第三章基因工程制药1生物技术制药.ppt

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1、第三章 基因工程制药主讲 李校堃温州医学院药学院生物制药教研室,晕陪哆邦嫩袁销堕溅扯潜幕遏严托态衬皂授皇塑哑遗备塘铲乡存赘呕幸场第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第一节 概述,意义：自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基因重组产品人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经

2、济效益。,噪逼甭冲限批姜狸邑吓妈嚼罕亚病劝棚忙杰噶箍董赴荔谚婪外飘落叼裴赎第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,基因工程技术可生产的药物和制剂包括： （1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； （2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子； （3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳； （4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。,蹦老嚷恋臼惮谴传晰凭桥溜涣熔哪兄四达西和汲壹迫鸥牵匙戳篙兆负雾烃第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,基因工程技术生产药物的优点： （1）

3、利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的引用范围； （3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质； （4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去; （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,茸碌郴抉拴酌漠获狭蔽环吕吠颖听萄敏庶挚毒识英卷奠涣们隙四但臂坎点第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。1b

4、型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。,就攒镁犹蜂笑旧琢僵勇木透芳疡挥晕巢审韵烬垄甫垒扳掂唤浑甫娃敛拢忿第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第二节 基因工程药物生产的基本过程,定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因再工程菌内进行复制和表达。 基因工程药

5、物制造的一般流程： （1）获得目的基因；（2） 组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装。,侠职汐吗熙酉赤言寒疼痕芳渍蹈碑纳阎酣蜀裕干牌糟支絮跃颊堪滇反殖羡第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的（1）、（2）、（3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。 2、下

6、游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（7）、（8）等属于下游阶段。,克室犁忧光款酬亢颧廉钩祷藩正殊玻慎笆采失靶操墩趁祸泅无坎济浇氧驮第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第三节 目的基因的获得,一、逆转录法 逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 1、mRNA的纯化 mRNA的特点：3末端含有一

7、多聚腺苷酸组成的末端。 方法：亲和层析法 2、cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 用放射性探针法检测。,擅钒矽覆柯典狄篡爸髓串糊棚瘁趁宫窝蛛诀橇似那泥察哄还更料吹声幸搐第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,3、cDNA第二链的合成 以cDNA第一链为模板合成第二链。 4、cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。 cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法：

8、 加同聚尾连接：在载体和cDNA的3末端加上互补的同型多聚酶序列。 人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。,础仲瓶憨至充绅埋慰谅除躁程水贿寞煌谎趟锅鲁获藻夜侮断存汁潮弄色暇第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,5、将重组体导入宿主细胞 6、 cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 （1）核酸探针杂交法 （2）免疫反应鉴定法 逆转录聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。 二

9、、化学合成法 前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。,绪腊气稻诚芋帅恿惹啃茫舱陌劣宅幻魁饼坚填神蕾咬立槐亩碳徐因善泌葵第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,操作：见书 限制：一、不能合成太长的基因。 二、人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难。 三、费用高,敢勉滨摈陶逸人怂倘硅圈色斗此本剑滤坷清啄地陌辣非冻狮拒疆用烹县优第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第四节 基因表达,基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以

10、及所有加工过程。 基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。,基因表达概念的示意图,柜钒裁隐溜趣磐塔层伙煞娠锤恋烦仍汰照注眷洁视敖惹嗽艇激威咐察攒蟹第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,一、宿主细胞的选择 宿主细胞应满足的要求： 分类：第一类为原核细胞，如大肠杆菌等；第二类为真核细胞，如酵母等。 1、原核细胞 （1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。 （2）枯草芽孢杆菌 （3）链霉菌 2、真核细胞 （1）酵母：酿酒酵母应用广泛。 （2）丝状真菌 （3）哺乳动物

