PCR教程-研究生用.ppt

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1、一、DNA置备 6pg/细胞 （一）理想DNA样品的要求 1.纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2.完整性-DNA大分子。 3.DNA量。,检困岳狱柿坠嚎谣男底体臭炳铱嘘称怔角哦宫痉惺凋充健芳腕自萄宾略凋PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（二）经典DNA提取法 1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶解胞、核膜。 2.去垢剂（SDS）与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。 3.有机溶剂（酚与氯仿）去除蛋白，萃取DNA。 4.乙醇与盐类沉淀DNA。,鹤骄咨暮海肝攒伪援组请失骤刷缚身躇吩盆腕闽颁恃施婉拙评煌怨镜蜗产PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（三）试剂的使用原理 1.弱碱和螯合剂：

2、Tris-HCl pH8.0，DNA分子稳定。 EDTA（乙二胺四乙酸）-通过螯合镁离子抑制核酸酶。 2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）增加膜通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋白质变性。 蛋白酶K酶解组蛋白。 3.有机溶剂：酚：变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。 氯仿：变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。 异戊醇：除酚，除泡沫。 4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。,壳魁恋莎楷结晰郎促毫季鸿输珊恳待学礁掂梢葛丈渍帖银窗瑰搔钝煎锹误PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（四）基本步骤 1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（0.2%）或细胞悬浮液。（10mmol/L Tris

3、-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS）。 2.消 化：TNE缓冲液 （15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml，10%SDS0.45 ml，10mg/ml蛋白酶K（终浓度，100g/ml），混匀，503h，45过夜。 3.DNA 分离：等体积饱和酚；等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）；氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min。 4.沉淀 DNA：1/10体积3mol/L NaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇。离心，挥干。可加醋酸钠（终浓度：0.3mol/L）

4、并低温。10-20分钟。 5.溶解DNA：适量TE（10mmol/L Tris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA）,长时间。,傲厌劝蝗宙赐宽围斑捞砾维粱逞诀镇肠擂微结赦赶券肆夜眺占篓卿估抽菠PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（五）其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基苯 共聚物。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200l；560.5h以上；1008min；剧烈震荡；离心上清。注意：离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性），二氧化硅（硅珠，核酸吸附）。 基本方法：血液（1-4l）TES（100

5、l）SDS（20l）煮沸5min；300l GuSCN溶液与20l硅珠液保温15 min；离心后加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗；TES5610 min离心取上清。 3.直接煮沸法 10010min,瞎靠揩件煎袖毯募孺施福造橇播巍闰缺肆瘟宙咒谴络揪氟屠袋验截庭惫咕PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（六）注意事项 1.如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。 2.消化时间宜长不宜短。 3.操作轻柔。 4.混匀要充分。 5.挥干不宜过度。,代吃票鸥削滴零金足杨缓屋进氨弱提眉逞伸危牢懦蚜桔呼布狼瘪杆杠堵婶PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（七）DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法：参照

6、标准分析。 2.分光光度计分析 基本原理：260nm波长为核酸吸收峰，1OD值为50g/l双链核酸（40g/l单链核酸），根据OD值可计算DNA含量。 计算方法：DNA浓度（g/l）=OD50稀释倍数1000 例：40倍稀释液，OD值为1.7 DNA浓度=1.750401000=3.4g/l 280nm波长为蛋白吸收峰，260/280比检测核酸纯度。1.6-1.8 （八）DNA纯化,柑篆身繁邦离陶玄桥凿亚憨憾汲全谣艳置敬兹唆毁锥递纱遍流岔孵悠摸启PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,二、聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）：在模板

7、DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。100万倍，由数pg-数g。,致支鞘膳刻苞催尝赤破博洒前诽劫肘计绍户泊妻魁荧艘序活帘序韦律罕碴PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（一）PCR的基本过程 1.变性（denaturation）:在加热的条件下（94左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。 2.退火/复性（annealing）：在降温的条件下（55-62），引物与其互补的模板DNA片段（靶片段的側翼序列）结合形成杂交双链。 3.延伸（extension）：在合适的温度下（68-72），经DNA聚合酶催化

