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1、精 厦 掠 瓮 液 壁 丸 霞 蛀 媳 赴 等 迅 如 傅 拉 策 作 碑 啊 绪 酋 遮 叁 块 篮 辜 植 桌 诺 闸 很 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟疾快速诊断技术的 研究与应用 湖北CDC传染病所 袁方玉 吟 农 雾 喉 株 窘 贫 玫 哨 可 协 雨 遂 纵 入 察 生 雹 灿 刚 馁 妓 赞 如 泳 强 娠 焰 拌 葵 阎 赴 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 主要内容 前言 显微镜镜检用于疟疾诊断 荧光显微镜用于疟疾诊断 PCR方法用于疟疾诊断 免疫学用于疟疾诊断 1、疟疾诊断试剂基于的靶抗原 2、诊断试剂基于的
2、免疫学原理 3、疟疾诊断的快速诊断试剂 察 涂 疾 讯 厌 镰 在 貉 蚌 纳 鬃 戮 藤 狐 蹄 翟 暇 纹 呸 他 渠 随 因 乎 武 酚 砖 允 救 蠕 泽 默 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 前言 疟疾是广泛分布于热带、亚热带及温带边缘地区的一 种重要蚊媒传染病，弓l起世界范围内的较高的发病率和死 亡率， 简便、快速和可靠的检测手段对提高临床疗效和控 制流行具有重要意义。传统的厚、薄血膜姬氏染色镜检浩 仍是当前疟疾诊断的主要方法，但费时费力，需专业培训 人员，且对低原虫血症者易漏诊 这些不足促进了更敏感、 简便，更快速的新技术的发展，如荧光染色镜检 组氨
3、酸富 集蛋白和疟原虫乳酸脱氢酶抗原检测及PCR技术等。 启 截 羊 桌 冈 选 浙 吗 矫 服 呢 氢 览 鲍 秉 变 弥 符 倪 馋 宛 忌 忽 妮 株 空 恃 塞 驾 废 畜 几 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 世界卫生组织召开的专家研讨会上认为疟疾的 诊断方法应准确、敏感、低廉快速方法应能检出 每微升100个原虫，检测时间应在1小时内完成检 测。 溉 档 讣 脆 汇 萧 高 廷 磐 熟 余 刺 眶 诧 皖 洽 囊 奉 纤 嘱 掐 耽 宏 腥 雅 湍 吓 岩 秽 芽 够 仗 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 一、显微镜镜检用于疟
4、疾诊断 显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断 技术(金标准） 主要优点 - 特异高 - 能区分虫种 - 能分期 - 能计数 - 1小时内能完成诊断程序 默 拿 男 监 患 哼 划 列 哑 豆 峭 秉 侄 审 弥 仇 摩 援 慨 此 裸 耗 郭 吮 膏 嗜 苔 胜 吃 澜 沂 峰 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 缺点 - 要求有较高的技术素质 - 容易漏检（恶性疟） - 大规模镜检费时、费力 - 敏感性低（原虫感染率为0.01%，厚片的 敏感性是薄片的10倍） 搓 酷 闽 俯 喷 辊 奴 港 草 傲 驳 公 溯 默 邵 撕 编 酝 凯 征 忿 眩 儿 妆 麓 贺
5、毁 眶 乒 纂 开 迈 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 二、 荧光显微镜用于疟疾诊断 研究发现，一些荧光素对核酸有好的亲 和力，经一定波长的紫外线激活，原虫核 酸可通过荧光显微镜观察到。 目前常用的荧光染色剂: - 有吖啶橙（AO） - 苯并硫羟基嘌呤（bcp） - 若丹明-123一种红色的荧光染料，主要作 用于细胞膜，也常用于原虫染色 阐 因 稿 给 泰 肚 敬 昼 世 扇 京 咨 虎 原 氮 浓 氟 植 抄 足 捉 硬 咙 牧 几 伐 陇 琵 制 遣 楔 腺 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 FIG. 1. Trophozoit
6、es of P. falciparum stained with AO in the QBC UV fluorescence method 讨 授 诽 丢 宽 源 惺 窑 贩 薪 告 俄 醇 敖 倒 旺 堪 吐 住 魄 段 疹 咱 罩 粤 腺 熙 贮 鲤 闽 埋 脂 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 吖啶橙（AO）优缺点： 染色需要较高的技术，辨认非特异性着 色因子，特别注意区分豪厄尔斯氏体同原 虫的区别，这种豪厄尔斯氏体来自溶血性 贫血的病人。一般来说，吖啶橙染色法检 测原虫的敏感性为41-93%,为 100原虫/1 微升血液,相当于0.002%感染率。检测恶性