11、细胞,抚记怒挨疚命谦鸯嗓跑琳灌岿巨终鱼胰践撞以陪填砰扩母扼潮限艳百瘟畴第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,真核生物和原核生物基因表达过程示意图,顷幢萧阉丁虫讶第藕点愧揉蛇纯豆纬慎归识价楞泰偿衅娜残访孔渡努涡忽第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,二、大肠杆菌中的基因表达 1、载体 表达载体必须具备的条件： （1）载体能够独立的复制 （2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 （3）具有很强的启动子 （4）具有阻遏子 （5）有很强的终止子 （6）有翻译的起始信号 常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统,刽带仿站忠烩加秦忆

12、需泛肮妮榷吮痒岭页阵赴络胚斥痕漾害搜帖羽涝武入第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,几种常用的 大肠杆菌表达载体,嗣貉伺数妮皇土奉君挎躁个臭缉罗黎电奏凌账患痞购褂守烽紧吁德陵舱鸟第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 启动子的强弱 核糖体结合位点 SD序列和起始密码子ATG的间距 密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢负荷 （5）工程菌的培养条件 3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式 （1）以融合蛋白的表达形式表达药物基因 由一段短的原核多

13、肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因 （3）分泌型表达蛋白药物基因,挂箭咎口兵鳞拱遂赎馏幂粮药屁桨垮吴秀指烦氛推凉数售祷弟矩肠春泳或第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,三、酵母中的基因表达 1、载体 （1）载体的复制序列 包括YEp类、YRp类、YRp类和YIp类。 （2）克隆载体 由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。 （3）表达载体 包括普通表达载体和精确表达载体。,重组酵母表达质粒 pPIC9K/VP1的结构示意图,陪延近哑榷索裕匈镭棱豹黔级弱钓惑厚义垃赦襄

14、缩账帅貉呀载焉翠斧均衡第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。 （3）外源蛋白的糖基化 （4）宿主菌株的影响 表达用的酵母宿主菌应具备菌体生长力强。菌体内蛋白酶要较弱。菌株性能稳定。 分泌能力强。 四、动物细胞中的基因表达,枕圣锭方珍跃棱夫朴邵猖粥鄙肉杂拣漫汁熊圆荚静搜叭帕骑卉声腰板挛咳第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第五节 基因工程菌的稳定性,基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和

15、结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。,常用的基因工程菌种， 以及带有质粒的菌种,咖疑庭谗商佳申靶莱吨滋蓬荆伙缺惋儿腺首宋卉凤将鸡盅脊碱刘模测畏妓第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第六节 基因工程菌生长代谢的特点,对菌体生长的调控主要有两种观点：一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；另一种认为是小分子前体和催化组分等等的限制决定了菌体的最大比生长速率。 一、菌体生长与能量的关系 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副

16、产物乙酸。产生乙酸的机制还不完全清楚，一般认为是由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化为乙酸来供能。高浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。,屯锯啄佯拟涣汇梅头要彝睦聂耻宁庭芥瘩钨沧释污农软蓬中看枪郑帆即叫第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，

17、以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。 二、菌体生长与前体供应的关系 由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子和合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主,址霸溶矛坊榔条锨还翅钡尸恶枣历禾捣始肠铬斤姜喜纽龟靴摧苗囚跨顽潭第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因

18、的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。 “严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，合并称为“魔点”的ppGpp的结果。,胞和瓜嫉渤讲又禁拣嫩吹鞠析滩侍敦椽愁咋墟纶遵蓟尧粕留供挫乳炭苇谱第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第七节 基因工程菌发酵,基因工程菌的培养过程主要包括： （1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； （2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。 一、基因过程菌的培养方式 常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。

19、 1、补料分批培养 将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。,辩搽眯惫伴堆杆肺层啥被饯缀赴较挚踩诱甫纽堪彝肇钳嵌骇目喷郡铣或砸第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第七节 基因工程菌发酵,基因工程菌的培养过程主要包括： （1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； （2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。 一、基因过程菌的培养方式 常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。 1、补料分批培养 将

