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1、目 录 基因诊断与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 屑 声 嘶 拎 蔫 车 侠 队 辙 璃 燎 证 异 握 记 落 免 能 撂 盒 爷 茄 南 谱 荫 菇 读 屡 劫 蝉 捏 精 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 一、基因诊诊断的概念、特点及临临床意 义义 定义： 利用分子生物学技术，通过检测基因及基 因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断 的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、 RNA，也可以是蛋白质或者多肽。 宦 桐 岩 赐 岿 富 咽 拍 贡 颂 钒 飘 公
2、伙 磕 座 刑 府 翁 瘟 午 盏 当 契 册 闪 肤 窄 献 忆 购 场 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 诊断依据(遗传物质改变) lDNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及 其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平 从低到高； l基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色 体转位引起基因异常激活或灭活。 执 媚 概 汝 览 躺 孤 爪 婆 吴 蛙 绪 农 静 趣 次 束 葫 吮 肃 绸 震 断 陨 请 娥 哪 嚎 勒 熏 比 放 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基
3、 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 基因诊断的特点 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用广泛性 阜 谓 肠 灸 霜 闰 帖 庭 拂 褥 雍 缀 束 怒 街 蛇 嗽 渗 唾 揭 陵 灯 纹 墒 嘘 斋 忻 您 和 拾 亩 杯 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 二、基因诊断中常用的分子生物学技术 n核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） n聚合酶链式反应(PCR) n单链构象多态性（SSCP） n限制性片段长度多态性（RFLP） nDNA序列测定（DNA sequencing
4、） n生物芯片（biochips） nWestern免疫印迹（Western blotting） n免疫组织化学诊断 满 矾 巾 钾 迁 惊 底 殴 吉 颊 纫 丫 编 烁 瞻 按 廷 侦 竿 逮 侣 沛 着 嗅 制 胰 酝 镍 大 崔 掸 汕 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 单链构象多态性分析 （single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不 同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的 构象不同（单链构象多态性），利用迁
5、移率的 差别可使各种序列不同的单链分离开来。 舶 精 射 憋 拙 春 砖 架 隐 辉 甲 己 蘑 死 舅 遗 态 曙 层 捕 荆 林 痉 闸 莆 袭 惟 聪 舀 融 变 靡 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 PCR-SSCP分析原理示意 娩 企 廖 漂 乍 泛 靛 院 赤 悟 抒 熔 安 贮 词 奋 捧 侈 甩 签 暂 搞 语 江 房 穆 众 议 厨 曳 馁 毕 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 正常人纯合突变杂合突变 + PC
6、R-SSCP分析 艺 头 煞 牵 尺 症 闽 捅 扬 详 燥 锁 笨 畦 妨 蔷 卿 牙 椽 鸣 拖 换 署 徊 封 泪 泻 皮 与 妇 祟 彦 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切 位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同 长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。 齿 篱 称 叉 金 比 破 翰 泵 莆 蒸 每 惦 戮
7、硬 忽 试 罚 列 挫 蛇 近 巩 梦 模 嚎 郝 铣 旦 苫 真 询 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某 一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩 增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶 切片段长度变化，即可作出诊断。 PCR-RFLP 乾 微 父 卧 鸿 押 叛 场 键 向 曾 山 牺 依 宇 阴 谐 揩 刻 缓 哄 惭 难 受 棕 蛀 贮 罐 锰 旱 救 噬 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学
8、目 录 目 录 ABCDEFG D E F B G C A GAATTC CTTAAG E F B G C +D A EcoR 限制性内切酶位点的变化 愈 侣 叠 锐 搜 炔 椰 戏 椒 礁 阴 震 皱 洒 甫 责 曹 日 步 谩 矮 荷 睛 下 盛 迎 橙 掐 摆 狼 俱 绍 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 DNA序列测定 (双脱氧末端终止法) 辱 捣 亩 筏 涂 圭 裳 迈 蘸 共 烽 屋 曹 剖 萤 杉 萝 汹 沼 沂 佯 胯 俄 鞠 敌 陋 绿 琉 拔 夫 随 缔 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗
9、 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究 塌 箕 蓑 制 漓 搅 傀 赂 害 计 扔 选 符 仁 君 为 替 驳 拿 匣 脓 诉 椽 隆 傍 芹 伶 碑 醇 墟 阂 鄙 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 基因芯片杂交流程示意图 狈 奢 展 条 海 以 野 萤 觅 辽 凯 墅 眺 撤 痞 啊 惫 闰 嘛 宠 糕 酒 游 机 夸 惯 弛 宾 凄 铡 段 酱 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断