7、 疟的特异性为93%。检测间日疟和其他非 恶性疟原虫的后期原虫的特异性只有52% 。 农 干 宏 恃 觉 沥 疙 苯 米 氧 障 莎 傈 糕 齐 睁 藕 衫 惟 骋 沁 苏 认 委 竞 硕 乎 甩 搂 昂 泣 终 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 染色优缺点： 染色后疟原虫厚血膜在倍 荧光显微镜下见，疟原虫各发育期及滋养 体、裂殖体和配子体呈特异性苹果绿色荧 光；胞桨疟色素呈黄色；白细胞胞桨染成 亮绿色。血膜中的异物不呈荧光色，易区 别。 忠 涅 夺 徘 媒 脊 惜 碰 甫 蓟 充 受 亲 俞 稠 舟 谁 迁 钻 邹 碳 往 乔 号 莫 蚕 舌 路 因 阶 旭 洁
8、 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 FIG. 2. Trophozoites of P. falciparum stained with BCP in the fluorescence method. 雏 休 绦 辈 似 典 辛 酉 旧 漓 铆 废 歌 寨 霓 战 澎 旺 屑 移 假 悦 头 锭 筑 皮 怜 甥 辖 六 启 剩 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 染色恶性疟与间日疟血片，敏感 性为、，特异性为 、，阳性预测值 、阴性预测值与 。认为染色法是一种有使用价 值的疟疾诊断新方法。 结 妻 锰 漳 曹 祈 奏 辈 嘉 饵 屯 症
9、 寺 脯 们 域 芝 弱 奄 驭 丰 立 崔 喊 询 嚎 寺 镇 淘 撰 红 舆 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 若丹明-123： 一种红色的荧光染料，主要作用于细胞 膜，也常用于原虫染色 ，目前用得不多。 吴 银 串 戒 偏 惜 柄 樱 偿 豢 嫡 顿 存 芳 入 忻 翔 喝 锌 册 杏 呜 乞 虚 墅 贝 恼 某 鸥 忻 证 抽 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 三、PCR方法用于疟疾诊断 PCR方法严格来说不能算是疟疾的快速 诊断方法，他的主要特点是敏感性高，能 检出每微升少于5个原虫的血液样本。复式 、多层和荧光定量PCR方
10、法可用于疟疾的 定性和定量诊断，这对哪些形态学难以鉴 别的样本来说非常有价值。 忌 夯 送 搁 鬃 馁 凶 惫 郧 蛇 钨 讯 功 釉 尼 剃 咙 画 怯 膊 凸 个 馋 窥 冈 抡 郎 扳 钎 陛 青 菇 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 （一）疟原虫检测的常用的分子标志 有环子孢子 (CS)、18SrRNA片段、裂 殖子表面蛋白一1(Msp一1)、裂殖子表面 蛋白一2(Msp一2)及富组氨酸蛋白(m )基因 等 愉 额 祸 拭 剿 招 岿 犊 竖 近 汞 俊 肿 旁 纳 圈 蚌 袄 椭 杉 萤 根 男 驾 毅 踪 交 叉 蒋 忆 粳 姻 疟 疾 快 速 诊 断
11、 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 CS是疟原虫子孢子表达的一种期特异性表面抗原的 基因。已发现通过测定CS基因序列的重复结构可进行疟 原虫分类了解其遗传特征和地理来源。自1984对CSP 基因序列进行测定以来，已积累了大量CSP基因资料， 至今为止有中美洲、南美洲、东亚、东南亚、南太平洋 岛屿开展间日疟原虫CSP基因序列分析问日疟原虫 CSP中央重复区由1521个9肽重复单位组成，每单位由 27个核苷酸编码9个氨基酸，目前已发现两类明显不同的 9肽重复单位，分为PvI型和PV一型I型按9肽单位 氨基酸序列变化分为温带族和热带族，两族序列差异明 显分布有一定局限性。 羊 猛 燥 签 互
12、钞 帐 奶 忽 孰 咙 湾 鸦 柏 跳 砧 附 耻 梆 踏 吊 交 辐 硝 势 了 篓 麦 甸 奢 妖 棵 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 （二）优缺点： - PCR方法也可用于研究原虫的种群差异、 突变和对药物的抗性 - 敏感性高。能够检测到感染率为0.00001% 的恶性疟原虫血样，以及感染率为 0.0000126%的间日疟血样。 - 利用套式和逆转录PCR方法能鉴定4种疟原 虫， 纯 暂 津 律 奋 试 墒 坯 锚 站 梦 籍 训 枚 辅 府 狞 厄 爱 齐 闸 侯 厉 光 逛 靛 钵 臆 瓣 鞋 径 斧 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊
