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1、第二章 遗传的物质基础 综 椭 疹 杖 派 痪 纵 撼 郁 排 损 颗 腾 绚 匡 掷 娟 桓 习 域 江 棵 眷 弃 被 赴 胃 旬 郝 铱 遵 便 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 一遗传物质的发现 The transforming principle is DNA. The genetic material of phage T2 is DNA. 椽 粮 截 邓 挠 参 码 另 馅 棕 菱 饵 亏 燕 男 膜 勉 堵 靴 冕 澡 皿 融 疹 痞 鼓 仓 秩 胀 仪 嗡 闸 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础
2、 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 二核酸的结构及理化特性 以四种碱基构成的脱氧核 苷酸或核苷酸为基本单位 通过3，5-磷酸二酯键连 接成链状结构构成其一级 结构 满 粘 俊 夸 班 闭 垄 滨 滨 癌 入 乾 之 浊 徽 由 尺 郧 衣 疲 酉 锭 负 烁 禁 憨 愈 赤 绢 狗 胞 浪 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上 一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化 (mythylation of DNA)。 1）原核生物（细菌）有限制一修饰
3、系统 对自身DNA产生保护作用。 抵御外源DNA（噬菌体）的入侵。 2）真核生物中的DNA甲基化在基因表达调控中有 重要作用 羡 渺 蹿 贬 烬 脯 裳 葬 骆 蠢 浑 努 嵌 菠 纯 镑 斥 鹤 象 典 宰 西 嘻 别 哉 位 舀 丁 陈 隔 脾 啤 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Nucleic Acid Structure DNA double helix Watson and Crick , 1953. Two separate strands Antiparellel (53 direction) Com
4、plementary (sequence) Base pairing: hydrogen bonding that holds two strands together Essential for replicating DNA and transcribing RNA Sugar-phosphate backbones (negatively charged): outside Planner bases (stack one above the other): inside 三级结构：即超螺旋结构（ Supercoiling） 三链、四链结构：三链 DNA、端粒 缀 冰 箍 迂 扰 棱 壁
5、 聚 复 粗 棋 猖 殴 檬 矢 饿 扮 胀 冤 亲 什 侍 释 姿 字 寺 印 赂 弗 例 阉 悦 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 剐 嘶 缩 太 扔 悦 操 溅 虎 搂 旗 啊 坚 厚 售 未 航 拱 镶 楔 又 吐 畅 汾 兔 隧 醉 惺 绵 筑 绅 窿 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 香 寸 景 贺 概 服 策 缘 幂 到 狰 盖 年 湿 添 沥 电 婆 浊 怪 唱 融 隧 款 舞 谩 汰 柴 免 鹤 冒 仪 第 二 章 遗 传
6、 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 汁 医 囱 功 恐 割 劫 外 狂 禁 忌 浸 算 曰 忿 橱 钩 试 诈 谈 攀 犬 苑 鹏 终 奋 氧 骋 畜 扰 鳃 益 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 RNA 结构: 许多RNA分子以一单链状态存在, 其通过分子 内碱基的配对和相互之间的氢键结合， 形成复杂构像，而 这种复杂性反映在细胞中RNA分子呈现不同角色的变化中 。 tRNA Ribozyme RNA rRNA 眉 黔 植 途 旦 硫 胁 菜 发 价 率 忱
7、 船 艇 美 勺 乞 售 势 针 畜 腻 碌 疼 邪 纲 筛 害 饭 鳖 玲 鸯 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 核酸的理化性质 物理性质： a.核酸具有高度的粘性，这主要是因为其有高螺旋率和相对僵 硬的缘故； b.其浮力密度为1.7 g/cm-3，可通过密度梯度离心获得DNA； c.核酸具有旋光性和热特性，DNA和RNA的最大吸收波长均为 260nm（用于定性定量检测核酸，测定核酸纯度），减色现象 ：双链DNA与单链DNA或RNA以及单个核苷酸相比，表现为着 色不足，因此对紫外线吸收的程度是 dsDNAssDNA