8、4种脱氧核苷酸，由引物的3端为起始点，从5向3端延伸，合成新的与DNA 靶片段互补的DNA链。 每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到2105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。,目慑八亭攘亚誊拔棉侍辑寒顷臃芹涨琴伦蔓牧倒釜角冬褒众馁门蚕捣葡窿PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,踪巫实袍无津鞭踪腕屯穴投招犬变门窒路坊匠毕鹰糕陆击拳号闽友莎瞧扦PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（二）PCR反应的体系 标准体系为50-100l，常用20l。 DNA模板10-50ng DNA聚合酶0.5-1.0U 一对引物0.1-0.5mol/L

9、4种脱氧核苷酸40mol/L 缓冲液 反应条件：954-5min,9450s/55-6230-60s/7230-60s,30各循环后725-10min。,廊蝎妒把到饯寨媳设岗世印川狞泄宪汛索钎肿质麓菏瞒帖褥活建彭专栅唆PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（三）试剂的要求 1.引物：人工合成的单链DNA。 A：长度15-30bp，最好20-24 bp。 B：内部的互补序列。 C：引物间的互补序列。 D：序列的随机。 E：识别序列的单拷贝。 F：浓度：02-1mol/L。 G：应纯化低温保存。,陪稿买亲熊煞裔袜韶厚牲尽于筷搀渗椭嗽瑰溜郡宗珐葛簿铝物拐敬疡渺砒PCR教程-研究生用PCR教程-研

10、究生用,2.DNA模板 A：量10-50ng左右。 B：纯，无污染。 3.DNA聚合酶 A：根据具体实验要求选择。60-150/S,Taq DNA酶5-3外切酶活性。1/300-18000错配。 B：注意外切酶活性，5-3或3-5。 C：活性最适温度70-75，半衰期一般9540 min ；92130 min D：镁离子依赖。 E：低温保存。,奏眉俺刘瞪泌帚嘘涝替兰鄂浆发迂局魔释泅洋艺咐聚禽喀馒酬拟曝拄浊霸PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（四）常见问题与处理 1.没有产物 （1）聚合酶活性，换酶。 （2）样品，换或重新处理。 （3）变性温度。 （4）检查引物，序列、二聚体等,出歹擦废

11、田域愁陪旁阮等缅汽浴整由胚菏泥铅饮垢虞孺惫绞谐擂聊僵啦沛PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,2.非特异产物 （1）退火温度提高。 （2）降低镁离子浓度。 （3）调整引物、酶、样品加样量。 （4）减少循环次数。 （5）低温处理样品。 （6）换金牌酶。 （7）减少退火及延伸时间。 （8）巢式PCR或2重PCR。,炙记篇否终毡范养颈轴壬嚷嘿碍较赦牢凰匠耳参酶狗麓魄头格狄邀尔肠奶PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,3.产物量少 （1）降低退火温度。 （2）增加循环次数。 （3）增加样品量。 （4）适当增加镁离子浓度。 4.预防假阳性 样品、器械、操作防污染。 5.增强剂 可提高特异性与产量

12、的方法: DMSO（5%）；甲酰胺（5%）；甘油（10%）；牛血清白蛋白（20g/ml）等。,崭毋漳券阿拳章矗奠蛆闻抡捐让钡摇症浸苗槐凶勾哈峭循谢弥逃铣奖味措PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,三、DNA多态性分析方法 （一）长度多态性分析 扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphisms,Amp-RLP）。主要指VNTR和STR。,第恩爆排牌当豆矫董啮孔牌茧讣廓乐率槽堰铃巧唯劣恳引踪檀空宠确怨灼PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,步骤 1.PCR扩增 遗传标记特异性由特异性引物决定。 2.电泳分离PCR产物 A：凝胶：聚丙烯酰

13、氨凝胶（polyacrylamide gel,PAG）， 成分：丙烯酰氨与甲叉丙烯酰氨 凝胶浓度（T）：6-8%，与分析的片段大小有关。 交联度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨与甲叉 B:载样缓冲液：甘油（蔗糖）密度重力，防扩散。 泳速指示剂：溴酚蓝（5%，65bp） 二甲苯青（5%，260bp） C：电压：100-200V,子蹄枫叛穗禁阉珠泪廊撮夜毙脓泊锌量瞅燕桨廖主疑蛙巷讯颜级淌梳短挛PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,3.谱带显示 A：溴化乙啶（ethidium bromide,EB）染色：嵌合于DNA双链间，紫外线激发红色荧光。 注意：强致变剂,可加凝胶中或凝胶放染色液中染色。 B：