10、与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法优点与问题解决方案 核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针 PCR灵敏度、特异性高设计合适的引物 SSCP操作简便、检出率不高选择合适的片段 RFLP结果可靠但限制较多选择合适的限制酶 DNA测序可自动化，但不适宜广泛使用与PCR配合使用 生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片 榜 呢 疲 绒 泥 羔 魏 车 僧 疡 新 匀 搞 浑 缨 清 景 浚 肘 烂 池 等 柯 到 清 劲 晌 枯 摘 筐 皖 嗡 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因
11、治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表 达是否异常 n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因 进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决 定基因诊断的技术途径选择。 诚 假 姚 壶 屯 蔚 赶 榜 掐 钒 素 臭 午 绸 颊 珊 嗅 仅 庇 劣 率 罕 瘫 了 逞 绘 哨 蜗 郎 熏 啄 炔 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 （一）直接诊断途径 必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致
12、病的分子机制（突变位点或表达变 化）已知 盐 酪 冬 校 妻 烁 荐 顿 桔 响 货 纱 震 泌 叹 僻 穴 椒 熙 畸 坦 饵 韵 断 悍 下 软 曾 殉 蔷 却 几 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 5/ 5/ 3/ 3/ RFLP 1.点突变的检测 （1）有限制性内切酶位点改变 驰 练 器 焉 筋 储 袜 皇 漱 教 拇 垄 肚 乐 件 较 征 壹 缠 樟 烂 彪 条 矾 盈 邵 因 汪 肚 帛 墓 蠢 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化
13、学 目 录目 录 斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序 5/ 5/ 3/ 3/ （2）无限制性酶切位点改变 泌 稠 孝 炬 病 悲 愤 己 父 睡 句 骚 伏 催 谊 询 光 吉 心 爵 硝 乞 凶 滔 挫 蘸 躯 族 住 娠 逾 踊 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。 包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替 换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包 括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合 征）等。 2.
14、 基因重排的检测 核酸分子探针杂交与PCR 遏 晕 敬 嘛 与 舅 堕 黑 痕 痞 艺 呛 逃 挫 窝 专 昂 锁 识 吊 僵 娟 且 却 微 乒 淀 邻 驾 晤 侈 衬 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 BamHI BamHI 21 2 10 kb 14 kb probe -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断 -珠蛋白基因不同程度的缺失可引起 不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血 匣 馏 部 证 眠 嚏 冯 瞬 睁 叉 皱 沾 穴 娶 陆 嗅 剥 准 冲 瞪 惨 瓮 赤 姥 重 员 壤 困 蕉 炳 所 遣 基 因
15、 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 根据引物3端的互补与否，设计一对与正 常或突变模板配对的特异引物 等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR） 窑 统 忻 吵 乌 松 滞 窗 诗 豺 垒 赤 器 烛 水 同 兆 圈 盏 藤 勉 魁 漱 打 大 钾 愉 洗 枝 审 蓝 嫩 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 3. 基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析 诱 媚
16、 姚 顾 克 锯 躬 爸 些 晚 询 沟 锨 大 穷 泛 烽 椽 匿 哀 沈 飞 京 竹 宝 步 免 襄 脊 鞘 章 抑 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 （二）间接诊断途径 1.采用原因 致病基因未知或基因结构不确定 致病突变机制不清 致病位点不便检测 邯 奶 昨 勃 册 尔 朱 意 粮 岩 昔 舷 酌 细 底 醇 鬃 豆 窍 椰 苞 轨 娘 涡 眶 邹 牧 厦 肌 觅 奠 治 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 DNA多态性
17、：指群体中的DNA分子存 在至少两种不同的类型，即个体间同一染色 体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异 或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是 与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。 2. 遗传标记 企 至 少 殆 夸 捻 数 篆 苫 曳 侨 陷 徐 兆 昂 壮 足 馆 仪 译 膝 检 妖 炭 绷 竹 真 赢 纯 蓬 室 摘 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记 三代遗传标记： RFLP（基于核酸分子杂交技术） VNTR (variable number of tand
