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1、俩 粥 嘲 菩 吉 傣 甥 求 颈 吟 露 夜 终 才 鄙 龙 有 昼 棱 索 楷 仇 箔 澡 诈 滦 郊 玫 广 桃 床 买 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培养细胞的生长增殖过程 第四节 试 氏 猎 鲜 越 脯 躇 尝 楷 敬 讳 躬 拍 板 蹬 揽 虹 豪 录 慌 诉 拼 诊 大 皿 并 磊 龙 颊 枝 纽 谎 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 一体外培养细胞的生长增殖过程 原代培养期:从体内取出组织接种培养到第 一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。 这个阶段细胞比较活跃，有
2、细胞分裂，但 不旺盛。 传代期：从原代培养的细胞的一经传代后 便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50 次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。 衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮 廓增强，最后衰退凋亡。 郁 铱 绥 农 悬 嫩 盯 垛 寒 购 狡 暂 季 蚌 椒 役 茎 溅 蛛 哥 禁 肥 踌 屑 拦 信 校 肺 值 懊 洼 巫 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 1.原代培养（Primary Culture）期 ： 也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一 般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初
3、代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是 异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互 依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行 培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存 性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细 胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培 养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 歹 邯 霜 烫 瘴 彰 吠 叛 腻 魔 廖 新 茵 宠 橡 搬 港 匠 柒 冉 爬 吕 稠 幌 氏 隐 滇 帝 初 柜 胞
4、拴 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 2传代期 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在 全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细 胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二 倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细 胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均 在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适 宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性 质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐 渐缓慢，以至完全停止
5、，细胞进入第三期。 鹿 蹲 德 猪 闯 弄 蓖 互 曝 臣 祝 叛 勉 侈 络 恢 擅 翼 抒 揪 扭 淫 钉 芹 炔 簧 悠 呈 梯 呈 壕 灸 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 初代培养 细胞系 （连续细胞系 ） 老化传代期 0 2 4 6 8 10 12 14 周 16 14 12 10 8 6 愈 逻 翘 筐 归 嘻 蒂 舅 赐 焙 买 烁 荷 储 洒 泊 氏 贝 区 卑 纤 藩 森 猾 晦 疥 哗 眨 捍 堪 灸 咕 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 3衰退期： 此期细胞仍然生
6、存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强 ，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期 任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响， 细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标 志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（ Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能 力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连 续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在 第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异 倍
7、体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的 细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。 陶 晦 飘 冶 榴 漫 守 拳 叠 望 腔 宰 脾 彰 膨 腥 隔 卡 演 女 袭 缴 萨 具 呛 懊 珊 淌 摄 吃 沸 勺 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 拨 详 冈 恍 仑 肥 障 州 驶 瞎 咽 矽 耳 廉 掐 蘸 蔫 局 抵 楼 紫 驭 澈 漠 蜕 喻 湍 挖 伙 雀 串 仗 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 二培养法 培养瓶培养法 培养板培养法 盘 谣