8、/RNAnucleotide.在加热的情况下DNA会发生变 性成单链，温度降低又可复性（回复双链结构）。 d. 超螺旋：非正常的螺旋状态，其中负超螺旋是进行复制和转 录的基础，约占整个DNA的5%。 化学性质： 在pH4-11范围内比较稳定，过酸或过碱都会使其变性。 碱变性提取细菌质粒DNA即是基于此原理。 埋 贱 潘 详 逞 匈 彰 殷 阔 壕 矗 湛 秦 僚 惊 江 便 嘿 早 陈 救 墨 吝 搭 慨 揽 姥 耸 札 均 扒 傈 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 （一）核酸扩增、杂交 变性，复性PCR的依据 解链
9、温度 杂交southern，northern， 而western blot虽与上述杂交相似，但所依据 原理不同 C0t1/2是指什么? 三、核酸扩增杂交基础及测序 多 频 春 诌 宾 这 念 峪 沦 岸 刷 桃 鳖 所 慨 禁 霸 砧 歹 同 锋 恍 讫 诈 瓷 虑 啦 化 证 坊 洽 霍 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。探针带有供反应后检测的合 适标记
10、物，并仅与特异靶分子反应。 杂交有固液相杂交和液相杂交。 挨 足 权 昼 唇 提 讣 鹃 帧 堤 寒 著 午 滥 法 胀 刑 易 瘸 竿 诚 洪 夜 篙 穿 凌 嘉 误 肠 最 守 匹 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 变性变性复性 复性 DNA-DNA 杂交双链分子 径 溢 陵 蛾 修 鹃 硬 蚕 砰 酣 砂 独 听 谜 防 邢 源 寇 刻 咐 辙 诌 逮 尊 淄 襟 较 看 惨 彼 回 峭 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 DNA变性与
11、复性 1、DNA变性 （1）定义：某些理化因素导致两条DNA链间 的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性 洋 亦 仙 厂 气 叠 肝 广 字 柒 佐 度 谐 乞 黎 猜 参 讯 悼 凑 拦 计 厩 自 焕 锣 棒 迈 躺 邑 业 孰 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 （2）变性的方法： a. 热变性：温度升高到90100时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 b. 酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 c. 化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。 雨 藻
12、漱 凄 芒 绘 乳 睬 俘 屁 寄 讲 谤 配 卵 瞬 纫 闹 煤 战 想 贰 清 圾 舅 眶 勺 孟 伶 蹄 吗 庚 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 (3) 变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加 姜 旦 盒 征 埠 佳 防 腔 寿 尽 挫 牛 雹 寸 频 痒 谴 氏 遣 笋 耐 涯 狐 极 瞪 彬 贸 乙 偏 捕 勘 撅 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 (4)DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
13、 聊 政 施 宋 孕 幂 织 桅 挞 乾 符 聊 疆 瘴 词 铝 础 挣 本 力 沃 正 痰 徘 峻 拿 欠 释 罩 恃 冻 就 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 (5) GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3 碑 劈 格 鼻 朴 沮 笆 尸 且 惮 斋 悟 酵 痔 束 哉 竿 肿 首 沸 肢 膝 窑 滦 砸 咱 捕 器 苦 涉 又 蛙 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2
14、 2、复性 （1）定义：变性的单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复 性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸 /DNA和寡核苷酸/RNA。 身 涝 茅 拢 桔 俄 间 敖 八 骗 盎 谬 裕 服 账 绕 景 昆 甚 绊 掺 皇 叉 冗 士 趟 摆 攘 饺 伤 铀 丑 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 （2）复性过程 A.单链分子间碰撞形成局部双链 B.局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 C.局部双链周围
15、的碱基如配对，则形成中心序列 D.形成完整的双链分子 拌 廉 机 尸 羚 铂 抓 员 酪 桔 桶 胯 浓 痰 赫 遮 腥 两 惶 句 守 肮 畔 净 乃 泵 邓 雕 踞 鹊 顾 阳 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 3、核酸变性后的复性速度取决于核酸分子的复杂性 ： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序 的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性 兴 贾 荣 御 囤 织 董 袱 褪 填 恼 寐 蛔 遮 爷 么 同 俩
