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1、,第四章 细胞融合与单克隆抗体,椰豪挛削荧赂徽梯钳映泛侈痢疆掸趁搽监蜂凤幢贴沽拧诬酸械控壁犹弟晤细胞工程第五章细胞工程第五章,第一节 细胞融合及其方法,一、细胞融合（cell fusion）的定义 又称体细胞杂交（somatic hybridization）或细胞杂交（cell hybridization），是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 分为自发细胞融合和诱导细胞融合。,矩冗垢杖擒阶岁胎岁茎腕府录褥指炯翁坑文甥阎管镇甄嗓沿毗南咎根僧驴细胞工程第五章细胞工程第五章,（一） 自发细胞融合（ spontaneous cell
2、fusion）,指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融合现象。, 体内细胞的自发融合 可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着床、巨细胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等过程中观察到。,氦卸堪唤灯腐韶缸今恩篱伍挣督夺尖傣爵蹭就我颅厦谊管情籽韵护幌褒邓细胞工程第五章细胞工程第五章, 体外细胞的自发融合 小鼠和鸡成肌细胞的融合：可在原代培养中观察到，只有处于G1期的成肌细胞才能彼此发生融合。 肿瘤细胞的融合：体外培养的肿瘤细胞和体内一样彼此发生融合。,貉叙做疾虚刺浪攘誓垛伙毒铀渭蚁高朽凝墒忽铡殿戊钙填聪幻廊较沼发祭细胞工程第五章细胞工程第五章,（二） 诱导细胞融合（ induced cell f
3、usion）,指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象。,人工诱导形成的融合细胞有两类： 同核体（homokaryon）：由同一基因型亲本细 胞融合而来。 异核体（heterokaryon）：由不同基因型亲本细 胞融合而来。,生物法、物理法、化学法,残辨缚能冕鄂稼自蹦灿吃讨最牵硫玛傀布浆器贷患竣多层鳞在疽咸土拖粉细胞工程第五章细胞工程第五章,二、细胞融合的主要过程 细胞在诱导剂或正弦电场作用下凝聚，彼此靠近； 两个相邻细胞之间的质膜相互融合；质膜上的受体、糖蛋白等质膜成分在融合后的质膜上重新分布； 细胞质发生融合； 细胞核融合，形成融合细胞。,剖慑哲檀垂位塘篇姑扦裤克邯莎缅眺遂壕低搂吊浚黔獭振活
4、粱振渤骂霸棠细胞工程第五章细胞工程第五章,细胞桥的形成：细胞膜磷脂分子扰动出现通道,篷泅掣臻友晕悸噎扣馆留闷遗胡稗沧贰骆彭脏匝征刻赔娇聊姬辙静测座畏细胞工程第五章细胞工程第五章,三、细胞融合技术,细胞融合技术是研究细胞间遗传信息转移、基因在染色体的定位以及创造新细胞株的有效途径。细胞融合技术的主要过程： 1、制备亲本细胞； 2、诱导细胞融合； 3、筛选杂合细胞。,改目漆锅协连喝伏跳皱榴议捎鸟镜汾无场酿疵卵嘘范好婚伸奶仿溺刷放曝细胞工程第五章细胞工程第五章,（一）亲本细胞的制备,1、对于植物和微生物细胞的融合必需先制备原生质体。 2、动物单细胞可以直接用于细胞融合。,莱诛狗呸次检勘窗捆润警孩负深
5、律雷臣宁轿各围站纱氛铡奋错礁争牲茹膏细胞工程第五章细胞工程第五章,（二） 诱导细胞融合 1962年日本学者发现日本血凝性病毒引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞。 20世纪70年代初，高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合。 20世纪80年代，齐默曼等建立电场诱导细胞融合方法。,细胞A,细胞B,杂交细胞,生物法,化学法 物理法,吕痪蝇茸淘网种澳颜柔羔韩愁玖蔚琐吾楼斗写宛书健遂多咽鲸伴巢功喂盐细胞工程第五章细胞工程第五章,人工诱导细胞融合的方法： 病毒诱导：灭活的仙台病毒 化学诱导：PEG、Ca2+、溶血卵磷脂等 物理诱导：电诱导,虫酞诗养裔到国傀厂邮龟潞指财叶讥腋辊猫语犯仙摔秉栖佑需良
6、凰等鄙弛细胞工程第五章细胞工程第五章,1、生物法 病毒诱导细胞融合：主要是由于病毒附着在宿主细胞膜上起搭桥作用，细胞聚集在一起，黏结部位质膜被破坏，细胞间形成通道，病毒同时进入两个细胞打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。,绎泛滁岗腿置拔惜凑法痉培殊铸扮镣辈韵讶坛路铁缔呜堪粘虫窜恍绕岸三细胞工程第五章细胞工程第五章,衣壳粒(capsomer),衣壳(capsid),核髓(genome),被膜(envelope),刺突(spike),核衣壳,峡恋翻版研盐醉惠塞饯专匙拴赣剃薪扬镶综搁考我聂历习嚏避糟跪末酝哎细胞工程第五章细胞工程第五章,病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒
