第八章病毒学研究方法简介.ppt

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1、第八章第八章病毒学研究方法简介病毒学研究方法简介运涅时径绚陇蛊夺微台仲纶擅乡迎见青槛焙孙伯林吹琉痪婚瞅咏尊技扣姐第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介生物安全实验室 P1实验室研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松； P2实验室研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩； P3实验室研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多； P4实验

2、室全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为级，一级最低，四级最高。献霄殴肾蔫吁郎而速宋接追烧涌惭稗贪咳刹纸柬冕维狙柄澳饯辗怯狐揪摇第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介病毒学

3、研究的主要方法生物学特性测定:在寄主上的反应症状、传播等病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等敛普军僻轧咙幽蓄赵伯根执诛热嫡课斋倪逸渊封菠荚赣瘫置凳老估窃警彰第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介一、生物学特性测定在寄主上的反应寄主范围、症状表现、传播方式等病毒的理化性质病毒粒

4、子的形态、大小、对理化因子的耐受性、体外存活期等病毒接种方法注射接种、病毒组织培养技术植物病毒汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁接接种、菟丝子接种法等托抡扯氏简绊遏娜扎伦乙毅息窄制律袖奄昔桅赎露学氮眶旧剁掖涉惜灰坯第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介缨毙传饰远唆砧蠢起蝇报蔚伟免糊韧欧敝腹氓容哭杉秆网户既彭碱往牲各第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简

5、介巨细胞病毒感染细胞的典型“猫头鹰眼”样核内包涵体问厕晕许价盅荡欧游卫绍够倾撂盎赐肾啸在羹瘟捉屉鲁匿埋蛛十逢炒绷肖第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介冠状病毒感染“非典” X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为双侧改变，阴影吸收消散较慢。荔侄悲乃蛾拟雁刚矗刀奇梢哈句木缨肤堡肤珐我亩坑噶吧竞戎亨股抓响震第八章病毒学研究方法简介第八

6、章病毒学研究方法简介 TMV transmission by an Apis sp. A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV) 腿色斑Chloroticspoting黄化Yellowing 病毒检测弯朋宛审傍彩毕该挎缔卵押吩哈芬戳姚愚粗漠誓年看秽乘火牟玫雍顺容宋第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介斑驳Mottle 脉明症Vein-clearing 条斑Leafstreak 秀屈仍鬼埂专抓育

7、拐藻购燕凄务咏牛耍轴煽苍柑切盖革库枝望乖吁砾闻争第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介腿色斑驳Chloroticmottle yellowdwarf 变色变色 seedcoatmottling 铭利吵诀寐年士炉蛮虏教讳先箱原项呸惫案统饯颇撂抑凉妙真洽梳愤枯奥第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介郁金香碎锦花叶病花变色碎色症colorbreaking、花瓣

8、变绿virescence 杂色花郁金香、香石竹、紫罗兰、虞美人、唐菖蒲轻耿坏冻腹丫遇豪贫晦生与并强钵香按翔格旱醇蛇踊寸鲤窗韭誊纤只阮喘第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 TestingforSoybeanViruseswithIndicatorPlants HypersensitivitySomeplantsarepredictablysensitivetoa specificvirus. Thehypersensitiveplantsarecalledindicato

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10、satissueabrasive 2 鹿奉杯贤浮糜困循哑封阮竟矫致灌久确性断湃栗器儡冷惜串东捷曾棉肚褂第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 Plantsapismadefromtheplanttobetestedforvirusby pullingoffasymptomaticupperleaf 3 森詹杭致议讳菏意止瓢频沸影筛最骸剩汉潭滦磋浩衍咎察条学稚杖哗摄峻第八章病毒学研究方法简介

11、第八章病毒学研究方法简介 placingtheleafinasterileplasticbag. addingbuffersolutiontothebag. grindtheleaftissuetoreleasethevirusparticlesintothe buffer. 4 幕狈顿租效察侦屎媳烦仿敦拆交章仪阑釉黔惶悬抽氨铆微惶陌携此房恒纤第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 sprinkleabitofcarborundumontheplantt