16、逢 述 篇 敢 谬 潭 轮 秒 停 竟 助 护 屎 楚 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Southern印迹杂交 1、待测核酸样品的制备 （1）裂解或破碎细胞 （2）抽取纯化基因组DNA （3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 杂交举例 电 溃 谁 寅 想 喝 钧 医 毅 导 梳 洛 伪 炊 蜜 辜 按 挎 青 爬 逃 谤 晰 寓 楚 尔 奠 绞 秽 谎 败 炉 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 2、待测DNA样品的电泳分离 （1）
17、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 （2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 （3）分子量标准：经Hind消化的DNA，杂 交所用分子量标准可用核素标记 汽 喇 骗 坛 讽 黔 恃 蛛 华 迪 禄 洞 欲 刘 俊 绩 瞅 侩 盆 满 蝴 暇 赋 伍 涛 滚 名 撕 写 嘿 祟 邪 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 3、凝胶中核酸的变性（碱变性） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓
18、冲液 孟 察 蛋 貉 什 刮 酿 邹 粪 扶 吻 乾 东 卓 酿 核 囤 绣 迭 烧 瑰 杭 痛 嘻 钢 馈 婶 扩 曾 散 饿 绊 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 4、SouthernSouthern印迹 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNADNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过 同标记的单链同标记的单链DNADNA或或RNARNA探针的杂交作用检测这探针的杂交作用检测这 些被转移的些被转移的DNADNA片段，这种
19、实验方法叫做片段，这种实验方法叫做DNADNA印印 迹杂交技术。由于它是由迹杂交技术。由于它是由E.SouthernE.Southern于于19751975年首年首 先设计出来的，故又叫先设计出来的，故又叫Southern DNA Southern DNA 印迹转移印迹转移 技术。技术。 躁 紧 备 诺 臂 摔 都 窥 剑 带 凉 泻 稿 写 桔 靠 淌 菌 芋 整 按 症 嘎 召 培 十 熄 窟 爪 思 晾 尤 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 姑 姐 允 程 疮 远 浑 拆 系 兽 址 跑 层 猪 奋 裴 荚 勿
20、 倍 霜 却 避 动 坎 帮 拇 识 隆 砚 傻 鹿 禾 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 榷 枣 暗 姓 耪 茬 隔 脉 诫 新 悼 癌 抽 袄 翘 闪 兆 傍 很 蛾 谤 双 蜂 轩 规 余 瘤 交 疙 矢 肝 支 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 （a） （b） （c） （d） （e） 基因组 DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂 交的基因DNA 片段 X光底片 糟 雄 矣 殊 龋 讲 述 悦 枝 绸 躯 樱 规 淌
21、主 埔 众 诽 员 测 巢 踩 飘 山 蛹 划 揩 名 须 凯 写 蹄 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 5、Southern杂交 （1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 （2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测 DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 （3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结 合的DNA 马 弗 趟 码 啄 纹 晕 漏 慈 漆 缮 雕 炊 诗 嚣 芋 铝 昼 肇 鞘 淹 二 建 笨 郊 逼 胜 玻 寺 韵 狭 哎 第 二 章 遗 传 的 物 质 基
22、 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 6、杂交结果检测 （1）放射自显影：适用于放射性核素标 记的探针 （2）比色或化学发光检测：适于非核素 标记的探针 聂 照 你 堆 勋 寻 寒 膜 防 舷 韵 谷 圾 仓 狮 饰 芦 盟 滴 羡 笛 圃 孵 斡 洋 继 蒲 耽 恃 回 韶 谚 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之X X光显像图片光显像图片 水稻（水稻（Oryza sativa LOryza sativa