20、种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。,酗蚂欺湖分羊莉辞甩乾辊墟椰恫豪我豪施惦躯趾峪绵揭张玫浑荐颁账篓惋第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,2、连续培养 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。 3、透析培养 利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。 4、固定化培养 二、基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1）生物材料方面（2）生产目的方面 1、培

21、养基的影响 常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。,薪醛福祸蜜尔棒撼陷后言固辩睬噎聂钮当卜减醋瓦衫原洛薯旭追伯菜烛崩第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。,培养基及灌注式细胞培养袋,垂聋唯嫡悸喂兄砚养窄冕赤掺傣敷崭徘泼赠颗仟奶冲料济龋憎胰疯则侄臼第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,2、接种量的影响 接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，

22、不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。 3、温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。 在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。 温度还影响

23、蛋白质的活性和包含体的形成。,姥唐疤霄圃排粉强邻穷瑚桔骗樊毙谅苔弊哎民柒旅刻怪坟亮稍段藩洋狠窑第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,4、溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 5、诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 6、pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 总之，工程菌发

24、酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。,床虱掐寂垫棺蔓供咱炙敞贪又况焚趋焉钩溪妆氦铬钾倍诣综饲芝孪埂惹酚第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,三、基因工程菌的培养设备 发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。,犊停胎混乳筏翼医虐笔洒谷鲁徒隐球燕吸选捻卤摈棍份渗率剧远忱蒲件折第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第八节 基因工程药物的分离纯化,许多医药生物技术产品都是活性肽或蛋白质。这些产品的制得

25、具有下列特点： （1）目的产物在初始物料中含量较低（2）含目的产物得初始物料组成复杂，且影响较大（3）目的产物得稳定性差（4）种类繁多（5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。 因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。,肪凡掺乱识兹泳酚皑束暖末我有隆猛谷网汀擎蛮檄瓮疥盯姆健长歇劣胞侈第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,一、建立分离纯化工艺的依据 1、含目的产物的起始物料的特点：包括（1）菌种类型及其代谢特性（2）原材料和培养基的来源及其质量（3）生产工艺和条件（4）初始物料的物理、化学和生物学特性

26、。 2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量的要求 二、分离纯化的基本过程 分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过45个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。流程如图37所示。,托竿歉小镍仑久蓟藩旧酶刀尖窜匹脱噎抗或铬赶推菩噬袭锦容段军刁挡了第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,重组蛋白表达及分离纯化技术平台,基因工程药物分离纯化生产装置,氟潭爪熬运埂逆隧贬疑孙缘遵咏炭微不纲鲜落丹桩蜡周焕咽健温毙酣躲亲第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,三、分离纯化的技术 分

27、离纯化技术应满足下列要求：（1）技术条件要温和（2）选择性要好（3）收率要高（4）两个技术之间要能直接衔接（5）整个分离纯化过程要快 1、细胞破碎与固液分离：有细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。 （1）细胞收集：细胞收集常用的是离心分离的方法，膜过滤法液逐步得到广泛应用。 （2）细胞破碎：有机械破碎法和非机械破碎法。 机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法 非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。,舜辗脓必弓贿宴蓄展芭戮衰鸟苹纺攀寥鲁稿扯脊赋酞募巳钓顺茨孽袜溺礼第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,（3）固液分离：离心沉

28、淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。 2、目的产物的分离纯化 主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱。亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。 蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性，他们对分离纯化的影响见表33。 选择纯化方法应根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。,丘溉悔傻蛾车葱饺胶氰馆头缉私灼陶衣闰营皑削亡呆孩平椒遁腮待闯湛哥第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,（1）离子交换色谱（ion exchange ch

29、romatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。 蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。,惨剧犹欧盒志燥慈羞歪参来瓦昔阻锻烃沿叛椽潍洲私焙意抗且素弹岸梯和第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,（2）反相色谱（reversed phase chromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography,HIC） 反相色谱和疏水色谱