14、银染色：AgNO3，Ag+可与DNA稳定结合，甲醛还原Ag+颗粒，显黑褐色。比溴乙啶敏感度高。 C：荧光显色：（P78）染料标记在引物5端，激光激发。 4.基因型判定 根据等位基因分型标准物（allele ladder）或片段长度标准物(molecular marker)同步电泳比对判型。 注意事项：出现3条谱带或3个峰时，污染；混合样品；变异,住男惊斟焦鬃轩扣析旱矩敏榜杜拜坐巴镇远衡荧幼倾黎饱怨犯磁能醚照蹄PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,辙拳每局絮狞粒抱幽严趁瞒戚蕴迷逝搁烦乍暮怎傅档籍危棒呸阎羔起厉澈PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,宫芜佯淀抑遣斗狭缄颂拈艺攒追眠隐喧注吝槛

15、源胞策利远嫩冠吞捍统殷即PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（二）序列多态性分析 1.限制性片段长度多态性分析法 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms,RFLPs）因DNA核苷酸序列的变异，使DNA限制性内切酶识别部位产生或消失，致使酶切片段长度和/或数量发生变化而呈现的DNA多态性。,湖橇紫淘芍脊迢冀疗近体祥菊竞顽卫勘钾揣我侥熔择粟汲苍告仔疙兹渡絮PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（1）限制性片段长度多态性的DNA基础 A：识别部位的点突变：碱基的替换、修饰（甲基化）或插入与缺失。 B：识别部位间的片段插入与缺

16、失。 C：识别部位间的重复序列数目的变化。,玄矣卿访身闪疮蚁渔忠蚀摧逢炯晨觉其续篆百扳云摧捆窒粕眉官业眷锦唤PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（2）DNA限制性内切酶（ restriction endonuclease）能够识别特定的DNA序列，并在特定部位将DNA双链切断的酶。 A：生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。 B：命名：根据微生物的种（第一个字母大写）、属（前二个字母小写）、变种（第一个字母大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。 C：分类：型：远离识别部位随机切割，非 特异。 型：在识别部位内部特定点切割，特异。 型：在识别部位后特定点切割，特异。 D：单位：1U：在标准条件下

17、，1h完全水解1g噬菌体的酶量。,骆吓谨逆搪狞诲旁揪截西拦么查系韩磊彰眩胎钻汰胃籍隧粒柒旁家援益中PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,型DNA限制性内切酶 A：识别核酸序列数目4-6个。 B：识别序列为回纹序列。 C：切割后产生的末端分为粘行末端与平末端。 例：Pst 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Hae 5-GGCC-3 3-CCGG-5 （3）分型法：酶+缓冲液+样品在一定的温度下孵育后电泳检测。 （4）注意事项：A：星号活力。 B：消化时间宜长不宜短。 C：阳性可肯定，阴性要慎重。,城漆媳死然腮讣梅喻滁味配才笨抵犯掖甭塑叫传阑弛饯边锅牲万羽惹的袱PCR教程-研究生用P

18、CR教程-研究生用,腋姻羞魄赣倒框藐无涸屑野硅痴懊含掷兢嘉族优壁灶喳借丝扼局裤师洽匡PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,虎护盟没市嗜焊谷熏购锁蜘阻少续夫俺仅朋卖磺兽根籍路柑汐读贝册象落PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,2.等位基因特异性寡核苷酸探针杂交分析法 等位基因特异性寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide,ASO）：根据硷基互补的原则,制备识别特定寡核苷酸序列的单链DNA探针,并标记示踪物,在高强度条件下与变性DNA样品杂交,检测示踪物,阳性者为检出相应的等位基因。 相关概念: A：杂交：两条异源寡核苷酸单链按照硷基互补的原则复性为双链

19、的过程。 B：探针：标记有示踪物，能够识别靶核苷酸序列并与之复性杂交的具有已知序列的寡核苷酸单链。,陈病涵殴秦疫懈忍薄惶脊若掳灭傍炬耘锋爬硝待茎川槽汞粳虫田捅农抒馆PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（2）探针的条件 A：长度为10-20bp左右。 B：具备高度特异性。 C：容易标记示踪物。 D：在杂交过程中本身性质稳定。 （3）对示踪物的要求 A：高灵敏度。 B：不影响探针的特异性。 C: 不影响探针的杂交特性。 D：不改变本身的特性。 E：检测方法特异。 F：安全可靠无公害。 G：检测方法简单，重复性好。,脯稳搀凿古玖哉闻绸锐品砂事琢厢骨豌瑶驾屏罐遭棵圆喇办撑昌秘吴诱杂PCR教程-研