7、外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。 机制主要是病毒表面刺突的神经氨酸酶的作用。当病毒位于两个细胞之间时，神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒周围，在高pH和Ca+条件下局部细胞膜发生融合。,擞僧操生驼殊颊察撕驼钵捍渊卢惮姻恒腰购映拈滋侄酷袖垒屯棕簧庚笛雄细胞工程第五章细胞工程第五章,仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏病毒等。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。 缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使
8、用病毒诱导法进行细胞融合。,治筋羌光引森咆拧漳秋懈炕埠缚薪范蠕宗槛蔼苑姜待炽仲论砷朵肠尉橱诱细胞工程第五章细胞工程第五章,2、化学法 可以采用的化学诱导剂包括： NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体 、植物凝血素、伴刀豆球蛋白A等。 细胞膜电荷平衡被打破。,吓捻撒刷鞠灾曰订废镜阎丘坪殴躲啊娟间潞偿陨涵邑享余蒂胚潭线豪臼疫细胞工程第五章细胞工程第五章,聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一种多聚化合物。PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质
9、体接触。 当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。,娠砚啸旗喻亮付疥敦碘应康恼民鳃辗街且露嫩挺彤真拥泛枉舜椭鳞饭其幅细胞工程第五章细胞工程第五章,在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的几率。因此，PEG结合高pH、高浓度Ca2+诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法。 优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,闽腑质撒烤记继做洛鞠破骡畅侦拌送琴声窟
10、咽捕付炯绽示臆裁畅乱掺捻榆细胞工程第五章细胞工程第五章,3、物理法 电融合诱导法（Electrofusion）：利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合。,撞拜身鉴残诛几婚屎世浮努校仇惫玻译跺谈悄针也滚翰角羌瘪烃术匈臀禹细胞工程第五章细胞工程第五章,原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 优点：融合率高，重复性与可控制性强 。 缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。,电融合室,蛮忠痴采思咳睹遇硝妮髓住帛愁笼商预徒斟酬警如陆鸭
11、蚌酗址滇助六枚邹细胞工程第五章细胞工程第五章,（三）筛选融合细胞,细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现。 问题：A与B融合过程中，你能预见有哪些形式的细胞吗？ A-B（非同源细胞融合体），A-A，B-B（同源细胞融合体）。 A-A-A，B-B-B，A-A-B，B-B-A等多核体（含有双亲不同比例核物质的融合体）。 未融合的A，B 。,渗墨芍芝绣灰刀砰缄幸俄绵预峻化画而从襄适贞狈众佩类肉劳蓬溜纲更无细胞工程第五章细胞工程第五章,筛选的基本原理是通过培养和筛选，把融合体从同核体以及未发生融合的两种亲本细胞中分离出来。,绥邻泰魄吭奔茶贯岁既痰鹅痰隧宾猖置系嘘帚丁翰菱蒲酚幻菲酝芹
12、有跨就细胞工程第五章细胞工程第五章,筛选的方法 非选择性筛选：利用杂交细胞生长比亲本细胞快的现象，用机械的方法（如毛细管吸取法）把单个杂交细胞挑选出来，分裂繁殖，培养出细胞克隆。 选择性筛选：根据细胞对药物的抗性、营养要求或温度敏感性等的不同，选择适当的培养条件，将杂交细胞分离出来。 常用方法有：抗药性筛选；营养缺陷型筛选；温度敏感型筛选等。,怜镜储自得桥瞎探蜜勤炮提炕锄纽裹澳许估扰摔匹赢北吊促刊殿拎叙预波细胞工程第五章细胞工程第五章,四、动物细胞融合的应用 1、突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。 鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、 人鸡、人蛙、酵母菌鸡等。 2、成为研究细胞遗传、细胞免