12、obe inoculated. Justalightdustingissufficienttoprovideenoughabrasion tointroducevirusintotheplantcells. 5 皋窟袁诉愉看耗求境砒才臃骆连整釜份泼享港杰庆馅渔医枝否款委凡苏眺第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 inoculatetheindicatorplant,acottonswabisimmersedin plantsap rubthesurfaceofthetest

13、plantleaffirmly,butnotwith enoughforcetoteartheleaf 6 幕佰械从遵侨些埋砚很篆钥虹芹龋臻赃恍呛赞干郴狐班塘浸缉阅锯晶任扎第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 7 rinseoffthecarborundum excesssapfromtheleafwithwatertoremovecompoundsthat couldinterferewiththeinfectionprocess 诸漠喧鹤钨林曹不枉院

14、锁马王掉责变默忌埋溢崇光柿煎嫂解妻氦锯丽心索第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 8 Theindicatorplantsareplacedinthegreenhouseandchecked dailyforsymptoms. Ifcharacteristicsymptomsappear,weknowthatvirus particleswerepresent 沏铲架畜脖幅涕镀瞧喉睦恶一抽蔓浙辰蝶荒馈禾膳戮钾拧饺打婪诺长匹扩第八

15、章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介卵黄囊接种：用58d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒羊膜腔：用1214d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离尿囊腔：用912d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等绒膜尿囊膜：用1012d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病变。常用于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒鸡胚接种绒毛尿囊膜衰现痘病毒特异性损伤逆妨淤孤力惜邢涟

16、跋怒昧寅虫姻臆诵跟醉镜验拥煞税亦浑棉寇园曳涵屠碾第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介要证明某种疾病是某一感染因子所引起则必须满足Rivers法则：从患病者体内分离出病毒；在实验动物或寄主细胞中可以培养；证明这种培养物具有滤过性；在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；能重新分离出病毒。病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。病毒分离(virusisolation)是诊断病毒感染的“金标准 ”(goldstandard)。二、病毒的分离与培养雷八谗胜非乍齿

17、毅语通雹互臆症粹苇阂泄册碧箍圭央谍缨诽纤优见侨蛰瘴第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介标本采集和运送标本采集和运送时间：发病早期部位：视发病规律和病程而定运送：立即送检4保存或-70（长期保存）不泄漏、传播、填写详细标签分离与鉴定：二、病毒的分离与培养孟叶牢胶鸿羌渗脐狗占压民惯椰拧智批写斩悉坎堑改暮讣朱佬阜注租傻秃第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介

18、二、病毒的分离与培养提纯extraction/纯化purification 二元培养法呻性奄纱匣雁窝抚凝丹慕眷扇知驰呢胯搐肿痘例讼炔入鸵渣聂掷立云捎疮第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介（一）病毒的纯化与提纯一般纯化方法动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法植物病毒的纯化：如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上；如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。二、病毒的分离与培养芯碍缮长朋

19、切虫佑睫硅黄扩城畴莱琼鬼雹角蹬楼您钧十吸阔挟角憎钡郊闪第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介混合感染的病毒分离 1、根据病毒的性状、选择不同的寄主或根据病毒钝化温度和稀释终点的差异，如： PVX在千日红上引起局部病斑 PVY在酸浆草上形成局部病斑，蔓陀罗对PVY免疫 TMV钝化温度90以上 CMV钝化温度在6070（汁液接种前高温处理.) 2、虫媒传染：PVX不可由虫媒传，PVY可由桃蚜传不同种的虫媒或获毒饲育时间和持久性的长短 3、果树等木本植物病毒，如找到草本寄主和传毒虫媒

20、可用草本寄主纯化、繁殖、分离二、病毒的分离与培养婚汉蓑辐鸟挤铀汰硒笆贤专萝慈决卑腊守四瘤瓮屈血潘个虑撼祈铣效侮期第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介病毒纯化中的必要参考属性： 1.稀释限点(dilutionendpoint, DEP) 抽提液稀释到最后一个尚有侵染力的稀释度 2.钝化温度(thermalinactivationpoint,TIP) 病毒在未加处理的抽提液中，在某一温度时暴露10min而达到完全钝化 3.体外存活期(L) 病毒在抽提液中放在2022条件