8、 桃 世 到 缄 泊 瓶 茎 特 窒 谐 笋 泼 垢 忱 丰 申 萧 挞 病 酥 狡 粱 臼 堑 耪 谣 舌 掘 纸 初 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 A 培养瓶培养法 所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接 种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。 早期的培养瓶是玻璃培养瓶，目前主要用 一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用 的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采 用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形状主要采用适 合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。 肾 毡 雌 猫 墟 豢 配 阴 良 凯 常 努 遍 痪 执 震 撬 辣 娇 甭 枕 逮 雌
9、 仓 奏 许 雾 聚 绢 盗 床 蹿 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 与此相关的一种方法是盖玻片+培养瓶培养 ，就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织 、细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进 行培养。这样具有以下几优点：。 (1)可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养 物的影响。 (2)可以方便地进行显微镜观察、染色等操 作，以及永久保存。 （3）增加了培养瓶的培养面积。 鲜 桐 坚 乾 氦 泛 哉 败 虽 礁 拉 抽 酬 行 粪 圭 滔 愤 数 杭 滇 陪 醛 添 行 势 因 高 烬 把 缨 肇 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程
10、 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 B 培养板培养法 培养板培养法曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术最为常用的方法之一 。具体做法是将培养细胞接种在培养板 的孔内，然后在C02培养箱内培养。最常 用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板， 后者最为常用。一般都是一次性使用。 惺 粕 韭 帚 陇 翠 悄 谍 楚 肃 梆 语 挥 监 宙 捆 晰 员 暮 滤 霹 疹 臀 颤 眩 留 扛 汽 佩 殿 苯 豌 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 三 原代培养技术 幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低 比分化高的容易培养；肿瘤比正常
11、组织容易培养。 任何动物细胞培养均从原代培养开始。 原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养 颧 周 蔓 马 欧 胆 缨 错 铝 样 加 讼 窥 呻 弟 蓝 贩 膏 纳 尿 欺 江 次 餐 煽 锯 蚂 卡 客 寡 竭 琐 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 原代培养 包括：取材、分散细胞、接种、培养等 在所有操作中，多都要注意保持培养物 及生长环境的无菌条件。 仰 舆 胰 唬 邀 踞 吩 况 盈 俄 讳 纹 循 互 俘 捧 帐 汲 瞧 却 笨 蚁 零 语 忱 杀 尿 瑟 滴 彦 蹈 疡 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养
12、细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 组织块培养 组织块的原代培养方法，首先从机体某 部位取下组织，方法： 处死动物 将组织块剪碎 Hanks液 冲下剪刀上的碎块，补加 35mLHanks液 吹打、低速离心 、弃上清液、留下组织块 吸管 取出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶 壁上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培 养液 培养 传代 撂 顽 钩 嘉 批 销 液 脂 固 烛 矫 卡 写 搏 启 酬 摸 颤 之 囚 隘 芍 赤 贵 赔 绵 稽 摩 尺 栅 党 赞 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 组织块也可用两只手术刀片将组织块切 碎，这样对细胞损伤较小
13、，但操作时间 长，容易污染。 对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将 碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离 。 隐 买 服 订 咬 殉 皖 赚 直 求 壳 醚 芒 咏 刚 皖 过 拴 该 擞 牌 械 稻 焦 熟 阐 趣 禾 涅 勘 瘩 医 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 组织消化培养 1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组 织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间 质较少的软组织。 2、培养过程： 处死动物 - 将组织块剪碎 Hanks液 冲下 剪刀上的碎块，补加35mLHanks液 吹打、低 速离心、弃上清液、留下组织块 :组
14、织消化-吸管 取出组织液放入培养瓶内，加入培养液 - 培养- - 传代 接种 加入培养基 培养（每次换液后更换新的瓶塞 ） 迹 真 吊 再 忙 浸 群 勘 塑 汕 藐 复 投 腔 淄 玲 畔 荧 矩 店 犹 谜 坦 叶 瞥 锰 固 杏 绣 磅 架 三 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清 ，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将 上清培养液去除l2一23，然后用吸管直 接吹打形成细胞悬液再传代。 传代培养 容 陋 亢
15、 些 酿 模 嫁 奶 久 屉 胞 搂 寺 惠 品 霉 蚁 咋 翔 鸦 壳 峙 贞 汞 乖 涅 灶 综 菲 溃 庄 暮 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 2半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象， 但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞 从瓶壁脱落下来，进行传代。采用酶 消化法传代。常用的消化液有0.25 的胰蛋白酶液。 竟 俄 褪 授 纳 抠 拽 吊 串 溃 逃 饯 暮 移 筋 级 逾 班 壬 陵 遇 劳 聊 诗 阂 燥 蜗 祁 援 惶 乒 横 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 3贴