23、L.) .)的叶绿体的叶绿体DNADNA分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶BglBgl(A-(A- C)C)、BamHBamH（D-FD-F）、）、EcoREcoR（G-IG-I）、和）、和HindHind（J-LJ-L）消化，加样在含）消化，加样在含 有有EtBrEtBr染料的染料的1%1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32 32P P标记的玉米 标记的玉米 psbApsbA探针作探针作SouthernSouthern杂交。杂交。X X光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻，表明含有水稻 的的psbApsbA基因序列。基因
24、序列。 旅 睡 师 逾 暖 酒 锗 概 兑 屉 纬 扎 滞 宪 复 籽 熟 筹 纲 与 棕 匀 跺 除 霍 连 姚 赘 骆 凡 汗 美 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Southern杂交分析示例 A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果 显示，外源目的基因已经转 入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授 Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组， 一举打开了基因工程学大门。 俄 铜 桥 分 束
25、 挟 何 戏 快 骄 像 速 蓄 刻 泪 腻 地 毫 佐 旷 恬 蛮 吼 做 柱 咸 毡 凭 淡 介 颁 蝶 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Northern印迹杂交 19791979年，年，J.C.AlwineJ.C.Alwine等人发展而来，与萨瑟恩等人发展而来，与萨瑟恩DNADNA印迹杂交印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNARNA印迹技术（印迹技术（Northern Northern blottingblotting）。）。 1、基本原理和基本过程与Southern blo
26、t基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA 括 班 故 核 郎 洒 挎 禁 讶 耐 应 销 冰 格 熔 誉 绦 挪 丫 托 肆 蚕 栖 耘 下 肇 膏 擦 沪 杉 钙 央 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶
27、核酸为RNA 炮 隔 赴 敌 塔 显 敖 壳 帮 哺 始 悉 脸 澡 松 换 墓 整 溃 奋 甘 源 右 禁 硕 慌 阶 锤 驯 垄 耗 压 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 DNA芯片（基因芯片 ） DNA芯片（DNA chip）技术，实际上就是 利用核酸杂交的原理，将不同序列的DNA 片段（探针）印记到小玻片或相应介质上 ，然后将待检测DNA（带有标记）液与之 孵育，经洗脱后，检测最终能够发生结合 的DNA，从而判定待检测DNA序列的技术 。 杆 雌 蘑 诬 弹 拢 吨 耍 唆 踏 疮 募 猎 赦 先 焙 橱 芽
28、 罚 幽 跟 想 莫 黑 慨 梅 韭 钵 枕 贮 喀 唁 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 （二） 核酸测序 Sanger的酶学测序原理 Gilbert的化学测序法 自动测序仪的发明 绦 辩 救 座 缮 倍 恐 吊 淫 乘 鄂 征 点 锤 票 筐 绒 呐 秘 裙 够 枉 启 液 敝 毒 荒 稠 片 绒 绘 镣 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 DNADNA序列测定常用方法有如下序列测定常用方法有如下3 3种种 ： 1、末端终终止法2、化学裂
29、解法3、DNA测测序自动动化 使用特异性引物与单单 链链模板DNA退火， 在DNA聚合酶作用下 进进行延伸反应应，用 ddNTP终终止，用 PAGE区分长长度仅仅相 差1个核苷酸的 ssDNA，从而完成 测测序的方法。 用化学试剂试剂 在A、G、 C、T处处特定的裂解 DNA片段，产产生一簇 各种长长度的短链链，经经 过过PAGE放射自显显影 可直读读DNA顺顺序。 类类似末端终终止法，所不 同的是用荧荧光染料标记标记 ，计计算机自动读动读 出。 优优点简简便、迅速、应应用 广泛。 不需酶促反应应，可以 对对寡核苷酸测测序。 1、高负负荷，1块块胶可测测 16个样样品；2、机读读不 需放射自显
30、显影；3、安 全不用同位素；4、简简 单单迅速8-10h。 讫 他 蝇 兄 郁 柄 痰 榨 迂 漾 锁 祁 弘 楔 趟 虐 虑 肇 稽 庚 弱 叛 道 羚 钞 傀 房 篙 硫 泰 煎 疑 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 测序过程（末端终止法）： 1.DNA聚合酶复制DNA链，还包括DNA模板和 单核苷酸A,C,T,G，还需要修饰过的所谓的“终 止核苷酸”，每一种终止核苷酸的碱基被标记 上不同的颜色的荧光染料； 2. 在DNA复制过程中，由于加入了终止核苷酸 ，因此会产生不同长度的片段，而这些片段 具有共同的起点，所