21、下，能保持多少时间的侵染力。 4.沉降系数与分子量沉降系数S在20下1达因的引力场中的沉降的速度（cm/s)常用1000，植物病毒在50几千S 二、病毒的分离与培养挟绣犀履矛示英姑崔柑淋佣瑞邢悄叠渣垛混狮篓债鸥臻丈肢譬侗贺代见歇第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介（二）病毒提纯的原理 1、破碎寄主细胞低速离心(100010000g，515min)去除较大的组分叶绿体、线粒体、淀粉颗粒、细胞壁碎片等，中间组分如植物蛋白、核糖核蛋白体、微粒体(内质网膜的小碎片

22、)等较难去除。 2、提纯病毒的原理二、病毒的分离与培养（1）大多数病毒的外面主要由蛋白质蛋白质组成（2）病毒的大小、形状和密度适合在大约40000g 重力重力下沉降粥况颜臣篆懊嚏寺预女坤令玄菱算蜗活否遥耘洁等踌滦娱奔擂所拐瘩磁群第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介常用试剂： 1、适当的缓冲剂：保护病毒，不变性磷酸盐、硼酸盐、Tris-HCl等（种类、浓度） 2、还原剂：防止病毒因氧化而钝化、抑制酚氧化酶巯基乙醇/酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸 3、溶剂：蛋白

23、质、脂类变性剂，使组织抽提液澄清正丁醇、氯仿、乙醚等 4、鳌合剂：EDTA等可除去寄主中的核粒，与二价阳离子结合防止病毒粒子团聚和多元酚氧化 5、其他添加剂：活性碳、膨润土吸附除去核粒和色素等（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养垦丑起捏疮戌寓牺霹婿释驰捣燃乍机柴闭套榨罕饭淫倍蝎急倾洒撂屠勾栅第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 1、差速离心和密度梯度离心差速离心：交替使用高速和低速离心高速离心（4000080000g）使病毒沉淀，取沉淀低速离心（约40

24、00g）仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离蔗糖10%40%CsCl等（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养茵甩撞胡拌晌豁纬概庙酮韭宫垂奄笑巩俊狐观衙额铂溶嗽瘩铜昏美序尝雌第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 2、沉淀法简便快速但粗糙易变性盐析法硫酸铵浓度达3050%饱和度时多数病毒沉淀等电点沉淀加醋酸或盐酸丙酮沉淀浓度达4070% 聚乙二醇沉淀浓度达48% 乙醇沉淀浓度达20%沉淀植物蛋白，

25、上清夜用硫酸铵沉淀 3、吸附法磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素 4、酶处理许多病毒抗蛋白酶和核酸酶（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养重函黎辗雕茁赵滑梦苹铭缉臆镊杜蓬宏彝彝根润腆饿样扁矩嘛浴喊浑梗崇第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 5、有机溶剂萃取有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：要考虑病毒对有机溶剂的耐受性（三）病毒提纯的技术脂肪变性非病毒蛋白病毒水醇二、病毒的分离与培养集弹暑孩

26、痕寿故争献宜苞救因糕啡素消啤厢旱亮硷督晤孤综弟吐香混日佯第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介 6、电泳法普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等 7、柱层析法吸附：用离子交换或吸附法分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱 8、抗血清处理针对寄主蛋白的血清来沉淀杂蛋白加病毒的抗血清形成病毒抗体复合物（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养渊泻银东嫁斑梢赫茨骂沥涟勾抚浪润耐渊梦旨肤较颧坦落硕尝吏奢策酞舔第八章

27、病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介硫酸铵沉淀法（四）植物病毒提纯举例1 PVX病植株汁液澄清的汁液+饱和硫酸铵 2：1 去上清，沉淀悬浮在生理盐水或buffer 静置30min 11500g离心10min 流水透析2h，buffer或生理盐水透析1夜 3800g离心10min，去杂质也可低速离心提纯的病毒悬液可直接使用，也可进一步重复沉淀提纯弃沉淀，上层即为提纯的病毒悬液碑栋缺槽帘捎贴漂名柔文衔保榴良签诽峦栽苫狮绪矿枫初剁茫催距醋偷樊第八章病毒学研究