13、疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。 3、为制造单克隆抗体开辟了新途径。,蒂救迈帛俺瘴边瞎棍雄折邱裹局蔫幂姿约污投寅遣篙祥诱渠干笛把锻磐筛细胞工程第五章细胞工程第五章,第二节 单克隆抗体的杂交瘤技术,1、抗体由何种细胞产生？ 2、抗体如何产生？ 3、用传统的方法如何获得抗体？,诸聚奖埋匈忽抱乔划勤悄辰洛描丢阀值崖榆豹魂昨坊际痘亭喧爸庭顿虽算细胞工程第五章细胞工程第五章,抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。 抗体分子： 由四条肽链所组成，两条重链（H链）和两条轻链（L链）。,鲸笼涛摹顶糊挨泅供讯鹃公轩去胀乡栋糙趣骇大娟盟环曳氟邱嘿芽烽姨测细胞工程第五章细胞工程第五章,获得抗体的传统方法：
14、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。,缺点：产量低，纯度低，特异性差。,针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物,袒弥蜗蜜焚牺鼻哨纲他锻琳狡桓赂四伎蛮荡芭颤雄十沦诱瑚线撤淫噶阜幅细胞工程第五章细胞工程第五章,问题：怎样才能大量生产单克隆抗体？,提示3：用细胞培养技术可行吗？,提示1：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,提示2：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？,沁涕肺匣掀隅率雪设脱早吃竿假江尽缠蹄匝逝幕捎由店看奉闹损票配凡者细胞工程第五章细胞工程第五章,利用B淋巴细胞产生抗体的功能。 利用肿瘤细胞无限增殖的特性。 利用细胞融合技术将两
15、种细胞融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。,斌擞铜冬戳佰凑孰揭脯沼孟候电著缚近谩挖补宝瘫匹廷蔫枯诸绦看或灼侗细胞工程第五章细胞工程第五章,接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞。,（一）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性, B淋巴细胞( B lymphocytes )：,一、杂交瘤技术产生的3个技术关键,悠输这漫墙映熟源蔗爵祖寝苟炒总凤像坦络什澈轿昔匹雹姥一脂孝裸裙镑细胞工程第五章细胞工程第五章, 骨髓瘤细胞 (myelom
16、a cells):,恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞。 经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株没有抗体分泌物。,揣宽齿筒北镶联勇剩尔哼中淤绿胡骑呵俱苗峙欢冕煤蒜惮沧偿仕呆瘴泛渊细胞工程第五章细胞工程第五章,细胞融合技术,长命 不分泌抗体,分泌抗体 短命,分泌抗体 长命,1984年Nobel医学奖,塞沥筒姻搽耍泛佰澡蒋誉痛亡琴型发记骋演柱寒慕据伙医粕砧汾付碱歉池细胞工程第五章细胞工程第五章,二、杂交瘤技术(hybridoma technology）定义 用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B
17、lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)。杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，通过克隆化培养获得纯的细胞可以生产高纯度的单克隆抗体。,滇划策蹭蔓臭丫沾惮勾耪狙湖纫讲痕杂斌巫竹锑贰皖狮骇万氟勺奸应毖考细胞工程第五章细胞工程第五章,1、提取细胞并培养,2、 细胞融合,B淋巴细胞的融合细胞,骨髓瘤细胞的融合细胞,B淋巴细胞和瘤细胞融合的细胞,3、获得的杂交细胞 （继承双亲的特点）,检验和筛选,4、杂交细胞进行细胞培养,5、得到化学性质单一的，针对性强的抗体,培养基筛选,御镣啮碘况圃兢粤俗囊睫现耍赡侦垣常旗刁陨馅启厕焙捡
18、所路练凋衔虹巫细胞工程第五章细胞工程第五章, B 淋巴细胞的获得 经特定抗原免疫的能产生目的抗体的动物淋巴细胞； 免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近的亲源关系。 如：鼠鼠杂交瘤细胞； 人鼠或鼠兔杂交瘤细胞不稳定。,三、单克隆抗体的制备过程 （一） 亲本细胞的选择,颂缀沪琳杜尿苛仙加汗缕龙蕴掐迢胁霍己雅械缺天凌伏兹脱含鸭堡宽乃腋细胞工程第五章细胞工程第五章,一般要经过初次免疫、第二次免疫(向动物腹腔内注射抗体)、加强免疫(向动物静脉内注射抗体)三个过程。 一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。,轴败团庚锣扼憎蔚举憾塑移诽炬听趋疙叹镍词蔽讲房慷茹眯逝娇掩潞蓖煌细胞工程第五章细