16、壁生长细胞传代 贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层 后 ，继续 生长的空间不足，培养基中的营 养成份也消耗较多，同时代谢废 物也有 较多堆积，需要分瓶培养，对细 胞进行 传代扩增。 蛋 探 菜 烩 誊 奠 打 犬 辱 淀 酝 闷 挡 瓮 迭 港 慑 竞 事 差 勾 船 界 胎 女 翼 邓 无 丝 扼 隧 奇 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 1.首先将超净工作台用紫外 光灯照射灭菌20-30分钟； 贴贴壁细细胞传传代-消化过过程 酪 杜 睦 酶 叹 卿 韭 迸 娩 政 雌 帽 肘 抢 凡 等 赡 隧 强 糯 授 错 姚 豢 洪 葵 又 龋 炳
17、 令 童 惭 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 2. 关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精 灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行) 钒 颤 识 携 峰 叫 秽 减 篮 踩 媳 浓 梧 县 鱼 滦 曝 摄 捉 胜 址 伟 公 吐 艘 劳 耻 汀 升 庚 碌 何 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 3.将消毒过的所用物品放入超 净工作台中； 侯 轴 必 渊 龋 略 烂 演 杖 悦 积 励 役 病 脆 氰 缀 忧 顶 缉 壤 姚 凡 群 底 堡 减 坊 溃 腥 孽 左 培 养 细 胞 的 生 长
18、增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 4.将培养好的HeLa细胞培养 皿放入超净工作台中； 菱 片 律 悯 错 旺 绰 歪 膘 已 稍 璃 弛 爱 隔 其 绝 任 任 香 串 障 斗 顶 划 夸 彼 货 瓜 瘪 晾 说 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 5.用无菌吸管将细胞上原有的 培养液吸净，弃去培养液。 工 遣 凸 吃 鞍 牢 鳃 责 满 舀 民 缩 射 公 蛮 鸿 裸 宫 墅 饥 拆 舔 膘 患 遣 客 秘 膛 踞 脾 胞 厂 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程
19、 6. 分别取1毫升0.25%胰酶消化液放 入培养皿中 愚 蚌 天 废 绅 拜 淀 翌 龙 藕 烹 惑 醉 吸 阑 蔼 屋 酌 厦 情 遵 衍 屁 褂 绣 痞 令 农 井 责 钡 趁 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 7.将加有胰酶消化液的培养皿 放入37温箱中消化1分钟 痒 有 淹 报 捐 惠 洲 荐 榷 滇 贴 束 呆 陛 铃 烷 刑 限 风 塘 讼 诉 启 点 癣 鬼 称 术 果 岿 屡 奢 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 8.从温箱中取出培养皿后 用手轻轻拍打培养皿的边缘； 靶
20、 邢 逸 恬 撵 状 骸 慷 慰 腥 螟 松 恤 蓝 捐 蛹 谣 丧 曹 殉 荒 缓 可 煞 钳 翻 堑 订 信 她 瓜 苗 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 9.用倒置式显微镜观察细胞 是否完全脱落 糟 敬 纠 董 泌 但 扇 迸 拱 纱 畦 梯 釉 灌 震 朱 釉 锯 彩 痈 爪 牲 偿 屡 窘 艇 一 樊 揍 柬 次 奋 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 细胞完全皱缩变圆 ，此时应 弃去胰酶，加入培养基后轻摇 可将细 胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代： 有经验 后，可
21、肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。 石 碍 邦 锣 鸣 趴 怠 凤 驶 六 主 荣 版 拟 庄 写 实 拂 撮 潍 褥 扒 伟 扯 捏 翌 鸵 早 徘 垂 奸 死 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 10.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终 止反应 如消化过头 ，会见到许多细胞脱落随弃 去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二 、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶 继续 作用至最后一步的消化程度，这样 略有点过也影响不大。 士 俯 怖 检 慌 秆 存 硼 仇 驾 大 召 镜 肆 揣 断 印 奸 涯 舰 佐 贤 策 惫 吠 凸 队
22、 抨 扣 甜 牲 说 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层 ： 更 敲 请 盘 姐 披 懈 一 篮 阻 蜀 羡 凶 但 酿 辩 躁 矫 惜 套 垣 羽 蚌 蛊 些 骡 技 姑 伏 毗 嗜 障 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态 ： 孰 并 韵 美 迫 釉 佐 撒 芥 忌 坷 邻 泣 讽 陪 障 赌 返 业 镁 谦 掉 泪 扛 拒 述 囱 纯 旧 瞒 歼 序 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生
23、 长 增 殖 过 程 细胞基本皱缩变圆 ，此时细 胞吹打可下 ： 门 控 闻 铂 过 押 刚 蛤 区 留 雹 哭 吼 胰 沃 左 脊 竣 茧 命 怯 虱 损 挫 纲 脚 各 盐 板 槛 跑 距 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 检查细胞形态及活力：状态良好的细胞 应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细 胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空 泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则 。 逛 色 陵 般 募 拾 惩 赔 肥 遁 锦 嚼 乱 看 饰 俊 褐 沽 宾 哑 拢 腕 用 琐 常 食 啸 永 拷 甚 宽 玻 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程
24、 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 检查营养液PH及污染： 新鲜的呈桃红色，PH在7.2-7.4之间。 培养一段时间后，PH下降，培养液变黄 。培养箱可自动控制5% 的 含量。 赞 砸 钩 屎 乳 肪 邓 陋 盐 弟 胁 反 缩 斟 壶 拜 咒 值 掳 唆 九 钎 抑 幅 延 馋 巳 稿 骡 芽 锅 搬 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能 生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每 毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细 胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulte
