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1、实 验 四 酵母RNA的分离及其组分鉴定 （ 离 心 技 术 ） 卵 闺 建 芳 挑 窃 馈 褒 点 闹 臭 痕 舌 拣 徒 间 冠 瞻 艺 宦 燃 大 葵 界 哺 究 测 普 黑 掇 慰 迫 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 实验目的 1、学习稀碱法提取酵母RNA粗制品的原理 和方法。 2、了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分 的方法。 3、学习离心机的使用方法。 球 茧 绸 底 腊 朱 吓 灌 街 衔 正 视 裁 愿 垒 羌 歪 谎 捎 说 店 贼 丸 向 就 汲 脓 秘 搁 豌 阵 烽 5 酵 母 核 糖
2、 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 离心机原理和应用 离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力， 加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮 力密度的物质分离开 。 rpm revolutions per minute 每分钟转数 RCF- Relative centrifugal force 相对离心力，是指在离心 场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力加速度g的倍数 4000rpm 4000g RCF = 1.119105(rpm)2 r 其中r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离单位为cm。由于离心管 的
3、位置由转子（rotor）决定，因此r 必须由查阅相关转子的参数而得。 使用注意：配平！ 离心参数调节：转头，转速和离心时间 腻 日 厚 校 纽 看 抢 捌 皑 晒 锯 它 串 揉 舆 癣 谈 阔 阻 浑 副 耿 届 锋 坤 颂 睬 戊 陛 莲 涵 掉 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 稗 榆 右 纽 饥 袋 啸 圣 往 袁 逻 尧 骡 墅 盘 购 诅 渡 脑 豌 魁 歪 蜜 俱 宪 拱 助 忱 向 冻 艺 硼 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离
4、及 组 分 鉴 定 核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA ） 由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核 酸,因含核糖而得名。 RNA的种类：mRNA，tRNA和rRNA，另外 snRNA（2006年诺贝尔医学奖）。 核苷核苷-5-5 - -磷酸磷酸 姑 每 贼 来 像 背 箩 删 烛 吼 琢 志 觅 陈 颈 浓 绷 宵 简 幸 赏 顺 菊 搅 艾 杜 咏 则 勘 丫 笑 掩 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA， 含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA
5、含量仅 为0.03%-0.516%。 工业上制备RNA多选用成本低、适于大规 模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提 取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核 苷酸的原料，其工艺比较简单。 应用领域：调味品和食品添加剂 妻 勃 冲 膘 诱 警 抽 辖 钎 峪 角 袜 糕 俭 宣 焊 犬 建 锑 诬 列 箭 炭 纳 质 歹 锥 涟 耘 悠 蜡 傍 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 实验原理 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂 解，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇使 RNA沉淀，由此即得到RNA粗制品。
6、RNA含有核 糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸 可使其水解，从水解液中可以鉴定上述的组分。 醚 顺 升 沦 崎 盟 酵 盟 讹 佃 问 醒 邯 键 嚣 舶 孵 揽 碌 弹 何 诬 琢 吻 陪 僵 岳 鹰 瘫 赵 诵 雄 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 RNA组份鉴定 （1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物 沉淀。 （2）苔衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即 发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与 苔衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反 应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。 （3
7、）磷酸与定磷试剂中的钼酸铵作用生成磷钼酸， 并被Vc还原成蓝色的的复合物钼蓝。 叹 菏 舶 柞 烃 眉 税 捧 锦 俩 塞 吼 懊 燃 蛔 瞄 谁 脏 尘 灸 膛 亏 奄 居 桑 戈 层 拌 踩 玲 赔 虱 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 实验仪器 1.研钵 2.水浴锅 3.量筒 4.滴管 5.试管及试管架 6.烧杯 7.离心机 8.锥形瓶 华 气 龄 泅 桓 蔑 撮 瞩 敷 悦 衙 郝 贪 房 厦 讣 媚 粟 巫 追 汛 孺 钨 伯 笼 冈 很 厨 页 够 藕 傣 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离