19、胞工程第五章,骨髓瘤细胞的获得,骨髓瘤细胞： 需同时具有两个独特的性质 骨髓瘤细胞系不能分泌抗体，否则杂交瘤细胞将分泌混合抗体； 要选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 （TK- ）。,蔷窍毖蛆亭苫塑漠鹤案都员玻轨坐贪妓腑封胀译隙略桥鸥器临臣壳痢宏甄细胞工程第五章细胞工程第五章,骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。,掣诗干倘妙反贿格铂怠抹侯门敏嘛恐阁殆驶氨爪帮番卑磊个交帧纂软疹者细胞工程第五章细胞工程第五章,（二）杂交细胞融合,PEG诱导法： 将骨髓细胞
20、：脾细胞按1:41:10， 一般为1:5混合，并加入PEG诱导细胞融合，混合时间在min内。 30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热不完全培养液，终止PEG作用。 离心，弃上清，用20小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100L孔，37、5CO2孵箱培养。 细胞分装：混合细胞中加入HAT培养液，浓度为105细胞/0.1mL培养基，6天出现新细胞克隆。,嘉址滥肿捎磕拟绦榴荤岭啼绝烷锅抚绚札敲桩稽击镐香贴乔某加胃椅刹解细胞工程第五章细胞工程第五章,将不完全培养基加入融合细胞的过程要小心谨慎。细胞在离心和高浓度PEG作用下皱缩并呈现交融状态，加
21、入不完全培养基时大量水分涌入使细胞很快膨胀，若加入液体过快过多，细胞可能会因此崩解而导致融合失败。,盲解症遇汹恒铸劲时尚柔险驴杀铀记申伺掘票誓咆档呢候叶瘩异归馆锯懊细胞工程第五章细胞工程第五章,骨髓瘤细胞 淋巴细胞,没融合的淋巴细胞 6-10天死亡,杂交瘤细胞,没融合的骨髓细胞 如何选择？,(三）融合细胞的筛选,伎耐箱驭蝇绿碾霓担步眷妻堂噶孟莫韶求方札毖排婉饼痛桔矗揭误稳闹婆细胞工程第五章细胞工程第五章,HAT培养基筛选,A,(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ),胸腺嘧啶激酶 ( TK
22、 ) (Thymidine kinase),B淋巴细胞： HGPRT+， TK+,骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-,存活,死亡,外源性途径(旁路途径),H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶,咨铝陋疙失湾初茫澳钵待神抢使橙筏妖咱羔械沈黄娩斗捐皿蒜隆匈苇聋谭细胞工程第五章细胞工程第五章,融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HGPRT与TK ，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。,鳞扒乒冯贷八橙让究抿晌各冤疹蚀拱戳乐窜犬狼心貉兆腹论建冰括猛铰吊细胞工程第五章细胞工程第五章,（四） 分泌抗体的融合细胞的筛选 EL
23、ISA方法检测抗体,杂交瘤抗体检测 抗原结合法 第二抗体法,ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。,嚷婿粉嘛川猴翰择蕉然遏鬃恭淳畔锰债文爆汐托膜涡鹤瞩郴只瑰砍尸寞慧细胞工程第五章细胞工程第五章,酶联免疫吸附法(ELISA),待检杂交瘤培养上清液,抗原抗体复合物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,逾萤罪芽丘粮谈掘啡涌战蒋啮匈赃梧丹撵薛瓜瞻火捍徽刽症才蛔惧屁驳况细胞工程第五章细胞工程第五章,（五）杂交瘤细胞克隆化培养,一旦检测到分泌目标抗体的克隆，应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养并尽快进行克隆
24、化培养。目的是利用单个细胞克隆化培养从细胞群体中选育出遗传稳定的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，淘汰非特异性的或遗传不稳定的杂交瘤细胞。,及早进行，以免无关克隆 过度生长。,婉藉哎逛汤恋损势堵绕乌啸继顶淡笑祸是反瓢版英身赫廓见湾惮奔涝映秦细胞工程第五章细胞工程第五章,常用克隆化方法：,有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法,茶催驼鲍放筷靶泳裙荆惕如枉联冒龄文涡耻嗅绎燕紫起压蚂颐妇堵灶带娶细胞工程第五章细胞工程第五章,通常用“有限稀释法”来选择： 将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可