13、 断 技 术 一般PCR方法也存在着产物的污染易致假 阳性，不能在一次检测中鉴别虫种，也不 能诊断混合感染。 需特殊设备，不能用于现场 费时，成本高 姥 编 哼 粤 女 就 肝 眺 诅 淄 胀 呈 秤 业 缴 楞 挟 况 诱 林 徐 扶 唐 酪 掺 底 逛 幅 蕾 清 锈 矮 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 四、免疫色谱方法 （一）原理 免疫色谱技术其原理为利用硝酸纤维素膜(NC)制备免疫层析测试 条，在NC上包被被检抗原的一株单抗作为捕获带，同时，将另一株 单抗偶联在胶体金或乳胶上作为检测试剂。当样本溶液和检测试剂 通过捕获带时，二者形成的复合物即被包被在膜上
14、的抗体捕捉，如 果样品中含有被检抗原，则捕获带可发生颜色反应，颜色反应的强 弱与样本中的抗原浓度成正比。这些产品从取血、反应、结果判断 ，只需510分钟，而且多个样本可同时进行检测不需特殊仪器，非 常适合于边远山区基层医院、卫生所防保医生和村医应用。 踢 失 稠 鄙 救 爽 徊 外 悼 端 拣 漏 炙 煤 走 为 效 筏 土 凉 砚 疙 哀 史 殷 任 旁 畜 坟 窜 介 罗 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 FIG. 3. Principle of immunochromatographic RDT for malaria 琉 贰 腮 甩 啤 敏 割 晰 求 秆
15、 傣 夷 堕 费 吟 讶 挣 怎 舶 垄 枷 率 疏 晰 莆 结 睡 杂 阻 佯 伟 篙 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 （二）疟疾诊断试剂基于的靶抗原 1、水溶性蛋白HEP（histidine-rich proteins）。研究表 明恶性疟原虫感染红细胞后，由感染的红细胞分泌三种 含有大量组氨酸组成的水溶性抗原，它们是HRP-1/HRP- 2和HRP-3。HRP-2由感染疟原虫的红细胞大量分泌，其 含量在整个红细胞内期随裂殖子的分裂逐渐升高。这一 抗原只由无性体中和早期配子体产生，量大，且较稳定 ，是用于恶性疟诊断的首选。同HRP-1和HRP-2比较， HRP
16、-3在血液中的量很少，目前还没有针对它的试剂盒 守 嫉 走 株 郁 融 蛇 掺 蟹 廓 椿 乒 壕 旬 轨 乍 怪 度 蜕 拱 皂 寝 粘 挂 牡 穴 玖 拍 宝 锗 绎 譬 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 2、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase ，LDH) 乳酸脱氢酶是糖酵解途径的终止酶，由疟原 虫的无性期和有性期产生。先前的研究揭示了 pLDH同宿主动物LDH在理化、免疫学特性和酶 学方面有很大的差异。另外四种疟原虫产生的 pLDH有不同的异构体，具有种、属特异性，因 而目前将它作为快速检测试剂第二选择的靶抗原 。 钟 晶 妮 得 案 芳
17、 琐 涧 部 娶 竹 条 瓣 酷 谜 绩 盒 伺 驯 膀 蔡 唱 豆 爽 腕 扔 赣 传 刑 卞 核 邮 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 3、醛缩酶（aldolase） 醛缩酶是一种果糖二磷酸醛缩酶，可催化1，6-二磷 酸果糖，生成磷酸二羟丙酮及磷酸甘油醛，由疟原虫的 无性期和有性期产生。四种疟原虫都能检测到。一些研 究建议将此酶作为快速诊断的靶抗原，目前仅限于研究 。 宅 安 根 辊 肩 招 污 丸 澈 众 珠 义 控 泼 导 熔 禽 丹 剐 躁 摄 固 熔 匠 袒 升 煤 帽 杭 熊 倔 微 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 （
18、三）快速诊断试剂 1、ParaSight-F。ParaSight-F法为世界卫生组织推荐的应用产品，检测 原虫的靶抗原为HRP-2。和厚血膜镜检比较，现场评估结果显示在原虫 密度大于100个微升，原虫感染率0.002%时，检测恶性疟的敏感性平 均为7798%，特异性8398%。当患者HRP-2分泌少，血液中HRP-2 水平低时，ParaSight-F法可能出现阴性结果，同PCR法比较， ParaSight-F的检测低感染率患者的敏感性低于PCR法。 稻 原 裸 咆 静 锥 牌 甸 好 绅 绍 稻 饵 嚣 毯 黎 盏 交 檀 挞 桅 染 环 神 钉 俊 锅 拘 焚 窒 宰 萤 疟 疾 快 速 诊
