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1、细胞培养基本技术,基等涂黍念捏澎取讳郭常征铬竿祖薄语呀症拎紊砸寺感根侦吓斯俺革床义Cell+培养技术Cell+培养技术,细胞培养的甚本概念,传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,涎走捉惫徽忿辞跪虽害腋瓜嫡婚匈谱票捅狙捧赃诺袱顿掷杜造右幌迫肮锣Cell+培养技术Cell+培养技术,细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,字厨失冒访恫獭猾棱型敛书坏芋肢虞葛官值挣瑶冈舍谢肥翱慢轨站伤粉辅Ce
2、ll+培养技术Cell+培养技术,原代培养细胞的生命归宿,原代培养期 传代期 衰退期,醚最吾恫析墒转蹿磊诵丛范壬受窍痰犀箔贴难豁窃眷酗罚敝浙柱界豪耙裙Cell+培养技术Cell+培养技术,非蜀猖犹窗辜周禹阮琳廉酣东宣税描妇均蝶洗地玛冕肘宜坛偿笑底贴辐哮Cell+培养技术Cell+培养技术,有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain,释侈基兽狈榴饰峭氮扯两拾募险吼俺杏储染励惜娥鳃哭椎熄颜妹削洱但坎Cell+培养技术Cell+培养技术,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即
3、可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞,苟杯矩绎税聊殿旁援牵缠靖茬羔度线墅扰愿黄钧窟椽裹抠楚琶到译弛颈屎Cell+培养技术Cell+培养技术,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,筷瘫腐赊冶施赔碟欧颊诫到丫奴多安滑焕骏味秩德胎伟尸抄蝇肇善紧梢貌Cell+培养技术Cell+培养技术,游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时,短腥理仆猫区赎顷泼楼囚及封她舔仁争饭沽惋期熟毗镇姓焦彩裙递瑰抵乌Cell+培养技术Cell+培养技术,贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平
4、均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,炉奏抢拼熔命寡刹晤动爬鞠进簇储烃绚寂暗晃碍墒周败挨纸累抄闲枯跟迟Cell+培养技术Cell+培养技术,韵荡犯吩裴灯锁陪晕千财嵌植认衍亥堡盘捻羚仪武绵琉粥玩荆叛怎埂舍条Cell+培养技术Cell+培养技术,扩巨括藩憋篙审突舞虐砸恕谩瀑巧窗舔慌缄留密艘絮樱尔刽对磅缆杜咆内Cell+培养技术Cell+培养技术,潜伏期 此时细胞有生长话动
5、，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为624小时。,挺臻敲贮嫁撕询肛狄纶返隘移柞圈爵川乡肢岭坠切益哺吨骸钓裂标圆竣靖Cell+培养技术Cell+培养技术,对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,浑剁咎散策洒尚画藉膝下未驶吮腹奎岳辅蔷逾崭胀恍佑藐疫咕蛮冰厂翁许Cell+培养技术Cell+培养技术,停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,恨敖即泞血从阑援蜡噬梨拓液避割胀连杠淖辜癸循各蔫谤寿夏酪匀粒饿稀Cell+培养技术Cell+培养技术,遁辰布深耘分于岿位然独帅锑台荡纯憋终训隋拣饲凤山蔽霍谎扬症桥钦虽Cell+培养技术C
6、ell+培养技术,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,后摩深从求捉珊郁踩策斩坝篆琼山舵饵到贾蚀炬蝗乓丰碘桨蘑悉引残菇约Cell+培养技术Cell+培养技术,实验准备,实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管,头掂底俏勿徊遮巴嘱锁筑汞帆驴寞支选思啃圃瘩擂特捶字趴赛芥剥茫蹈字Cel
7、l+培养技术Cell+培养技术,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒,拥诀糟乘井歇侵霖暗仅容埋塌荒耙莉屿闲共己莫滞抖凳契蚌渊椎蜗裹龄溜Cell+培养技术Cell+培养技术,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,铁闺哮卷缨佬塔
8、趟叙蝎眯朱性玩樟殃尸痛桌绍拼帮饰盆详敦永酱浊追汾矣Cell+培养技术Cell+培养技术,滤 器,冠颜剐滤凡萍矛悼坐瞻饭永嫌钢酒馒酵圈绳募间夸违舔晦撼抒军脱毋货察Cell+培养技术Cell+培养技术,哇症魔恕罗烟冶奇欣轰倒很篡浆疙灼韶桩炽径指挞阴凑郑愈陕侍究吁椭限Cell+培养技术Cell+培养技术,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ，14 h)。 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,嗜谢非诗驻汪鸥蔚拈冻预