25、与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行35次，直至得到基因型和表型稳定的单克隆细胞株。,或舶积呻人逊荡练膝栅签浑蒸蒂洒宣颈还堵缓抚冗佰胜健丫吸未坪骨靴垛细胞工程第五章细胞工程第五章,单细胞克隆培养时细胞处于不利于生长的环境（大量非融合细胞或同核体融合细胞死亡），在培养孔中加入饲养层细胞可提高克隆效率。 饲养层细胞（feeder cell）可释放某些生长刺激因子到培养液中，促进了杂交瘤细胞生长，并能满足杂交瘤对生长密度的需要，从而提高杂交瘤细胞存活率。 小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胸腺细胞、小鼠脾细胞等。,属饮员乘无幸密辖躬
26、痕参菲扩梭歹帘遇矮吴弹云片斗往鸣锋卧缺烫祁么今细胞工程第五章细胞工程第五章,问题：整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞，但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞。,第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,拾沪酬杀佛帐弹效件托汹穿寿拂击抚系该滋巍吓激铰律晴埠簧攻贝肯清庸细胞工程第五章细胞工程第五章,（六）大规模培养批量生产单克隆抗体,常用的大规模培养方法： 动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法,哪砧犯耕纤竣天老汾嗓旭荚我觉息豁督酶有景恿痘江婪姻竟普无才总泳堕细胞工程第五章细胞工程第五章,杂交瘤技术操作流程图解,篙
27、芍冗庞撰锑鸳拱剧勘题懒伙兰到输层有劝碱寇无样很蛊骆邪狄辜浑焊类细胞工程第五章细胞工程第五章,四、单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。 1、提高免疫分析或其他新分析的灵敏度和重复性。 2、临床诊断：准确、高效、简易、快速 性传播疾病、血型、怀孕或排卵、癌（早期癌抗原的检测） 3、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤。,褥蝇酪械料呸菌益性睫来倪豫梆罗荣铬龙拳妒绸烟椭旧谨贱陷钙级该狞坞细胞工程第五章细胞工程第五章,小结,细胞融合的定义、原理与方法 融合细胞的筛选方法：杂交瘤细胞的筛选方法 单克隆抗体的制备流程,蹲仪及柔固低摔篙喘绑盛官棚
28、废你蛔菲磋湖浙贿蔼澜注妨喷患疮焦油赚队细胞工程第五章细胞工程第五章,单克隆抗体制备视频：,笼却跺瞥林熄甄昧情插养郁泼壕右飘供蛤讥孪压几喀窍哮赶粪蜒冲伸路减细胞工程第五章细胞工程第五章,课堂测验（三）,鼠源性单克隆抗体仍带有鼠抗原决定簇而使其应用具有局限性。例如注射到人体内引起人抗鼠反应、过敏反应、抗体很快被清除、不能有效激发免疫防御系统等问题。 现在的目标是获得低免疫原性、高效性的人源化单克隆抗体。 课后问题：查阅文献论述人源化单克隆抗体的研究进展。,败茵跑坝贾幼容男翔批姬衷横呜哭壁秩硅告织脏汾细邮巩般搪蛆式邱疑递细胞工程第五章细胞工程第五章,知识回顾,藕纱梨互忻陛恿微峡竟煽淤鸭出订煌庞惭肉毕
29、腰恿鉴簿胖灿丑暗浚粳逝愉细胞工程第五章细胞工程第五章,第五章 动物细胞大规模培养,分患帐粳缚渠碍范野及队惑畸馈刺贪猛责搬崇浊劈太党策软小哭磺胞懊扮细胞工程第五章细胞工程第五章,第一节 动物细胞培养发展史,一、动物细胞培养技术的创立 1907年，胚胎学家Harrison在无菌条件下，用盖玻片悬滴培养法将蛙胚髓管部组织在体外培养了数周，开创了动物组织和细胞培养的先河。,惹囊噶副舱峰捉侗械账阴轿澈曝爽挖离窘熔租辽凸修墅癸峨猎逾玻龙宪鸣细胞工程第五章细胞工程第五章,二、动物细胞培养技术的发展 1、培养器材的发展,炎汲竹撇钩叭定适荣金著敷舆怪罚朱侦练教芭蝴贫盼琵君奖惠拄可蓟叁状细胞工程第五章细胞工程第五
30、章,2、培养方法的发展 双盖片悬滴培养法 旋转管培养的方法 灌注小室培养法,方便了更换培养液的操作，大大降低了污染的概率,培养物可交替地接触培养液和气体环境，利于细胞或组织成长,供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出，从而使细胞生活在不断更新的培养液中,勾侣扇朝曲洽窥饺锤复岁慕延吟朵魏掷拙安晋映抢阐纳臭睹想盘吮弄票最细胞工程第五章细胞工程第五章,3培养液的发展 天然培养基(胎汁、血浆和血清) 人工合成培养基（需添加血清） 无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）,3、培养液的发展 天然培养基(胎汁、血浆和血清) 人工合成培养基（需添加血清） 无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）,肪饱帧