19、 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 2、ICT pf和 PATH Falciparum Malaria IC。ICT pf。 ICT pf （ICT1）诊断卡用于检测恶性疟，也是基于检测HRP-2 抗原。该诊断试剂由于操作简单，所需仪器少，结果易于判断，赢 得了越来越多的使用者。缺点是只能检测恶性疟，如果用于检测其 他疟疾可能造成漏检或误诊；其次不能用于诊断混合感染；第三有 报道于内风湿因子起交叉反应，导致假阳性。 蔚 伎 拆 播 邵 池 绊 傍 进 线 悠 拧 杨 唱 苟 潮 队 浓 越 峡 掷 沮 验 媚 扦 二 械 访 私 酶 忘 腥 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快
20、 速 诊 断 技 术 FIG. 4. Amrad ICT Pf immunochromatographic test device for detection of P. falciparum HRP-2. 定 志 责 由 啦 汾 燎 唐 岸 置 钱 烷 帜 愿 假 函 伙 鹤 猩 层 泅 盒 志 匙 呈 岩 葛 玻 讲 窖 蛰 错 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 3、OptiMAL。 OptiMAL诊断试剂是基于检测原虫代谢产物乳酸脱氢酶，目前 OptiMAL乳酸脱氢酶检测试剂盒是在层析条上包被两株LDHpf单抗 ，一株为恶性疟种特异性单抗，另一株为能与四种人
21、疟原虫都反应 的属特异性单抗。此诊断方法在实验室和现场条件下都已进行了评 估，同镜检法相比，恶性疟原虫的敏感性和特异性在分别为88和 99 ，问日疟分别为94 和100。在评估中也发现，感染率小于 0.002%的血样OptiMAL检测有3%的阴性 啮 劳 基 挨 邓 陶 宾 锭 戒 拇 勃 菌 桨 扣 杏 渠 霹 躇 劲 侈 爆 衣 嫩 介 登 裕 沦 救 盘 但 排 纲 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 FIG. 5. OptiMAL immunochromatographic test device for the detection of pLDH. 栅 劫
22、 诞 亲 陡 相 佣 修 豢 扼 襄 帐 戏 冠 秤 矽 鲜 器 淄 柳 迅 钧 才 惮 酷 观 露 背 臭 氧 札 幂 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 TABLE 1. Results of routine blood samples examined for malaria by microscopy compared to OptiMAL rapid dipstick testa No.ofsamplesandspeciespresentbymicroscopyNo.OptiMALpositiveSensitivity(%) Plasmodium falc
23、iparum 54withparasitemiaof1%(50,000parasites/l)54100 103withparasitemiaof0.11%(5,000parasites/l)103100 72withparasitemiaof0.010.09%(500parasites/l)72100 32withparasitemiaof0.0010.009%(50parasites/l)2372 11withparasitemiaof0.00010.0009%(5parasites/l)873 5withgametocytesonly 480 Plasmodium vivax 110(a
24、llasexualstages)10596 Plasmodium malariae 17(latetrophozoites)847 Negative 214(nomalariaparasitesfound)0100 基 谩 该 灯 床 肆 抱 竹 剁 和 卢 撂 稀 赞 业 刁 茹 伍 谤 灾 笨 割 腹 住 凳 秆 兰 隘 膜 勾 廖 捧 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 TABLE2.ResultsobtainedbymicroscopyandOptiMALfromsequentialbloodsamples from60patientsreceivingth
25、erapyforP. falciparummalariaa Samplecollectiontime No.ofpatientswithpositive microscopicparasitemia Meanparasitemia(%)No(%)OptiMALpositive Sensitivity(%)ofOptiMALatthis parasitemiafrominitialsamples Dayofdiagnosis(Pretreatment)602.4358(98)100 Day1posttreatment511.9639(76)100 Day2posttreatment440.525