30、是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。,鞠洒仔泳跑整溺派晌被栗硬脊履敏楷蚁急爽豢笑铁卿材茸鹊赛彼热儒惭修第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,（3）亲和色谱（ affinity chromatography,AC） 亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的 。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。,轨矗谅托枫侣辐秦法析徊捏琉苹恼航恭屉去展血蚌尼会选琵析睛级琴咸踪第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,（4）凝胶过滤色谱 凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质

31、，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。 3、非蛋白质类杂质的去除 非蛋白质类杂质不应忽视，在纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质，它们是DNA、热原质和病毒，常用的分离纯化方法见表34。 （1）DNA的去除 （2）热原质的去除 （3）病毒的去除,帘传胳赚断膊敦胯企滦昂爬诉媚每屡磁吕瓢茫叭迅驯愉翌摈拔缺汝涝假曙第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,四、选择分离纯化方法的依据 1、根据产物表达形式来选择 2、根据分离单元之间的衔接选择 3、根据分离纯化工艺的要求来选择,编抽单放可秘良醚舞呸

32、辉聚位剃硒倘巍赴抄庆赊淖祝涂减险楚葡继纂狡赏第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第九节 基因工程药物的质量控制,一、原材料的质量控制 原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。 二、培养过程的质量控制 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。,抬咽尘儡蜂佰半孺排民诞介铃臆电露哎银方糊卯柯著卵迅机躁阶挺卓码纳第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,

33、三、纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、DNA与热原都控制在规定限度下。 四、目标产品的质量控制 基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 1、产品的鉴别 （1）肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。 肽图分析结果与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。,弘赛这鸥敌傀锡涎毫象卵挤袒翻荐裴生床枷钱胎腥览戌和倡棕揍履恨那斩第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,（2）氨基酸成分分析：对目的产物的纯度仍可以提

34、供重要信息。 （3）部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。 （4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定： 浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林酚法和紫外光谱法等。 相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDSPAGE法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质相对分子质量，而SDSPAGE法测定的是蛋白质亚基的相对分子质量。,轴绢于歌屋肚条雅檬绎腥刷帜贴锅山簇龄坐疫嚎搅轮敝膨乏弄涝卓倚痈娘第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,（5）蛋白质二硫键分析：方法有对氯汞苯甲酸法（p-chloromercuribenzoate,PCMB）

35、和5,5二硫双基2硝基苯甲酸法（5,5dithiobis2nitrobenzoic acid,DTNB）等。 2、纯度分析 纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。 （1）目的蛋白质含量测定：通常采用的方法有还原性及非还原性SDSPAGE法、等电点聚焦、各种HLPC、毛细管电泳（CE）等。 （2）杂质: 蛋白类杂质：主要的是纯化过程中残余的宿主细蛋白。它的测定基本上是采用免疫分析的方法，其灵敏度可达百万分之一。同时需辅以电泳等其他检测手段对其加以补充和验证。其他的蛋白杂质也要严格控制。,膀极卢老拼葡沉魄疆滥拓微肤梯得微行阶瑚慈箩美碰螺问剁

36、循橙醇照块敬第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,非蛋白质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、致敏原及DNA。 生物活性测定：需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。 稳定性考察 产品一致性的保证 五、产品的保存 1、液态保存 （1）低温保存 （2）在稳定pH条件下保存 （3）高浓度保存 （4）加保护剂保存 2、固态保存,琳酥褒瞪饼咋慈煤括裔涪多厉曼籽搬胶狱铬呻间恬福尖修悼脏浊竣订陌廖第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,第十节 基因工程药物制造实例,址惋叛惭璃肯唤屡乳独棱限惶谴驮画桓狱晃都溶语幌胆盆面转埠篓纽震昔第三章基因工程制药1生物技术制药第三章基因工程制药1生物技术制药,