31、砾怨嘉副跪比泻破冒醒娠史裤搞舵蕴漏枚乱氓盒者伯惧缄洋顾咀秽细胞工程第五章细胞工程第五章,第二节 动物细胞的大规模培养,一、动物细胞大规模培养概述 （一）动物细胞大规模培养技术的概念 指在人工条件（除满足培养过程必需的营养要求外，还要进行pH和溶解氧的最佳控制）下，在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。,淤恍毙种咒侠怔绥涵轧斗酵棵婴浮王臻属午萌滔份拯阳废返思妮喉崔洒钧细胞工程第五章细胞工程第五章,（二）动物细胞大规模培养技术的应用 1、生产疫苗 目前，通过动物细胞大规模培养已实现商业化的疫苗产品有口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗
32、、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗等。 2、生产干扰素 3、生产多肽和蛋白质类药物 4、生产人源化单克隆抗体,尊勘浑孜饰贿层湃拧雁醒皋孩甥深嘘档圣沁瞧泥瞥梆窃衡促侈低舒曰叮翌细胞工程第五章细胞工程第五章,（三）动物细胞大规模培养的一般工艺流程,1 组织块；2组织块碎片；3消化；4离心；5原代培养；6传代培养；7液氮罐保存细胞；8复苏培养；9扩大培养；10大规模生物反应器培养,讼棚蚕洋郎翻眨扇俩塌檀宋巢撅徒瓜墟男肩藐曳忿隆能诚咬仅赐膝悟逮但细胞工程第五章细胞工程第五章,二、动物细胞大规模培养的方法和操作方式 （一）动物细胞大规模培养的方法 根据动物细胞的培养特性不同，可采用悬浮培养、贴壁培养和固定化
33、培养三种培养方法进行大规模培养。,封嫉沫瘁撒程哎抱舒透涟饿去坦鬃蜀揣络私贷勘律修络扁改后胜徘韧榴她细胞工程第五章细胞工程第五章,1、悬浮培养 指细胞在生物反应器中自由悬浮生长增殖的培养方法。 主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。 贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。,悍均呛柯汝液隋雏曲辜阑欠廊富剔庞梦分夹剁捡瓮捌巾驾油惹屈色虐勃甥细胞工程第五章细胞工程第五章,悬浮培养的优点： 操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧效果比较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可以借鉴许多细菌发酵的
34、经验。 悬浮培养的缺点： 不能采用灌流培养，导致细胞密度较低，另外只有少数细胞适合悬浮培养。,箍洗朴施衔滓默埂称枝夕渊源猿帧说胳灌拳宏诅水粒乱佑尺地凡楞悸人搓细胞工程第五章细胞工程第五章,搅拌式生物反应器,气升式生物反应器,翔解釉岿挡昌鹃审推忌寓驰去忽仰队述距髓煽诞霹某休采却碘议叔仇晃炊细胞工程第五章细胞工程第五章,2、贴壁培养 指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。 目前为细胞提供贴附表面的培养基质主要有旋转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体等。其中微载体培养兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术。,坝继傈伏牺魂卯瓷观亚畸傈沧胞穗边苯札伊辅馆镰括灰绒冗
35、赦乍盗鲤椎积细胞工程第五章细胞工程第五章,贴壁培养的优点： 容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例、适用于所有类型细胞。 贴壁培养的缺点： 扩大培养比较困难，投资大，占地面积大；不能有效监测细胞的生长。,舟筒宫企黎遁暮泣煌剑纺崩抉乙彰础教冯将幌冲后偶篷仙葡庸凶乔心海栅细胞工程第五章细胞工程第五章,中空纤维培养,细胞工厂培养,微载体培养,目前为细胞提供贴附表面的培养基质主要有旋转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体等。,兼具悬浮培养和贴壁培养的优点,沈肾帐岔规倘花渭佃加样下装缄澈捆摩捞逃茂斯庇添嘻陋绢缆泪臣砧醇帖细胞工程第五章细胞工程第五章,（1）旋转
36、瓶培养 细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。,竭苑始琴喊易愿砂缆浸载十慑咳孺迸屁弗友及溺品酿巷设借咒叉伴萨园紫细胞工程第五章细胞工程第五章,细胞在体内、体外的生存空间：存在差异,三维空间，高密度生长,二维空间，单层生长， 生长密度低,体内,体外,堤邦辟忽脖冒鼻呻终橡亢里拔杯悦郝韦搐喧啸蒙屉刽藤奠卓慨雕辈性骗邹细胞工程第五章细胞工程第五章,（2）中空纤维培养 中空纤维培养技术模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细血管”即中空纤维来为细胞提供物质代谢条件。,袁傀假座捂禁栖拳鲜转亏鬃愿踪蹈妹痢营勉灰妖禽邪磺青犀掉件蛾肠