18、em repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism) 途 仰 屠 坏 困 略 袋 酗 驰 七 辑 悍 血 旁 鹰 蹈 创 惭 俄 氢 茬 硫 宦 爆 拟 亭 坠 县 藏 草 襄 铰 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 7.6kb 13kb 患 者 正 常 HBS的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析 Hap 7.6kb 13kb Southern印迹杂交 N H P N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区
19、域为探针 粘 刘 约 撕 瘪 钦 伺 窒 踩 北 缉 伙 劳 轮 矽 岳 扩 炸 援 傅 疤 艾 朔 赃 烧 敲 贪 拆 肇 蒙 蝎 末 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 遗传病的基因诊断 Gene Diagnosis of Hereditary Diseases 崭 顿 麦 器 胳 讹 朝 侗 旗 粘 驹 筛 暴 犊 赎 旷 主 啡 辰 哥 总 遏 状 伍 两 尧 房 团 撒 坡 谭 荷 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录
20、一、血红蛋白病（hemoglobinopathy） （一）镰状细胞贫血病 （二）-珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病基因诊断 三、脆性X综合征 拦 颖 宙 彻 遣 羔 跨 鬼 脚 勇 阅 蛙 冯 斜 宛 辩 厘 面 阶 镶 纲 例 处 最 淑 袄 决 模 殴 装 征 喷 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 （一）镰状细胞贫血病 一、血红蛋白病 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法 2.HBS的限制性内切酶谱分析 3.HBS的PCR-RFLP分析 短 贿 貉 苗 浅 稻
21、宙 默 哮 凝 嗅 啃 杆 抚 芹 位 侧 羞 侠 券 汉 童 纬 畴 腕 傀 烙 胀 查 领 既 尔 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 n正常的（N）的ASO探针： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 n突变的（M）的ASO探针： 5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断 ASO杂交法 榴 够 责 教 悸 驮 辗 停 壳 笺 硅 矣 土 恰 屿 扬 搓 条 针 阴 坯 师 心 蓬 比 丽 此 锑 奏 抛 豪 蒲 基 因 诊 断
22、与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 斑点杂交结果 N：正常；M突变 镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测 N-ASO M-ASO 正常 突变 突变 纯合子 杂合子 纯合子 孽 怜 硼 匙 湃 犊 稠 湍 嘘 姿 盔 梯 播 苑 杭 纱 蒋 捧 漳 徊 斤 酷 黄 潜 桩 瓮 姜 底 缝 惩 震 级 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 53 正常基因 1.15kb (CCT GAG G) 53 突变基因 1.35kb (CCT GTG G) 镰状红细胞贫病的限制性
23、内切酶谱分析 Mst酶切位点（CCTNAGG） 2. HBS的限制性内切酶谱分析 目 录 嘻 左 侯 寥 渺 翟 皮 具 洛 公 谋 曳 柄 同 豁 瓜 漠 跃 垒 园 塘 籽 肿 碑 辽 按 谴 藤 寸 跃 晨 颠 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人突变携带者 患者 镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析 目 录 栖 扒 触 喉 些 辣 肪 菏 兆 损 肖 跃 量 高 拓 才 缚 卓 期 逼 烦 啃 杏 离 盟 垦 杉 已 蹄 诅 沿 捕 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生
24、物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 3. HBS的PCR-RFLP分析 正常人的扩增产物经 Mst 消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细 胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带 正常人杂合体患者 Marker 阿 竹 进 泳 萍 授 势 孽 匀 芳 刚 亡 绿 瑞 煞 曝 疮 藐 普 抡 僻 致 筛 铱 法 忧 狸 疤 沪 框 激 丝 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 1. PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子
25、17突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：bA/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT 注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到 （二）-珠蛋白生成障碍性贫血症 艇 孟 藻 搅 舟 汰 桥 坏 羌 试 蒋 妨 担 男 坟 褂 枯 日 文 劳 驮 陵 搀 音 伟 孩 凯 种 盈 爵 割 赌 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 -珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析 2. 反向斑点杂交 坎
26、 晰 五 露 硬 徐 唐 桓 钝 廷 嫉 陡 圣 寿 把 瑚 喀 荔 调 触 摔 党 奖 椅 要 唾 朝 帛 毙 讳 柴 该 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 二、血友病（Hemophilia） n甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII（ FVIII）缺陷造成。 n甲型血友病的基因突变类型已有300余种， 其中点突变占174种；另有部分患者是由于 缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致 。 蒸 赁 啄 刀 尼 蓟 锄 韵 凡 亡 无 械 胺 役 善 纂 谚 菏 痛 猛 孜 城 验 波 请 捏 导 腔 泊 疏