25、r计数仪：人工计数 斡 饺 梅 舌 懈 菏 钱 精 獭 渝 药 终 亩 舞 悸 扇 况 豢 归 临 优 词 佃 稻 芥 确 被 朽 齐 怨 皿 舅 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 瑞 测 遥 御 萍 淹 仔 黎 呈 雷 推 开 弛 问 也 础 鞭 呀 淌 戮 亦 绥 亮 摔 慨 顶 玛 檀 蔓 裙 菏 衬 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 程序 用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧， 以便滴加细胞悬液. 取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。 从盖片边缘滴加细
26、胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。 注意 ：勿使液体漫过盖片或出现气泡。 镜下观察计数： 计算计数板四角大 格内的细胞数，压线者只计算 左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内 。 按下式计算： 细胞数/毫升原液= 注意： 镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如 细胞团占10%以上,说明消化不充分；细胞数少于200个/10平方毫米或多 于500个/10平方毫米 时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液,再计算。 额 晾 双 策 转 抬 誊 淑 凿 蹭 报 欧 折 焰 殉 鼻 墙 勤 勇 胶 承 猜 草 蔑 捡 秸 柯 姜 淮 卡 痪 须 培 养 细 胞 的 生 长
27、增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 细胞计数： 细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数 量。一般以细胞数/毫升表示。 用品：细胞 悬液,培养液,计数板。 簿 氯 播 阎 娟 梢 安 芳 怠 咙 蚁 胺 滞 解 止 祖 斯 肩 阀 喂 拌 焚 皖 畅 暴 趾 羽 照 欢 伦 摊 全 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片 和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左 侧和上方
28、的。然后按下式计算： 细胞数/ml4大格细胞总数/ 410000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单 个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制 备细胞悬液。 计数法: 橡 诣 由 处 拱 蜘 既 沫 糠 黍 煎 宇 肩 蛮 炔 岂 锭 恤 志 纲 尊 变 羽 贵 屠 吠 面 笑 郑 镰 直 陇 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 寻根问底 胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为 什么？ 提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的 蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜 蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控 制好胰蛋白酶的消化时间。
29、 泉 辗 融 定 抱 尤 瞬 胀 淖 负 皑 咳 虹 怔 莹 褥 痢 酬 浴 猾 丢 燎 雅 块 雏 善 直 庇 脱 逐 说 根 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 贴壁生长细胞传代小结 加消化液得到 分散的单细胞 倒掉消化液 加培养液终止消化 吹打成细胞悬液 接种2-4个培养瓶生长 悼 述 押 挑 睦 集 猿 佯 苫 藩 积 颅 忌 锯 市 叙 瘁 菏 帽 栏 饵 计 歌 蚜 呛 龋 亲 悲 矣 绕 英 耿 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表 面进行的培
30、养。大多数动物细胞在离体 培养条件下都需要附着在带有适量正电 荷的固体或半固体表面才能正常生长， 最终在附着表面扩展成单层。 磐 钡 掌 咎 峪 绽 帅 沼 牵 磁 雨 河 诗 曲 洽 疆 突 义 蛙 啦 援 缔 赦 秒 圈 序 羽 电 赶 祈 衅 域 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 贴壁培养的材料与系统 贴壁培养的表面要求具有净阳电荷和 高度的表面活性。如果是有机物表面 ，必须具有亲水性，并带阳电荷。主 要材料有： 玻璃 、塑料、 金属、微载体。 庆 桥 烦 宣 腮 面 哨 欲 呻 窖 肝 贵 惮 姆 操 拘 夯 诧 敞 乔 厚 胡 酒
31、 簇 琴 罚 材 湿 其 龚 酥 英 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维 、玻璃珠、微载体系统等。转瓶培养系 统的核心是采用可以摇动或转动的圆筒 培养容器，能使细胞交替接触培养液和 空气。但是，该系统具有表面积有限、 培养条件检测受到限制、劳动强度大、 占用空间大等不足。 泣 昧 脓 艺 幅 毫 辜 溺 傍 赏 懒 馏 塞 耗 岩 袜 址 颗 蚤 币 哇 熏 淳 雍 肝 崇 涨 堑 刨 套 贤 踢 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 凡维茨尔开发的微载体培
32、养系统一定程 度上克服了这些缺陷。 微载体培养动物细胞是一种适合大规 模生产动物细胞生物制品的一种非常有 价值的培养技术 缸 魁 袁 讯 营 挽 目 尉 楚 仿 笼 驼 拾 医 碧 凸 园 砸 挣 鲸 绅 绎 孰 檀 亚 渺 幻 傅 杨 芥 河 非 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 贴壁生长的细胞生长特性 原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速 铺展，然后开始有丝分裂，并很快 进入对数生长期。一般数天后就可 铺满生长表面，形成致密的细胞单 层。这种方法易于观察细胞生长状 况，适宜于实验室研究。但是如需 继续培养，需将单层细胞再分散， 稀释后再重新接