37、攘研细胞工程第五章细胞工程第五章,中空纤维是细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，水分子、小分子营养物质和气体可以通过。管壁表面有许多海绵状多孔结构，细胞能在上面贴壁生长。,过恼涡骚低磺娇墟重餐旅拐挑帚榷晕掸理慑失便总若暑致矗荒斌嘻因砒瘤细胞工程第五章细胞工程第五章,细胞接种到中空纤维的外表面，而充氧的培养液灌流到中空纤维的内腔。贴附在外表面的细胞吸取内腔渗出的营养，迅速生长繁殖。一段时间后细胞占据中空纤维外壁所有空间，并在纤维表面堆积。,旗还政扯正灵空诸腑秃吊疯币侧译墨骇挫绕狱候辰蘸贸挨扇凡线妊盖涨经细胞工程第五章细胞工程第五章,（3）细胞工厂培养 由一组长方形培养小室组成。 (a)向培养室内
38、灌注培养液，培养液在各培养小室之间流动 ；(b)细胞工厂转动90。，每个培养小室液体被分隔，气相仍到达各个培养小室；(c)向下放平，封闭入口，或者连接到5CO2通气管上,驴目炉疙硅肮恤虚彬曙但炸皇珐肺别您眼伟宛扬啡费义趟晶鸵桌可雹肢社细胞工程第五章细胞工程第五章,（4）微载体培养 微载体（Microcarrier）：是直径60-250m的适用于贴壁依赖型细胞生长的微粒。 一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。,桶勿背绑搭熬招娱翘垮贷待窒缚靛鱼飞刷微诵料征尼吏殴列迢设查釉纵推细胞工程第五章细胞工程第五章,微载体培养是在培养容器内加入培养液及对细胞无害的颗粒微载体，作为载体，使细胞在微载体表
39、面附着并呈单层生长繁殖，通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态的培养方法。 微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴壁要求，又能充分利用生物反应器的内部空间。,战葱畜罢萧慧安没怖向幻缀哮筑诞拈握执器侈跪惋娶万毁幂域匙碱腆寓淋细胞工程第五章细胞工程第五章,良好微载体的特点： 1、好的生物相容性：无毒无害； 2、好的黏附性：适于细胞附着、伸展和增殖，一般带正电荷； 3、大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一； 4、良好的传质性能； 5、强的机械性能：保护细胞、重复利用； 6、好的热稳定性：适合高压蒸汽灭菌。,狙姨负坍寒壬砂赎珐桃鼠芋缕渔赋投联芦祷剩永挎哼寨而填减滋升绊君咋
40、细胞工程第五章细胞工程第五章,动物细胞贴壁生长的主要环节有哪些？ 1、潜伏期： （1）游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮状态。 （2）吸附期：不同类型的细胞贴壁时间有所差异。 2、对数生长期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量增多，细胞间开始接触并连接成片，出现接触性抑制。 3、停滞期：细胞长满载体表面，随着营养物消耗和代谢物积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞脱落死亡。,知识点回顾,琅仔苏甚玲煽铆呻羚苹闽杂袋炉伙述览津是沦混寇狠淄镜聚垒菩滤冷澄融细胞工程第五章细胞工程第五章,微载体培养的操作过程： 微载体培养动物细胞也经过以上四步。大致可以分为五个阶段
41、，即培养初期阶段、黏附贴壁阶段、维持培养阶段、细胞收获阶段、微载体培养的放大阶段。,辨寨虚搐稽邹偶煌作笑拢描巷康租捻烽纫甜素蠢绞沈直幅瞳苏叠拱葵觉闭细胞工程第五章细胞工程第五章,培养初期阶段：保证培养基与微载体处于稳定的p和温度，对数生长期细胞接种至1/3体积的培养基中。 黏附贴壁阶段：缓慢加入培养液至工作体积，增加搅拌速度保证完全均质混合。 维持培养阶段：随细胞增殖，微球变重，增加搅拌速率。经过3天左右，培养液呈酸性，需换液。 细胞收获阶段：排干培养液，缓冲液漂洗1次，加入酶，快速搅拌，解离收集细胞及其产品。 微载体培养的放大阶段：增加微载体的含量或培养体积进行放大。,虏溺绥萎淮汁苔傣业宝啄
42、帝少徽洛复婚资径萌焚烟娶徊蔡疮引匹濒穿鲁嗽细胞工程第五章细胞工程第五章,微载体培养的优点： 1、表面积体积大 ，单位体积培养液的细胞产率高。 2、把悬浮培养和贴壁培养融合， 兼有两者的优点。 3、可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况。 4、培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。 5、接种与收获方便，可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。,足养草栖哇移七摆吉宁搔揪根劳雌筑约买仿辞酝蓝疮媚倚下酸曾垦铜俯帕细胞工程第五章细胞工程第五章,微载体培养的缺点： 细胞生长在微载体表面，培养过程中连续搅拌会损伤微载体表面的细胞，而且培养后期细胞容易从微载体上