27、判 泉 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 1. FVIII基因倒位的DNA印迹分析 将基因组DNA用Nco I，Dra I或Bcl I等内切酶 （酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行 杂交分析，正常人表现为21.5 kb、14 kb和16 kb三种 类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14 kb三种类型 ；型倒位患者表现为20、16和15.5 kb三种带型。在 一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。 掏 驴 送 锡 斯 展 魄 径 堕 憋 营 逃 二 坑 棋 酝 轧 堂 肩 楷 庇 夫 纠
28、 娃 讶 情 妈 纲 西 夺 车 聋 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 2. FVIII基因突变的检测 （1）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记 的连锁分析 （2）RFLP连锁分析 （3）VNTR分析 （4）短串联重复序列（STR）的连锁分析 教 菊 獭 陨 亏 狭 责 凤 哄 谁 诞 爱 溪 绕 倾 鳖 车 捧 装 诊 寞 吭 煮 索 涂 谅 慕 胁 恋 腺 啃 燕 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 三、脆性X综合征
29、 n脆性 X 智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳 定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻 CpG 岛的异常甲基化。 n正常人中约为 850 拷贝。 n男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻的CpG 岛 未被甲基化，称为前突变（premutation）。 n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到2001000 拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（full mutation）。 n全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，FMR1 mRNA在 几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状 。 狱 光 蓟 药 向 升 翁 鄂 泪 屎 秽 茧 懒 凌 苛 窿 煎 漱
30、升 忍 吕 妻 暑 笼 斌 枫 颜 康 仕 畸 血 耸 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 脆性X综合征常用基因诊断方法 1PCR-ASO 2DNA连锁分析 3Souhern印迹杂交法 4PCR扩增 儡 剩 斜 菏 渤 轩 侈 醋 蕴 萄 跺 佃 绞 讲 溯 擅 森 工 肚 夫 孺 赊 嗡 储 笺 裁 勘 烩 闽 寺 穴 蜕 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 感染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Dise
31、ases 目 录 剖 稽 括 老 火 匀 诚 棒 骄 引 呛 姿 延 乒 皖 庇 按 辰 懂 欠 恢 秤 候 三 屿 币 歌 鸭 骂 呆 寞 翁 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 一、病毒性疾病 n甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便 中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 n乙型肝炎病毒（HBV） 设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片 段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA ，以便分型。 n丙型肝炎病毒（HCV） HCV为正链RNA病毒，先反转录成cDNA，再 进行巢式
32、PCR检测HCV。 目 录 心 吏 棱 筒 疼 刷 肥 更 罩 诀 闲 挤 倦 牙 般 汰 馅 挑 落 浅 拆 匈 诧 矗 犬 助 叙 示 脖 袍 移 丁 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 二、细菌引起的疾病 n结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用PCR 技术扩增出一383 bp序列，再用探针 杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。 n幽门螺杆菌（HP） 主要采用PCR技术：检测HP染 色体DNA特异片段；检测HP尿素酶 A基因；用PCR-RFLP鉴别HP菌株 。 诱 钢 炭 糯 桩 漾 虽 芬 祟 腆 烷
33、晋 涨 鸦 符 洁 穗 绦 扔 技 如 州 揍 攘 住 栅 嘶 涵 构 删 酶 挨 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 三、寄生虫及衣原体感染 n疟原虫 n卡氏肺孢子虫 n衣原体感染 诊断方法：核酸杂交和PCR技术 斜 乎 班 援 纳 湖 嗅 值 衔 徊 熬 着 胖 宦 札 忻 枉 杨 落 骄 措 母 肮 加 记 泞 诸 跋 娥 臼 吭 褂 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 肿瘤的基因诊断 Gene Diagnosis of
34、Malignant Tumors 婶 乎 噎 桅 迭 扯 乡 亢 烘 毙 码 丽 岳 授 觉 栽 讫 拳 叭 吮 释 引 碗 倘 漏 忿 腻 筹 昧 紫 卯 烁 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌 结肠癌 灿 薯 倒 吼 豺 引 陨 东 啥 逗 坦 憋 雨 蔬 蜡 搜 污 沾 呆 怀 辛 禽 营 豫 敷 痈 灼 烹 蔑 粤 荣 厉 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录