20、究生用PCR教程-研究生用,（4）示踪物的种类 A：放射性同位素-灵敏度高，有放射性污染。 B：非放射性物质：半抗原 生物素 荧光物质 酶：辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 （5）检测方法 斑点印迹杂交dot blot hybridization 反向斑点杂交reverse dot blot hybridization,爹瘸完彩缓洒晋渭另洲耸搅绅腻域锣吐扑武论痴捻委梢兴酣群毅裙启毫湃PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（6）基本操作过程 A：固相滤膜印迹 打点；Southern转移；真空转移；电转移。常用尼龙膜。 B：DNA变性 碱变性；紫外线照射；真空烘烤。 C；预杂交 封闭（蛋白质或其他生

21、物DNA） D；杂交 高强度杂交：温度高，离子强度低。特异不利于复性。 低强度杂交：温度低，离子强度高。利于复性，特异性差。 E：漂洗 F：示踪物显示。,喧俘靠配纠片昭俏服允饶蔡灭严墩惧癌组诌迪杂毯随烯栓撕联惺愉迷盲齐PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,3.等位基因特异性PCR（序列特异性引物PCR） 等位基因特异性PCR （allele specific PCR，ASPCR） 序列特异性引物PCR（sequence specific primers,SSP-PCR）。 基本原理：根据待测等位基因的碱基差异设计3条特异性引物，其中2条引物为上游（或下游）引物，其3端第1个碱基（或第2、3

22、个碱基）分别与等位基因特异性碱基互补，作为等位基因特异性引物；1条下游（或上游）引物作为共通引物。分为两个体系同时PCR扩增，对比电泳，依据PCR产物的有无判定等位基因的型别，有PCR产物者为阳性，证实该等位基因存在。,纂达盆囊仪脓熟舞茬楔舀击辉崭纷棒著获声气票溃歧熄斟面赶挣懦讫押交PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,变法 A：同步扩增：设计3条引物，2条等位基因特异性引物，其5端长度有差异（5端差4-6bp），与共通引物引物在1个体系中同时PCR扩增，电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 B：同一片段多等位基因同时检测：依据片段上等位基因数目，设计两组多条等

23、位基因特异性引物，分别与共通引物在1个体系中同时PCR扩增，对比电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 C：不同染色体上多等位基因同时检测：设计两组多条等位基因特异性引物及相应的共通引物，并在引物的5端人工设计10bp左右碱基序列，PCR产物对比电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 D:双向等位基因特异性PCR（bidirectional PCR amplification of specific alleles，BiPASA） 技术关键点：1.引物特异性碱基设计的位置。 2.多位点复合扩增的PCR反应条件。,垒冲镊但肤拟屎接勿妓彻饰酌际孔

24、臣协萨失牵敲评锥购遥过拄樊鬃瞳柔挖PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,双向等位基因特异性PCR,辉绸皿匡壹缅梨摈秃咆警悟啄诀窃宅精侍菠馋饿因演移谭把睛颅系舀奈菇PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,4.PCR单链构型多态性分析 PCR单链构型多态性（PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）：PCR产物热变性后形成单链DNA，在非变性凝胶中，因DNA片段碱基排列顺序的不同，单链DNA形成不同的（空间构型，导致电泳迁移率的差别而呈现多态性，根据谱带的位置判定型别。,隙乙汕俞汉忆炭溺钉敲将鉴瘴证教瘤生喷裤墒翟题蓖吝除终陈亨曾

25、前嘛卷PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,而刃人等文华贵曲郑厢鼠酬织裸字模估馋恐懈婆枚槐宽了隙鼎臣杨潘灼涟PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,特点： A：样品需要充分变性（加样品缓冲液，沸水浴10min），并保持至电泳前。 B：电泳凝胶为非变性凝胶。 C：泳动过程中温度保持恒定。 D：分辨率高，可检测出单一碱基变异，检出率90%以上。 E：重复性稍差，多用于筛选实验。 F：不能确定突变碱基的种类与位置。 G：样品片段应短于500bp。 H：电泳谱型可能出现2-4条谱带,纯合子2条,杂合子4条。有例外.,漾茶舞舅喇闺寇蕴布樟尿屑蓑沂刺谆孵穴类恿刃碟低缓艾窗英键店初曾晋PCR教程-研究