26、27(61)100 Day3posttreatment290.1118(62)100 Day4posttreatment160.03111(68)100 Day5posttreatment80.00223(38)72 覆 芜 沫 忧 慑 匡 慷 倔 其 品 统 催 粳 页 刹 率 脚 啊 伟 扰 婆 叮 绦 汁 瞻 汤 绑 娶 唱 慌 横 翁 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 TABLE 3. Comparison of methods for diagnosing Plasmodium infection in blood Parameter Microscop
27、 yPCRFluorescenceDipstickHRP-2DipstickpLDH,ICTPf/Pv Sensitivity parasites/l) 50550100100 SpecificityAllspeciesAll specie s P. falciparumgood,othersdifficultP. falciparum only P. falciparumandP. vivaxgood,andP. ovaleandP. malariae onlywithpLDH Parasite densityor parasitemia YesNoNoCrude estimation Cr
28、udeestimation Timefor result 3060min24h3060min20min20min SkilllevelHighHighModerateLowLow EquipmentMicroscopePCR appar atus QBCapparatusordirectfluorescence microscope KitonlyKitonly Cost/testLowHighModerate/lowModerateModerate 蔑 邮 鼠 赎 佣 币 君 九 传 蛊 画 抡 磕 雪 视 榜 武 路 尼 滦 八 头 费 蝎 氖 享 惟 搅 揪 被 沧 戳 疟 疾 快 速
29、诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 五、镜检站、镜检中心的职责和任务 1、如何确定每个县血检数 A 国家规定，以县为单位发病率在1/万以上的 地区，（我们省枣阳、襄阳、老河口、广水一类 县）年血检数不低于辖区人口总数的2%; B 1/万以下的地区，年血检率不低于辖区人口 总数的1%（二类县、区）； C 连续三年无本地疟疾病例的县，年血检率不 低于辖区人口总数的2/（三类县）。 意 豹 写 叹 神 耳 骸 龄 掩 虑 仍 砒 青 吏 狱 崔 痈 庙 堑 柱 粟 抠 疗 兑 扒 圾 皂 捉 丢 寞 酗 擂 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 2、镜检站 省卫
30、生厅要求（鄂卫函【2010365号），各级综 合医疗单位、传染并医院及乡镇卫生院都要建立门诊 发热病人疟原虫镜检站，有1-2名专职化验人员承担门 诊发热病人血检疟原虫工作。镜检员有以下几件职责 ： （1）采血、制片、染色、镜检 （2）编号登记 （3）保留好血片 （4）按要求上报血检报表 窝 病 能 篡 室 挞 爹 牟 捏 彝 吮 桐 喊 氏 天 雕 锋 仰 景 芭 晦 号 滁 返 抢 束 柱 肿 消 兔 棕 则 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 3、镜检中心 省卫生厅要求县、市、区级疾病控制中心都 要成立镜检中心，其镜检中心的职责为： （1）督导检查所辖镜检站工作
31、 （2）指导、培训镜检站镜检员 （3）负责对各镜检站的阴、阳性血片进行复核 。县级镜检中心负责复核所辖乡镇全部阴性片的 5%,地市级镜检中心抽查所辖县市区复查阴性片 的10%，省级复查各市抽查阴性片的20%，阳性 片全部复查。 礼 亚 迟 蚜 彝 筏 粤 谆 浊 悦 党 痈 虾 磁 垒 肋 推 椎 甸 叠 慕 残 西 适 炙 吭 陶 坛 肿 阮 檬 斩 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 （4）地市级镜检中心还要负责县市级的镜 检工作的检查督导及人员培训 （5）县市级镜检中心负责收集镜检站血检 报表并汇总上报；地市级负责各县市血检 报表的收集、汇总、上报。 惭 夹 捐 档 击 茵 蹬 抿 柔 利 候 直 岁 褐 毒 摩 款 炼 劝 泊 集 闺 梭 藏 崇 鸽 丙 殖 片 凶 淖 昌 疟 疾 快 速 诊 断 技 术 疟 疾 快 速 诊 断 技 术