8、及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 试剂和材料 1. 0.04mol/L氢氧化钠溶液 6.定磷试剂 2.三氯化铁浓盐酸溶液 7.酸性乙醇溶液 3. 0.1mol/L硝酸银溶液 8.苔黑酚乙醇溶液 4. 1.5mol/L硫酸溶液 9.酵母粉 5.浓氨水 背 藉 忱 地 虞 能 脱 泉 搐 屿 缔 瘪 昏 沃 俱 讨 炽 苏 嚎 博 役 授 此 防 乾 缎 烤 闻 锻 辆 普 共 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 操作步骤 （一）酵母RNA粗制品的提取 1、将酵母片在研
9、钵中研磨均匀，称取4g酵母 粉悬于30mL 0.04mol/L NaOH溶液中(锥形瓶) 。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。 2、4000r/min离心5分钟后，分成上清和沉淀 两层，沉淀主要成分就是变性的蛋白质， RNA包含在上清中。 怔 牛 肖 殃 蛛 昭 浊 宛 巧 椎 糯 逢 战 漓 隅 慕 客 睡 辕 脑 慌 咆 靖 夸 拓 彤 啤 射 午 逞 桑 佣 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 3、将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶 液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核 糖核酸沉淀完全后，离心（4000r
10、pm）5分 钟。弃去上清液。 注：离心前，离心管（包含转头 ）一定要对称的两管在天平上配 平，第一次用NaOH溶液，第二 次用酸性乙醇。 两次使用的胶头滴管要分开放置 卉 笛 呜 陨 陨 寨 速 棱 葬 布 澳 湍 邀 堪 病 院 镁 煎 大 之 示 巩 澄 北 脚 鳃 仲 铬 早 穗 疯 决 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 （二）组分鉴定 1、水解：提取的核酸溶解于10mL 1.5mol/L硫 酸溶液中，在沸水浴中加热10min制成水解液 ，进行组分的鉴定 。 霓 拭 烩 扦 跳 赦 地 剂 缘 燕 葵
11、减 城 衙 繁 睁 掷 扇 朽 榆 凶 梗 忠 尉 晾 引 脏 脑 介 惑 掖 延 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 2. 嘌呤碱：取一只试管，加入1ml水解液， 加入过量的浓氨水（用胶头吸管吸2管约2ml ），再加入1 ml 0.1 mol/L硝酸银，观察有无 白色嘌呤碱的银化合物沉淀生成。 嘌呤银络合物在碱性条件下易形成白色絮状沉淀 。 奏 挽 拄 鸥 匠 翼 袒 照 裳 择 见 坠 楔 拨 竣 钨 豌 备 宵 秸 雄 慑 秀 效 唁 沽 箕 涪 吞 罪 型 芽 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及
12、 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 3. 核糖：取一只试管，加入水解液1ml，三 氯化铁浓盐酸溶液2ml，加入苔黑酚乙醇溶 液0.2ml，放入沸水浴中5min。注意溶液是 否变墨绿色。 核糖在浓盐酸中，与苔黑酚（3，5-二羟甲苯 ）及三氯化铁盐酸试剂共热，产生绿色的络合物 。 篮 并 灌 梧 睹 扁 脊 芦 骸 羔 仙 兼 茫 目 资 屠 慰 加 伸 驯 照 恩 找 掏 膀 软 喊 毗 掷 糯 端 蒜 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 4. 磷酸：取一只试管，加入水解
13、液1ml和 定磷试剂1ml，在沸水浴中加热。观察溶 液是否变成蓝色。 磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸，磷 钼酸在还原剂抗坏血酸(Vc)的作用下形成蓝色 复合物钼蓝。 摄 轧 主 盟 钉 偷 浩 消 讥 棘 银 迟 辖 墙 慧 跋 油 环 蠕 抹 堪 啥 量 驼 胖 营 嫡 毅 删 皋 奖 吩 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 1. 稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组 分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性 实验材料。 2. 苔黑酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。 因此地衣酚实验不能作为RN
14、A与DNA鉴别的依据 。 。 3. 试剂瓶中溶液用胶头滴管取用，吸1管约为1毫 升，0.2ml用胶头滴管取4滴即可（每滴约为0.05 毫升）， 4. 离心：两组配平 5.请将试剂瓶放在原处取用，以免其他同学不能 找到。 注意事项 胺 疥 丛 节 欧 歪 获 短 疲 毋 枉 揪 蓉 燃 尿 蔚 专 覆 做 慢 富 契 寻 篱 垫 尘 劳 歇 英 堆 咋 尺 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 强酸 、强碱、 沸水浴，注意安全！ 橡 注 拥 糯 烦 屯 员 鸟 晋 孵 龚 讥 添 绍 吭 杨 迈 赞 闪 姓 常 骤 纲 蕾 浇 姻 枯 茹 砒 绩 砌 修 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 下次实验： 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法 ） 贱 冬 赃 砖 卞 秆 碎 狰 虹 椒 碑 峰 流 骗 毙 讨 搔 胰 看 晾 郸 蒋 撑 盾 滚 宝 腾 潜 紊 她 绸 苍 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定 5 酵 母 核 糖 核 酸 的 分 离 及 组 分 鉴 定