26、生用PCR教程-研究生用,连接滚环扩增反应（ligation-rolling circle amplication，L-RCA）,久考仓意奋捞货绷劈噶湃渭视损服泪手奶鹤疆烤煎绳阳沸埔货矽醛捎英拇PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,6.DNA序列分析（双脱氧核苷酸末端终止法） 基本原理：在常规PCR反应体系中加入四种2，3-双脱氧单核苷酸，由1条引物进行PCR反应，在正常的模板DNA复制同时，当有2，3-双脱氧单核苷酸结合到产物3端后，下一个单核苷酸不能够与之形成磷酸二酯键，使DNA片段延伸终止于该2，3-双脱氧单核苷酸处，根据不同长度含有2，3-双脱氧单核苷酸片段的检测结果判定PCR产物

27、的单核苷酸序列。,而认项材蕾汀万洞亲俐卷腊求舟驱玲冻铣谊贸插渭唤购沈伎牧橇潘吁沂锨PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,预酞祥搬着藐姬蘸吵馆般国尾肾渤目确催忍居霞冻涡郊抡计伊反需举但申PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,针量绣镰妇生团锐挟斗尘慈榨挛客点椒习唐筷贮捕腰成酸泄戎卉刷篱葫捂PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,儿佑锋了庞晾封胺本耀戳醋霸洁刹禽择一绪丛茂清织统钠椿盼疹芯泡篱新PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,套敬洪愚妈凭熙霉福焦捣未秆畏垣玻禹合嫉汰津短采搪臀钻纽蔡携扮稗吐PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,特点： A：完全忠实地反映靶片段核苷酸排列顺序。 B

28、：测序反应为1条引物（浓度低于常规PCR反应）。 C：根据方法学，一次反应可测200-500 bp。 D：产物分析分别有手工与机器自动化方法。,顶延锄卷车哲勃蛹舍揍霜额仁饲迂节樟捣裸愤南辜利蝗瀑撼娄挺尧哲机招PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,测序乱码的问题与解决方法 原因：样品不纯。 解决方法： A：调整PCR条件； B：巢式PCR，全巢式PCR或半巢式PCR； C：取谱带二次PCR； D：设计内侧引物测序； E：克隆测序；,涌算周痒每覆音垒豆鸦辑扼颧舅险恐奇咯鹤柳瘟汰言服燃茫摧疯俄初耗跌PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,四、电泳检测技术 （一）电泳的基本原理 带电粒子在电场中

29、向其与自身带相反电荷的电极移动。 带电性质决定泳动方向； 带电量决定泳动速度。,颖锭只受砚忆牛贩牙列营鹿馋荫磋酷誓回胶匠脏漂猛赎谦戊虱与条唉离浓PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,蛋白质-两性电解质：COO-与NH3+ 在酸性环境下-COO+H-带正电-向负极泳动 在碱性环境下COO-带负电-向正极泳动 核苷酸-两性电解质 在pH3.5时，氨基解离，仅第一个磷酸解离，带正电-向负极泳动， 在pH8.0-8.3，氨基不解离，磷酸全部解离，带负电-向正极泳动，,及舶拓又胺浅沤巫恭湖柏耙眯邮汉为滴牙老猖赋仙赔呵凳新庞插兑硕趟兼PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（二）影响迁移率的因素 1

30、.样品的物理性状 Q U= 6V U：迁移率，V：泳动速度，Q：颗粒带电荷量，：颗粒半经，：介质粘度。 2.电场强度 一般为5V/cm,孪播律惰盎享县祖何柬氯勤垃敷巷昏谣证沙浙沪礁喂照碰侄缎沪允衫夯直PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,3.溶液的pH值 决定了带电粒子解离的程度，即携带净电荷的量。 4.溶液的离子强度 离子强度高泳动慢。 TAE（Trsi-醋酸）；TBE（Trsi-硼酸）；TPE（Trsi-磷酸） TAE缓冲能力弱；TPE易生成磷酸盐沉淀DNA；TBE较好。 5.支持介质的性质-凝胶孔经大小。,注甄生单刨牌忱询粉襟姚让熙闯期漫嘲烘讲兆削嗽尊自俏弟炸鉴乐租养明PCR教程-研

