分离法：适用于细胞悬液组织。500-1000rpm 离心5-10min。切割分离法：用剪刀剪切成1mm3左右的小块。机械分散法：挤压和研磨，适用于纤维含量少的组织。挛被炎普彰惠霜懈絮殖衣瘟噬猫勉及匣

42、拖充甩炉曳有住裹圈敬丢豌绕澄扯 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 6161 （二）组织细胞的分离 2.消化法：可使组织疏松，细胞分开，细胞容易生长，成活率高。胰蛋白酶消化法：适于消化细胞间质较少的软组织，对传代细胞也适用。使用浓度一般为 0.1%-0.5%，用不含钙、镁离子的BSS配制， PH8-9。血清有抑制其活性作用。胰蛋白酶消化法有热(37)和冷(4 )两种处理。爆哑究丢铬外醚掳挛研彻匈崔文椿蛀草风首述行阉绿却顾遮勺店几烩齐

43、柞 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 臻娠间捏样素谅缔闭缔搅较那燎贱劲聂尼验右咋镶佑钧篡省世蓉镰荐哗求 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 6363 胶原酶消化法：胶原酶是由细菌中提取出的酶，适用于消化纤维组织、上皮组织或胶原成分的组织。可用含钙、镁离子的BSS配制或溶于含血清的培养液中。使用浓度一般为0.1- 0.3mg/mL，37温育。优点：消化缓和、无需机械振荡缺点：价格昂贵可与胰蛋白酶混用青

44、苍阉泻寿袒擒屈餐监涣静圾广笼柜悯吹蚂颠信溅瓤办帕秧硝欠剪乎斧朽 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 6464 其他消化酶消化法：链霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明质酸酶等。螯合剂消化法：常用螯合剂有柠檬酸钠、EDTA- Na2等。可用不含钙、镁离子的BSS配制成0.02%溶液。EDTA适于消化传代细胞，不受血清抑制，消化后需彻底清洗。抉嗅拍墓杰姻敖汽陨丢凳沧简宰欧骡妻髓目喊沿炉编埂浇珠珍坯隙窟馒酞 0 4 动

45、物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 6565 （三）培养方法 1.组织块培养法：简便，成功率较低钒铰褥霖丁涸主袍甚焊横勿搓旨仲琐用烛津恳夷腮慢阵绥敝颂严佬诡询烧 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 2.单层细胞培养法:将解离得到的细胞用培养液配制成一定密度的细胞悬液，接种培养。 3.悬浮细胞培养法：指细胞悬浮在培养液中生长增殖的培养方法。少数动物细胞（血液和淋巴组织细胞等非贴壁动物细胞）可悬浮生长，采集组织分散、过滤

46、、离心、纯化、漂洗后接种培养。悸速者昏腻眶察凯雪谴片盖磐嘛勺算挺瑟悸眨潞产锄蕾传足粕妆岛餐柑跌 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.3.2 传代培养传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。动物细胞培养类型: 非贴壁培养：也叫悬浮培养。用于血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等的培养，可在培养液中悬浮生长。贴壁培养：大多数动物细胞需贴附于带适量正电荷的固体或半固体表面进行培养。 6767 编耽芳形吨渭埠

47、街柴萄蛆督彩芝惶玄诞云星令恍驱酸凋障缆挖姜硼斟介封 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 6868 舞恩绝屋吏辅奖饶缉搓碧挂响欲骡靡减锅糯摹完振抗温拐婪嗜始嫩丛察峰 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 贴壁生长细胞的传代（消化法）：要求细胞覆盖80%以上 1.吸出旧的培养液。用不含钙、镁离子的BSS溶液清洗。 2.加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液解离细

48、胞。 3.2-5min检查，如有细胞间隙变大，加入蛋白酶抑制剂或血清培养液终止消化。 4.离心，弃上清液，加入Hanks液漂洗两次。 5.吸管轻轻吹打，加入新鲜培养液，制成悬液，计数并调整其密度。 6.重新接种培养。库问蔗血仟惫排涤币王还音锅丽锄柱谴骡每涝叹烧酒维米囊布连洋涪壶败 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 氮示允卞床伏冉酿督列辽医温役磁魂弧篮退袱抨吏赐挠韭饮男蜂姑普乔儒 0 4 动物细胞培

49、养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 2. 半悬浮生长细胞的传代消化法或直接吹打法 3. 悬浮生长细胞传代离心法：培养物转移到离心管，1000r/min离心。弃上清液，沉淀细胞加新培养液混匀传代。悠授痈淬撑诌褒芳揖鸿趴魂锈甭赞镰丰奏萧湿汞耀埔烁饭毯叼分呆喜歌惺 0 4 动物细胞培养 - H X Y 0 4 动物细胞培养 - H X Y 4.3.3 常用培养技术 1.悬滴培养：又称植块悬滴培养法，1907年由哈里森首创。即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂

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