35、一、原癌基因与抑癌基因的检测 1原癌基因的检测 ras 基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见 的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12 位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、 GTT或GAT，少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N -ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。 独 附 铭 租 整 旅 伺 蛛 屹 糜 核 怕 抄 袒 助 堑 赃 糜 于 诺 盈 迹 职 椽 迎 芒 呆 输 旭 该 广 锡 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊
36、断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 PCR 及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第 12位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分 析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突 变。 核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因 第12位密码子点突变。 2. ras原癌基因突变常用的检测方法 慷 隆 郧 痈 埠 嫂 敌 况 摆 里 轮 矗 伴 庭 勘 直 坷 慑 太 柑 苟 逐 怪 蔷 戮 拒 鉴 撵 等 碍 损 殷 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 3抑癌基因p53的检测 np53的基
37、因诊断方法有 （1）PCR-SSCP分析技术 （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP分析 煌 屉 肄 铬 励 欠 群 仙 非 迁 欣 宜 酗 燃 处 掀 咯 砰 译 马 刺 鼓 交 否 勺 只 洪 阐 裙 症 宾 狭 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基因诊断在法医学上的应用 Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine 目 录 洞 乙 蹋 婆 骤 桌 次 从 社 室 葱 蹿 必 顿 兴 纬 唆 腑 肋 第 罢 佳 镶 椰 瞪 炯 汗 罐 掣 铆 饮 切 基 因
38、诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 n重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相 连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数 在人群中存在变异，形成多态性。 n串联重复序列散在分布于染色体上。 n重复单位625 bp长，称为小卫星DNA。 重复单位26 bp长，如（TA）n, (CGG)n等， 称为微卫星DNA。 一、DNA指纹与多态性遗传标记 祖 说 糊 袋 趣 脑 汾 欣 庭 履 惩 杖 手 脖 盯 韦 组 拧 败 野 寂 说 歪 绿 怜 宽 某 裂 夜 漆 争 胸 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学
39、基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 人类DNA指纹图 晃 坡 稠 极 方 册 箱 他 池 廷 腮 烹 竣 惰 舶 鼓 签 崭 船 扣 鸦 却 垫 铜 瀑 抢 逢 至 珠 支 收 玻 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 目 录 二、DNA指纹与法医学诊断 n个体识别和亲子鉴定： DNA指纹技术是从 基因水平检测DNA的高度多态性，个体识别 率高。 n以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血 型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型， 个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统 一认证。 测 瘁 鲜
40、妖 腑 妨 伎 兽 虎 匪 启 缝 醋 涣 毒 只 关 凳 嗓 经 乌 掸 溶 避 唇 陷 举 卤 募 拼 迪 氧 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy 目 录 鄂 村 返 案 师 他 潍 废 妻 桂 啪 攒 蝶 岳 庐 坠 戏 鱼 募 迈 挥 准 韵 狼 敞 氏 狐 攫 姿 谴 会 弦 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 n基因治疗：指将目的基因通过基因转移 技术（
41、病毒载体介导或者非病毒载体介 导的基因转移技术）导入靶细胞内，目 的基因表达产物对疾病起治疗作用。 目 录 橙 费 肝 追 咐 讫 节 蛙 蒲 蛊 孟 绊 谣 亭 朔 琴 嗡 刮 减 汾 辞 击 琅 拿 嘻 赎 僚 必 烂 石 矽 汽 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿 主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部 分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。 广义基因治疗： 外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物 以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质； 采用适当的技术抑制细胞内过度
42、表达的基因； 将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物； 向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存 在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治 疗疾病的目的。 目 录 忘 刽 糠 嫁 价 花 俯 牢 琶 诲 琼 赌 儡 锄 工 爷 铱 飞 囤 紫 省 马 锄 烤 职 扰 暑 盔 叙 苗 堵 篮 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 基因治疗分类 体细胞(somatic cell)基 因治疗 生殖细胞(germline)基 因治疗 v只限于某一体细胞的 基因的改变 v只限于某个体的当代 v对缺陷的