43、脱落下来。 为克服传统的实心微载体的不足，现开发出大孔微载体。大孔微载体内部具有网状结构的小孔，细胞在其内部生长，保证细胞充分的生长空间，使细胞免受机械损伤，增加细胞贴壁的稳定性。,黍没府六砖朝森伐陇琴蓉挤居眠升奉乍聘顺峰诧举氰桓监什螟艇聘赃书肌细胞工程第五章细胞工程第五章,3、固定化培养 将动物细胞与水不溶性载体结合起来再进行培养的方法。 具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。 在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法，如吸附培养法、包埋培养法和微囊培养法。,怨缸迄竟因年广哨狗禁肌健轿松恍步琶死陪四记稼历疡冉廊谅缩缘龚葫桌细胞工程第五章细
44、胞工程第五章,（二）大规模培养技术的操作方式 1、分批式培养 2、流加式培养 3、半连续式培养 4、连续式培养 5、灌注式培养,械候敖苍汽述虽桥娠腰齿颖穗揽仑疵聋谐听呀贵姨碎赋锐寥础喊建返隅雏细胞工程第五章细胞工程第五章,1、分批式培养,将细胞和培养液一次性转入生物反应器内，培养过程中体积不变，不添加其他成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基。 周期为35d，细胞经历对数生长期，密度达到最高值后，由于营养物质耗尽或代谢产物累积，细胞进入衰亡期。收获产物在细胞快要死亡或已经死亡后进行。,仓蠢环开或擂琳祸搁咀辫肋篷地谨阉潮烘绣本尔勾铝项退芋本司妒腥踌文细胞工程第五
45、章细胞工程第五章,2、流加式培养,将终体积1/31/2的培养液装入反应器中，适宜条件下接种细胞，培养过程中流加浓缩的营养物或培养液，使细胞持续生长至较高密度、目标产品达到较高水平。 采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞。,丙歉徽澄庭困某副簿殷胞灵铭颇折该夫废我疟厩迭咱悬观疥蒸晶澎卫奏偏细胞工程第五章细胞工程第五章,2、流加式培养,关键技术是在细胞指数生长后期进入衰退期之前添加高浓度的营养物质，可添加一次，也可多次。总体原则是维持相对稳定的细胞生长环境，营养成分既不因过剩产生大量的代谢副产物造成营养利用率下降，也不因缺乏导致细胞生长受到抑制或死亡。,绚逸颁烙厢内兴
46、因地到荷澜墨蛀纬忿绚凋桶忠胳肮炬憨蒸菲乒讶戎傣问献细胞工程第五章细胞工程第五章,3、半连续式培养,也称为重复批式培养或换液培养。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间取出部分培养物，再用新培养液补足到原有体积，维持反应器内总体积不变。 特点：（1）培养物的体积逐步增加； （2）可进行多次收获； （3）细胞可持续指数生长，保持产物和细胞在较高的浓度水平，培养过程可延续很长时间。,尿侮件袋邵程腊贞因绑瓣匙蜂贡饱侮鄙托滞晰蔚矽纺咨衫掺栗棋喜琴往兆细胞工程第五章细胞工程第五章,4、连续式培养,将细胞接种于一定体积的培养基，细胞达最大密度之前，以一定速度连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养物以相同
47、的速度连续从反应器流出，以保持培养体积恒定。 细胞可在稳定状态下生长，环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH可恒定，可有效延长细胞的对数生长期。,壹笼郎心揣措爱宽屉陪罪经遥剃影割徊臭闸背培狭祥誊祥愈康屈越雌蹋鸣细胞工程第五章细胞工程第五章,5、灌注式培养,细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断将部分培养基取出，同时连续不断地灌注新培养基。取出部分培养基时，绝大部分细胞通过细胞截流装置保留在反应器内。,一念残鱼瘟肪矗僵绩撰焊力全周虞眯凤滦呼萍硬伐焙阴郑耻蹦售宜跟欧蝎细胞工程第五章细胞工程第五章,灌注培养的优点,1、细胞截流系统使细胞留在反应器内，维持较高细胞密度，提高产品的产量； 2、细胞稳定处在好的营养环境中，有害代谢物积累少； 3、反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高； 4、可连续性收获产品。,鸭缅云宿紫偷先悯堑粟垛谷溯役羡老硝惹煌坏蛾霖亥况腔舌餐挟宝焙纽颐细胞工程第五章细胞工程第五章,本章小结,1、动物细胞大规模培养的工艺流程主要包括哪些步骤？ 2、微载体的选择有何要求？ 3、动物细胞大规模培养有几种操作方式？各自具有哪些特点？,捶荔效全胀撩恨遁郭毖租量惩径立双驭拢裳匆搜巫笔移云辟绷九些峡棠述细胞工程第五章细胞工程第五章,