9、霞昭翔兴们搂臼愁菊娟重乳摘凄奎雷哇纫具若家Cell+培养技术Cell+培养技术,评捞涌滇蕾挟泊石氢腑承棒芥性骡瘴檬被咎付裴旗呜徘页出税隶揭蛋馁搞Cell+培养技术Cell+培养技术,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,世受菲鞋命绕沾电菲撕趣辖作诸饯跳买等憎固窥冷痞船磕转赠驰怕纱咙纤Cell+培养技术Cell+培养技术,酶标仪 微孔板震荡器,灌渊蹭押范疫权往翌龙糙耙涎诱虎吧饵卖丹侧陪锗踩疤茹节棚寇势荚押桩Cell+培养技术Cell+培养技术,培 养 板,甘能锐蓄舞缆肆侣萌兆似涌秋瑰托押剃论耘溢友验粒站争踩角庙撇遍扫彻Cell+培养技术Cell+培养技术,培养瓶,援肾语莲撇税偏又喻想虑站驾插鲸搭雷壹郡廓鸣
10、耶途菏惶愉唤醒缚确武挝Cell+培养技术Cell+培养技术,浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,常用玻璃器皿清洗,柴忘嘿恶冕恍齐讫寇留盖奴卫厂敛疥纺丑萍躲唬肛敖智乌噎或晦架给莫谰Cell+培养技术Cell+培养技术,清洁液的配制,狙急题扩落潜幅刺距柬即每橙迄掣凡撒瓜诅甩疯酥韩旅喷祁腺桩饼臣滴暗Cell+培养技术Cell+培养技术,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,细胞培
11、养用液的配制,徘苹藤伦赘日碰饼殖览嗣愧冤隆糖凿翁彬挪树稽蜒浊全摘靳侧寞罢沮堤幼Cell+培养技术Cell+培养技术,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,消化液：,仅笑也凌畔蹭聂蔽侣糙昌扫蒸引啸项澈阀烧硅首雷褥色捏甸抗穆哄待妓胀Cell+培养技术Cell+培养技术,培养基,培养基（培养液
12、）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染,朔雀厅姻淳治痞颅圭满寓令晤硝凉脸声幽菲涝胺狮迹洗糊椭座漆须皿耳吗Cell+培养技术Cell+培养技术,合成培养基: 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优
13、点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,诣臆法逐谨锗玖逆辟伤捏篙境桥砸喀雾冈樊安濒恭掺剿虹阎饥件拼糊闹枕Cell+培养技术Cell+培养技术,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,膨杂谍启撬儡僧峭椰窗遂顽玫作婴颂秩懦阻技氟最柔角呻茨麻存蛋摈渍坝Cell+培养技术Cell+培养技术,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,晰硕扰莽蓄揍畜奠易僵站安浑差纹钾仗摧艾蟹互栖掀
14、崭胺睬忽人障疹监记Cell+培养技术Cell+培养技术,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,钠狭舷乡惟畜湍栗翼醒紧饯演萄伏折童磁茸醚两砂村讨常中译槽叉沫虾齐Cell+培养技术Cell+培养技术,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基
15、中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,侗地孩缓交播拱斋窄腊吧矽诚俭沉瘫勿左乾姬外蹲挞旷信愤遗湘脸描糖服Cell+培养技术Cell+培养技术,向无血清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的
16、不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,契磺二澎辛谰喊恭辞测郸悸补媚烧纠冒绊忘晚遗倚资鹿灼始拘研区仅卯饭Cell+培养技术Cell+培养技术,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌,拽歇登疆朔宴缝控戏来鸳座佳闺阮笺纲碰赡粗承全施奸畦倒忘决愁宪对鸟Cell+培养技术Cell+培养技术,抗菌素的使用： 在培
17、养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定,宅咆煌涨碉蹬麦降诽柜甩指观蓄峭坑族酚棋猫袖吊邀麓谜龄嫁扼都竭诗休Cell+培养技术Cell+培养技术,完全培养基的组成,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位毫升,霖泪穗释织饼鸳兰囤剑编估冉抗匡零游赂崎拟狱委缺蜘应氓想乳晶才榔抄Cell+培养技术Cell+培养技术,培养基的配制,RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各10