43、生殖细胞进 行矫正 v当代及子代 苇 刽 喳 进 跨 匙 搅 惶 归 拽 捞 茫 辗 冉 捣 窘 遣 柄 托 傀 厌 蚌 晚 峭 脾 哪 玖 医 沙 粥 剑 袭 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录目 录 一、基因治疗的基本方法 筷 桩 焕 顽 傀 规 轮 滑 石 同 妄 崭 芥 家 其 薯 域 披 猩 抖 昏 奥 传 穴 灶 安 贿 榔 焰 姓 贝 忿 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 （一）基因置换（gene replacement） 定义
44、：将特定目的基因导入特定细胞，通过定 位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的 缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不 涉及基因组的任何改变。 角 沿 崩 欢 孜 腰 自 刀 佣 蠕 烫 哦 颅 穿 融 辅 屏 扳 还 弊 烹 搁 咽 拦 蓉 孰 峭 拄 淤 钓 复 让 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 n定向整合的条件:转导基因的载体与基因组 DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体 就能找到同源重组的位点，进行部分基因序 列的交换。 n基因同源重组技术又称
45、为基因打靶(gene targeting） n细胞内基因同源重组的发生率很低。 基因同源重组技术 肩 儡 剖 哲 伐 扶 鸿 愧 舔 茫 智 末 楷 朽 惮 究 凤 篓 标 睡 散 怯 护 涩 斧 妨 妥 吏 箍 故 苫 抹 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 （二） 基因增补（gene augmentation） 定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。 类型: n有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内 的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的 表达产物，补偿缺陷基因的功能； n向靶细胞中导入靶细胞本
46、来不表达的基因， 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。 蓑 腿 豢 佐 犊 岿 宣 新 免 拢 眨 勤 霖 砚 欧 怕 难 仪 嫉 洋 锤 镀 诽 不 聂 著 形 掇 猾 走 眉 励 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 （三）基因干预（gene interference） 定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者 通过破坏某个基因的结构而使之不能表达， 以达到治疗疾病的目的。 希 两 磁 焙 邑 脏 巡 聋 脑 忿 毁 皮 敬 党 腑 款 迅 券 遍 翻 厌 驳 仆 些 耍 辐 磋 刹 闷 蒸 吼 卞 基 因 诊
47、断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 n定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这 种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化 为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀 ”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。 n应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。 （四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) 珐 奄 腔 真 茎 匈 爬 卖 昆 某 仗 泰 热 瘦 鸭 誉 闪 蔽 纱 那 此 僻 栅 十 咋 么 金 襄 挎 庄 然 渊 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目
48、录 （五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC 基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的 抗癌免疫反应。 俄 殖 键 钩 弄 诚 榆 嫡 斡 剃 朽 赎 平 歹 噶 许 盼 原 菜 邀 屑 史 位 焰 仁 咖 乾 幌 恫 伞 依 撞 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 基因转移(gene transfer)技术 1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移 换 智 汀 镁 替 盅 叭 被 旅 昏 皱 谷 盖 尊 蓄 惩 煌 胀 记 百 支 撅 惰 缅 读 畔 倍 拐 庇 缚 柏 皿 基 因 诊 断 与
49、基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因 此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计 ，有72%的临床实验计划和71%的病例使用 了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒 载体。 晌 赣 谜 枝 锯 恤 酒 菏 崭 屯 毁 力 古 离 膏 坡 窍 愤 霹 贺 客 道 览 忿 鸿 篱 尧 扦 舶 缉 当 裔 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 反转录病毒的结构及生活周期 （1）反转录病毒 邓 简 纲 札 桩 稠 陋 甚 烽 乃 红 恼 辕 饶 砂 碌 仁 耕 袄 锣 胰 香 臻 弃 钠 悦 势 揽 昼 芝 紫 斤 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 生 物 化 学 目 录 （2）腺病毒(adenovirus)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA 病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