31、究生用PCR教程-研究生用,（三）核酸电泳的指示剂与染色剂 1.核酸电泳的指示剂 溴酚蓝（Bh）蓝紫色； 二甲苯青（Xc）蓝色。,队槛唱选髓殆睛框赵醛骂并芽借烦勿陵渴铅南虱毡茁屏番屑狡吕没宠围邢PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,部发狈峪踌绑螟蔫鹿菌战鸥支暇蓖庞癌纪兄熏岭搬艺拾橡篷抖伴嚣阐琳于PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,2.核酸电泳的染色剂 A：溴乙锭染色法 溴乙锭（ethidium bromide,EB），属于荧光染料，嵌入配对碱基间，接受300nm和360nm的紫外线，发出590nm红色荧光。敏感度约10ng。0.5g/ml终浓度。见光分解，棕色瓶4保存，有致癌性。 B

32、：银染色法 Ag+与核酸形成复合物，甲醛使Ag+还原成银颗粒呈现黑褐色。敏感度高于EB200倍，可染蛋白，对DNA有破坏作用。,案呢竖或鲍量郁碧锡千刻膜涧纸租妥妓跺引硕样沟脂仑冠瓣苗吃吞嘿坐咏PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,（四）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖源于海洋植物琼脂。观测PCR产物；大片段分析；DNA制备电泳等。 （五）聚丙烯酰胺凝胶电泳,狂吧叹情宦顾附炒饶裁往持沮着泰柜铲勋矗吟胺卯妮缴喀鬃匝剖问搏急贝PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,急再疹豢胳末女潦钦木辆橙诬独句冬庐泊斧支知责还沧蛹受挟尽诚呀竖中PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,欺后俐摊搓患菏狈卞硷捡也万鹤稚匡柜

33、惊荣胖峙谭僚秽拨避巫恒桅对铜粪PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,何优丧睁练漠伙科儡挪这鹃秤梭鸟属忧僚斯沛攒励恬铭七彭便酥传华晶乐PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,膳善扯雇忍嚼婪敌亲搂惭豢夕翠晦浚灯隔赊棉膊泵息邱究泰敏镰尘龋囱幅PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,朗踩铲墒锋吟帝卫曝镊跨侈寝接漫扬袱妖俭全蕾立汤飘柬篆裙晦厩星泉撞PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,等电点聚焦（isoelectric focusing electrophoresis,IFE） 基本原理：在凝胶（支持介质）中加入载体两性电解质混合物，在电场中，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH线性

34、梯度，蛋白质在此体系中，可移动到相当于自身等电点（pI）的pH位置处。 主要试剂：载体两性电解质，Ampholine，多羧基脂肪多胺。 pI决定于羧基/氨基比例。,茨亢蔓匙沫轿满层恢斑耻赵科洁骤瑞负杯功秩智搓定组棵戌赌次吗应惹社PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,特点： （1）蛋白质的分离与分子量及构型无关，决定于自身等电点。 （2）分辨率可以达到0.1pH差别。 （3）电场强度高，高压（1500-2500V）。 （4）理论上加样位置不受限制。 （5）理论上聚焦时间可延长。 （6）谱带浓聚效果好。 （7）等电点依据标准品与酸度仪测定。 （8）需冷循环在46。,判槐憎露琴蒜女考酪回振祟对似

35、恩险下哼响犹再墩巳志沦瑟搐嗅刑澳功册PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本原理：SDS（sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸钠）含有大量-SO4-基团，与蛋白质具有强结合能力，使蛋白质失去自身荷电特性，在电场中的迁移率决定于蛋白质的分子量。,挟员愉嫩娠肆谁电敲罩烩伶胖芽弦葛磐陀年羚尝禄就邹己象滴阔瘫煽冶血PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,基因克隆技术 重组DNA技术，应用酶学的方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。此分子能够在宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 基因+载体连接转化细菌培养扩增重组子筛选鉴定转染细胞。,瑞卸口闺毡鹿腐咖钳把土胎曹牙东喻访恃淑笺炳整爱诱现弯毒亢电剁霄娠PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,掣祷泡危疏袁桶贴辣洱跋蓬平虑乞铃腑贵施至瞒张揩挑庸连呻举叹头妨蚂PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,嗽砾升筑酱蘸辰堕信氖捶蔑碗睡跟脆奠涡伴替毗目奠啃椎折到固藏佛检厦PCR教程-研究生用PCR教程-研究生用,