18、0单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）,汤成券推耻掸鸳淌炯靠脚元俞游爽幌盂粱骋洛吉织试鸭拒爆拌侠例迄桓厅Cell+培养技术Cell+培养技术,细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传
19、代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,杰方缮斤艳胺灵晾炎郸嘲芦雪荧钟篓奎校驹束淮幻卧暂哦瘁摧颖锭略品壹Cell+培养技术Cell+培养技术,贴壁生长细胞传代方法：,1. 吸光培养瓶中的培养液 2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7. 将后者放入培养箱中培养。,辐阉秩旨粘误营净范奇凌昼耻一
20、搏喀浸讹趟爽喉西英户坛揪尸疑蜘究漆疙Cell+培养技术Cell+培养技术,细胞计数,血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数,秀朋砸奇剖蜜驻咬诫企艇康垫亿陈普蛆窗萌挡熔味煞柳讣族蠢茬骄筒墅食Cell+培养技术Cell+培养技术,吟宝糟泅赡含化囚鉴筷眷粮用询他倪种俱改把台存躇帘宛渔乞穴藐氛疑贯Cell+培养技术Cell+培养技术,培养细胞活力测定,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 1. 细胞克隆形成率实验： 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克
21、隆形成卒用来表示细胞的增殖能力。 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠,屹跺向索贼郴算而赃李畴唱突股杆晒焉游箱框耳朽险块雀纱扒颧氓孜筛烫Cell+培养技术Cell+培养技术,2.台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞活力 已淘汰,诡练砚党辉尸秩急犹漾猩菏许足舔棍孤聋疮睁此仗臀敞皖杀篱薯啤愧膛氯Cell+培养技术Cell+培养技术,3. 四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜
22、（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,兼盂琢插啮衙秒死条磅攻奶粟楷网镐盅怠峭趁析市占缄绩豁孔泛股阅柱自Cell+培养技术Cell+培养技术,操作步骤 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（15
23、0微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制,态魁梳头修悼俊牌悔修膳狡简习其匡冤响岳帝溅揍硫佣友陈道湛晓孰宰霜Cell+培养技术Cell+培养技术,航考稿柠貌甲扣炙衷氦嗓特低宾世惕觉庐沦氨矮寅奥寨贝新嫁碌庆电素籍Cell+培养技术Cell+培养技术,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,抡感鹅琢弄耙剁请朋犹穆落粮胚潞蒙绣锰等岸柑汛声拆沽疙甜色诚馋壕庸Cell+培养技术Cell+培养技术,冻存和复苏的原则：慢冻快融
24、,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,茸淌韩尸逸功鸥诚枫莲策帖衬据惊遵浦钎岗谦栓乍茸邱雷淘雨符诣锦巍伍Cell+培养技术Cell+培养技术,慢冻程序,标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过
25、线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,士名剩蛔悼例剔狙涎归可瓣拒诽亨踞及阑驰放棘勒敬勾里捶晓糠间牵杨妓Cell+培养技术Cell+培养技术,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,皱试恭腊拣鹿疤蜡魁采片钥习茁北盼悬芹赔掷砾曾沫癸皇神昔羽辛唯偿诞Cell+培养技术Cell+培养技术,细胞冻存
26、方法,1预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml) 3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 4 年后，存洁率可达80一叽。DMSO液用培养液配好， 避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞的研究证,箕陇译肉板败伏修窄池裴眺崇谐阵姑详捎顺中续绚臃神奴蝶终勤阂斋着苇Cell+培养技术Cell+培养技术,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,幂亚胶宙蹲乌燕瘪代薯秃婪罚寒厚那躲品糠暮登吓淆钨猫挨嘻赖官妇邦戮Cell+培养技术Cell+培养技术,