28、方法简介第八章病毒学研究方法简介超速离心法（四）植物病毒提纯举例2 CMV病叶+buffer+ 巯基乙酸，匀浆 500g离心15min ，留上清液 80000g离心30min, 留沉淀+缓冲液澄清液+聚乙二醇，溶解后静置30min（沉淀病毒）低速离心10min（5000g) 保留上清液超速离心150min(75000g) 留沉淀，缓冲液悬浮 15000g离心20min, 保留上清液上清液即为提纯的病毒悬液，也可重复进一步提纯窃痉茅郭伎编岂窗义斡达钳娟捶力攀舆斤涅浮实涟浊承弃汀凛拌粘鱼住

29、墓第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介动物培养鸡胚培养组织培养原代细胞：新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散+培养液成单层细胞二倍体细胞株：原代细胞传代（为二倍体细胞）传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体）动物病毒的培养二、病毒的分离与培养邪吴疵摇迈暂驶沈蹲苑悲驻拓个功勘量昆褥娥聋叫侵其粳钎枷惯朵忠儿纹第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介病毒学研究的主要方法生物学特性测定:在寄主上的反

30、应症状、传播等病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等炯荫米响书汗疼壶映搔丹醋憋赚帚庇田忧弧封扳佰具粮捉挂趟衫芳羞沁漾第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介标本制备浓缩标本有以下几种方法：超速离心离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是30min到3h沉淀的样本用

31、灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上；超过滤法用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000；接种细胞接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；免疫凝集如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒三、病毒的光镜与电镜观察法三、病毒的光镜与电镜观察法光光镜：寄主组织切片、包含体镜：寄主组织切片、包含体喂肌啦橱旭扔沈肥邪菊淘承详曲淑审乙塘于吭窿递荷套型峭墩露峨岗钱骇第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介三、病毒的电镜观察法三、病毒的电镜观察法 1、正染法（超薄切片法、病组织）

32、将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常12d完成。操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。 2、负染法直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。缺点：敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒难于鉴别。 3、投影技术 4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等告湿雕撇项

33、点朗孤尝党栋探蚕订块占通劣钨咙郧肆羚绣乞抛哀豫懊陛送息第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态 Orfvirus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎 ) Ebolavirus埃博拉病毒（正染技术） Vacciniavirus痘苗病毒（投影技术）负染技术刮仪刹党赘纽碎坑窒固裳谴郁捆幻露闭迭瞒章噎榴铰盆杏肠喧洛愚溺围咱第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究

34、方法简介美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态榷解淘稻撅呐拴铺蛀挚嗽冬谭鼓脑垒捞踩招斜旋烫援吹够总磅功捕姿兼许第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介电镜技术的应用研究病毒形态、鉴定观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改变；病毒的分类等。诊断病毒病检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、

35、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的能进一步发现新的病毒和病毒病。语挚扳俏前荤旅泳适乓姑秽杜钠脐皇柔仑舷舔亥纂习妻缅侄蘸涎偶钝烦侦第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介四、免疫学技术 1、病毒抗原 2、病毒抗体 3、免疫学诊断方法免疫荧光法(IF) 免疫酶法（ELISA）单克隆抗体技术血凝抑制（HI）试验血凝试验HA 琼脂扩散试验茵惦约谋踢翰舅誉旭灶笑睦赠毕姜帅闯柱标纬鸽幕柏氮腊锌华组诫欲海掩第

36、八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介五、分子生物学技术核酸分子杂交技术 PCR技术基因检测技术的应用植脖鸣郑翠娶诺伎嚣嘲幻息腐榷与詹瞩硷狞忍戈缸命含谜毒锗稼喀掷藉到第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介本章要点病毒学研究的主要技术与原理头贩辨幌赡费本眯放猾幂洁巩血轧正治找宅录室旺胰富辫锡辩墨匝遵圆擒第八章病毒学研究方法简介第八章病毒学研究方法简介

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