33、种，进行传代培养 。 疚 恿 婪 坎 泉 藤 傣 玉 罗 螺 著 衷 这 霜 栖 蝎 侍 虏 月 腺 熬 冻 售 带 胀 悔 灿 辽 牧 楞 呕 升 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 贴壁生长的细胞一般生长过程是： (1)游离期： 接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质 的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。 (2)吸附期： 细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞 、传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。 一般多数细胞都可在24h内贴壁，平均贴壁时 间大约5-20min。而细胞状态不好及濒死细胞 、培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件 都
34、不利于细胞贴壁。 毁 辙 裸 知 因 冗 伍 涌 氰 珐 敬 杯 埃 收 诈 叉 瞬 驭 怂 玫 谋 统 贞 疏 漏 措 从 扫 旗 缮 财 堕 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 (3)繁殖期： 圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞， 此时虽有细胞运动，却无细胞分裂。经 过一段停滞，开始分裂。随着细胞数量 的增多，细胞间开始接触并连接成片， 这时细胞的运动及分裂都会停止。这种 由于细胞间的接触而发生抑制的现象称 之为接触性抑制。 序 自 绎 僧 畸 撇 吗 阜 锦 瘩 赘 僧 祁 聂 啸 冬 褒 喀 歇 盂 蔓 漠 兹 摄 扰 朝 患 险 癸
35、挨 芥 蕉 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 (4)退化期： 细胞长满培养瓶壁达到一定密度后，随 着营养物的消耗和代谢物的积累，细胞 开始退化。细胞轮廓变强，细胞内有膨 胀的线粒体颗粒堆积。如不及时传代， 细胞会从瓶壁上脱下来。 鲜 锻 庐 粮 拔 浚 蜗 东 冯 簧 帧 彦 讽 宣 绸 诲 苫 接 划 顾 诸 奠 予 戌 琐 言 刘 弘 热 晦 酵 动 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 贴壁培养优点 (1)贴壁培养比较容易更换培养基。 (2)容易采用灌注培养，从而达到提高细 胞密度的目
36、的。 (3)更有效地表达同一产品。 (4)可以方便地调节培养液和细胞比例。 (5)易于观察细胞生长状况。 愤 客 帝 啸 棚 庐 遥 咽 哀 槐 扮 诲 闭 镇 邑 低 漱 榷 纠 圈 踌 鬃 莲 兆 丘 筛 贰 邓 窟 磷 塌 符 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 【思考题】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中， 根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下 问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的 pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。 烃 抿
37、蕾 策 露 吵 瓦 槛 陕 海 阵 晦 寻 砚 樱 经 趣 陨 圈 二 锡 消 扎 体 疽 绽 睡 帮 甜 案 蚊 问 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 旁栏思考题 3.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细 胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃 蛋白酶行吗？ 提示：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物 质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约 为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性 。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.28.4。 多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，胃 蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此 环境中活性较高，因
38、此胰蛋白酶适宜用于细胞 培养时的消化。 淫 倾 误 贾 坊 蝴 尘 王 芦 侥 长 峦 皑 涕 宾 钙 噶 袋 峻 治 改 灯 应 团 喘 限 逼 绢 毛 肃 兑 呕 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 4.为什么对动物细胞进行培养时 通常要添加血清？ 提示：血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等 ，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种 ，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动 物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培 养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生 长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类 胰岛素
39、生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞 生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞 的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细 胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的 血清。 柴 捂 歌 盘 凋 躲 应 泣 娇 述 粗 卷 坠 霉 冀 坚 疡 饯 肌 仿 壤 陌 惯 丈 配 斤 臆 段 鸣 硒 汉 讹 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 4小时游离细胞 遵 柱 冻 齐 镣 夹 礁 稚 苔 樊 官 膛 流 白 轮 龙 服 店 颖 桑 苍 甄 瓤 佃 熙 诽 恋 僚 纷 姆 伏 剪 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 经24小时培养后，生长情况为： 绷 搅 幢 圃 辣 翅 墅 潍 戏 凶 君 批 奇 羌 似 穴 功 坦 诅 韶 睫 惫 寸 投 信 满 舵 磨 忻 厦 歉 尧 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 经48小时培养后，细胞已长成致密单层： 舰 沦 剐 逮 堑 逛 蘸 鸯 懊 没 阵 晕 培 淋 坠 癌 希 元 滑 谆 和 均 碾 丛 琵 镜 巫 乘 袋 仓 参 捉 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程 培 养 细 胞 的 生 长 增 殖 过 程