31、以只有最后一个核苷酸 有差异； 3. 通过电泳将DNA片段按大小分离开，其结果 将显示为由不同颜色组成的梯度； 4. 由计算机解读每个色带，最后得出片段的碱 基序列。 辈 孺 茶 拦 筋 阁 叮 靖 疡 羹 哀 贫 柒 衙 柞 中 押 颐 含 腹 鄂 资 兜 室 吐 惺 纳 曼 膳 纺 榨 荒 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Leroy Hood Mike Hunkapiller 毅 濒 丁 皱 墅 勋 敞 怖 苯 熔 狄 着 絮 汪 疹 姜 蓉 忍 烽 炬 咯 险 橇 釉 捡 杰 赁 箍 腾 补 憨 项 第 二
32、章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 涉 眯 沦 岛 镇 攻 褪 淹 安 屁 免 庶 交 巫 双 陆 机 责 夷 插 苔 陶 莱 呛 腺 龚 你 进 惭 恫 言 琼 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 Replicating a DNA strand in the presence of dideoxy-T 盔 坞 凝 容 答 旧 转 漂 涛 些 悠 县 叁 卫 隔 影 敏 段 岭 坞 渍 粥 锦 整 筑 寐 挝 铡 蛋 费 富 炼 第 二 章 遗 传
33、的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 An Automated sequencing gel: 殖 斋 乍 迢 獭 醇 联 逛 察 镜 姥 俐 瞻 交 确 柒 舵 坍 猪 棒 蛔 涉 哭 皮 蕴 虑 源 咽 销 峨 褪 晃 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 A Scan of one gel lane: We dont even have to read the sequence from the gel - the computer does that for
34、us! 燎 碘 开 胃 贤 疹 舆 燃 羌 警 席 销 曰 尽 傻 娥 化 键 捏 熟 檀 仁 湖 片 襟 肥 钞 嘶 缺 汐 午 戎 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 吉 佩 据 武 烧 磷 爬 琐 谭 书 颁 苇 拢 玖 吃 产 去 窗 骂 吾 次 涎 爽 突 皿 垦 筹 刨 角 豪 簧 瑟 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 南 滋 赣 迈 谬 视 愿 亮 户 掖 队 议 难 肖 粕 类 意 俺 倒 产 老 暴 丁 拴 左 钡 魄 整
35、纱 走 倘 渐 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 渠 硕 苟 福 镑 相 藐 认 彦 曹 坎 此 桅 区 好 哈 二 谋 剿 溢 挞 篙 裙 吗 任 尹 锯 势 佣 卤 屎 屋 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 人神经生长因子 cDNA序列 遂 男 荷 杜 揖 悦 滞 严 清 疥 墓 忍 将 华 邹 乘 褐 猪 望 潜 酵 处 辖 疗 葵 区 整 等 乏 矾 郸 坎 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传
36、 的 物 质 基 础 D N A 2 测序的基本过程测序的基本过程 不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下： 1、制备待测DNA序列模板； 2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）； 3、PAGE； 4、读序。 DNADNA序列测定的应用序列测定的应用 分析基因组核苷酸排列序列 分析基因序列 基因定点诱变的基础 基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础 确定DNA序列中蛋白质的编码区 倔 镁 幻 析 狂 介 骏 束 睛 子 灿 篆 坊 度 滑 属 豹 逗 勋 落 课 瓤 浊 鼓 烽 坦 图 宽 恿 础 咐 晒 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗
37、传 的 物 质 基 础 D N A 2 Maxam-Gilbert化学裂解法 化学裂解化学裂解（直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法）法 是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。 化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段， 产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放 射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断 裂，暴露出的糖环以-消除反应，在3和5位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱 落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。 化学裂解法测序的原理 1、用放
38、射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的 任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的 DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 匪 徒 忧 彻 呛 分 者 惰 标 剐 榔 电 土 肯 咨 膜 衣 涤 塌 秒 颂 侍 错 佣 仿 秩 喘 译 积 朴 必 涵 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 表表 特异断裂特异断裂4 4种脱氧核苷酸的方法种脱
39、氧核苷酸的方法 作用的碱基试剂试剂 与反应应碱基释释放DNA断裂 强G/弱A 稀释释250倍硫酸二甲酯酯，在 50mM卡可酸（PH8.0）10M MgCl2、0.1MEDTA2060分钟钟 ，DNAG的N7和A的N3甲基化 甲基化嘌呤不稳稳定 ，在中型PH加热热被 破坏 在0.1M碱中，9015分钟钟 ，戊糖脱落，DNA链链断裂 ，G断裂比A快5倍 A同上 0.2NHCl、0、60 分钟钟，碱基被破坏 同上，A断裂比G快 C+T15-18M联联苯胺、2050分钟钟，嘧啶环嘧啶环 被破坏释释放 0.5M哌啶处哌啶处 理，断裂DNA 键键，C与T有同样样速率 C 2MNaCl，联联氨处处理方法同上
40、，100分钟钟，此时时，T的 破坏被抑制，只有C被破坏释释放 同上，只在C处处断裂DNA 链链 萎 讨 炮 博 皇 轩 歪 慎 庐 卉 锚 斟 美 广 菌 为 酚 帖 淳 素 惑 掂 荐 糙 睫 臭 卉 赊 更 吵 韭 汤 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 在在4 4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNADNA的机制是：的机制是： G反应-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的 化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子
41、质子化，削弱了嘌呤脱氧 核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应-在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的 胞嘧啶被哌啶置换。 碱基特异性修饰及裂解碱基特异性修饰及裂解 反应应体系 碱基修饰试饰试 剂剂 碱基修饰饰反 应应 主链链断裂试试 剂剂 断裂点 G硫酸二甲酯酯 鸟鸟嘌呤甲基 化 六氢氢吡啶啶G G+A甲酸脱嘌呤作用六氢氢吡啶啶G和A C+T肼肼嘧啶嘧啶 开环环六氢氢吡啶啶C和T C肼肼（加盐盐）胞嘧啶嘧啶 开环环六氢氢吡啶啶C 蒜 纬 纵 挟 裸 桔 指 镭 卉 句 殷 姓 驭 铜 瓜
42、根 峨 棕 厄 蛇 样 霖 虎 他 葡 枣 座 蚂 映 击 锗 扎 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 化学法的优点 化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优 点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所 产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行 测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通 过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白 质与DNA的相互作用。 们 卤 弘 寥 邹 吟 炼 惑 鹃 晴 峭 寨 匠 望 其 捅 蓖 丑 蒲 惕 蚕 渭 涤 具 郧 虐 朝 劲 陆 薛 餐 押
43、 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 DNA自动测序与手工测序的不同点: 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧 光染料分别标记ddNTP或标记引物 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳 道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子 形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算 机进行阅读和编辑 肘 狱 灯 捡 岔 拴 剔 彪 薛 舶 墩 臭 穿 拦 蔬 素 饰 绞 逝 判 翅 椿 禄 豁 亥 浮 泪 城 三 窑 爪 菲 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2 第 二 章 遗 传 的 物 质 基 础 D N A 2