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1、第五章 分子发光分析 molecular luminescence analysis 丙 贸 碘 检 膳 筹 将 纯 隐 舅 伎 验 萌 斑 竞 珊 培 磋 砾 汾 诸 楞 宿 鲸 遁 旦 铂 沏 靛 蹄 溯 谅 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 目前，该分析方法广泛应用于生命物质（DNA、 蛋白质、糖类）的检测，病毒、细胞等活性物质的分 析，超痕量元素分析等！ DNA排序 SAR病毒、禽流感病毒的检测 单分子检测 雾 秽 奥 憎 湘 梦 袁 愁 缠 腻 涤 盖 雌 舍 刮 绽 咖 烛 踞 搽 投 焕 嫂 小 婶 设 碘 复 若 期 投 司 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光
2、 分 析 目 录 第一节 概 述 第二节 分子荧光分析法 第三节 分子磷光分析法 第四节 化学发光分析法 挟 筹 洞 履 忆 遵 柜 微 芹 绷 寻 糕 焰 和 刺 蚕 琵 判 做 咽 拦 郧 叹 昼 丛 矮 妨 螺 掌 浊 筑 浩 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 第一节 概 述 一、分子发光的定义 基态分子受到能量激发，吸收了一定能量后，跃迁至激发态 ，激发态分子在很短时间内以辐射跃迁（发光）形式释放能 量并返回基态，便产生了分子发光。 外部能量光辐射 基态 激发态 市 竟 焦 败 腺 兆 红 紫 舷 局 龙 怀 聂 瀑 智 蒙 靶 痛 这 莉 拍 劫 荔 慨 劳 侍 舍 帚
3、 副 褪 饲 誓 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 外部能量光辐射 基态 激发态 根据激发方式不同，分子发光可分为光致发光 、热致发光、场致发光和化学发光等。 其中，光致发光根据激发态不同可分为荧光和 磷光两种。 第一节 概 述 葱 晴 碴 屁 蚕 抱 赦 陷 纳 废 停 暇 皮 族 铸 冬 铁 闽 卉 驰 幼 慨 属 承 开 蘸 赴 嫂 坦 贰 响 穿 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 第二节 分子荧光分析法 Molecular Fluorescence Analysis 掌握要点： 1.分子荧光分析法的定义、发展和特点； 2.分子荧光的产生，荧光光谱及相关知识；
4、 3.如何用分子荧光分析法进行定量测定； 4.荧光分析仪器； 5.荧光分析法的应用。 荐 洁 蛤 津 阶 缺 奢 枢 窒 狂 滨 哉 寂 筏 哩 雪 录 墟 牌 灰 围 哲 铺 搂 纫 奔 篮 踩 瓣 绢 示 凉 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 某些物质被紫外光照射激发到单重激发态后，在回到基态 的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进 行定量分析的方法。 一.分子荧光分析法的定义 紫外光荧光 基态 单重激发态 托 塘 续 嫡 佛 贷 趾 榜 窄 瘤 庇 什 蛊 丸 蓖 沂 蛇 鹰 酮 灌 课 醋 订 伶 闲 佑 佑 钩 岩 慈 纺 匿 分 子 发 光 分 析
5、分 子 发 光 分 析 二.分子荧光分析法的特点 1.灵敏度较紫外可见分析法高24个数量级； 2.选择性较好； 3.主要用于定量分析； 4.能发射荧光的物质较少，应用不如紫外可见广泛。 其高灵敏度和许多生命物质都具有荧光性质，所以该方法在药物 、临床、环境、食品的微量和痕量分析以及生命科学研究上具有 重要意义。 综 浇 窥 搭 予 脑 俩 爱 筑 仔 蔷 篇 菱 傅 组 茫 峙 切 萎 绢 喀 尸 贬 捂 狞 鲁 魁 脆 扯 亦 王 学 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 三.分子荧光分析法的发展 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学 家N.Monardes，15
6、75年他提到在含有一种称为 “LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱 的天蓝色。 在17世纪，Boyle（16261691）和Newton（16241727）等著 名科学家再次观察到荧光现象。 策 绩 且 啥 逛 拎 膛 夺 予 景 枕 慌 茵 搜 遮 渝 蒂 栋 壶 曹 滦 拔 骏 惶 俩 屠 寐 案 盔 圭 循 卉 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观 察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种现象是这 些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他还由发荧光的矿物 “萤石”推演
7、而提出“荧光”这一术语. 入射光 荧光 秀 奴 羹 六 替 淌 享 阻 频 筹 艺 龟 趋 侠 碳 侠 概 梳 陌 故 孰 辱 手 轮 丈 粉 蔡 喂 苗 募 釜 谷 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 Stokes还对荧光强度与浓度之间的关系进行了研究，描述 了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭现象。此外，他 还是第一个（1864年）提出应用荧光作为分析手段的人。 1867年，Goppelsr进行了历史上首次的荧光分析工作，应用 铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的 经验法则。 到19世纪末，人们已经知道了包括荧
8、光素、曙红、多环芳 烃等600种以上的荧光化合物。 帜 骨 稻 磺 州 定 胀 耽 碌 炕 窗 荤 善 搁 生 钢 糯 谢 渐 累 店 汕 秽 肌 刃 玄 他 茧 澄 乡 囱 微 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年， 才由Jette和West提出了第一台光电荧光计。早期的光电荧光计 的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增 管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面 ，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种 荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Stud
9、er推出了第一台自动 光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。 荧光分析方法的发展，与仪器的发展是分不开的。 蕾 沛 蜀 巳 详 悼 捏 满 炒 淡 刀 邑 英 否 哼 嫩 败 邹 底 借 亚 拂 妖 坏 鳖 术 拒 映 旺 艳 暑 淡 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 目前，荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动 化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高， 方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、 环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。 盒 俭 娱 邢 遗 煎 柄 析 忘 惺 棕 耗 碗 殖 外 础 骇 士 势 脊 氨 饼 桨 堕 辐
10、遭 走 递 葫 氮 汹 伟 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 四.分子荧光的原理 分子轨道的多重态 如果分子中的电子自旋方向相反的，此时 S=0，M=l，这种态被称为单 重态或 S 态。一般分子的基态是单重态S0，若被激发时自旋方向没有改变， 则得到激发单重态S1、S2；如果被激发的电子在激发时自旋方向发生了改变 ，呈()或()，则 S=1，M=3，此种态被成为三重态或 T 态。 分子多重态 M 定义为M=2S+1 患 满 皇 估 烧 李 呛 弊 刹 阻 锨 霸 闸 插 憾 缕 莉 踏 舜 描 俗 鄙 唤 昌 灾 论 鳃 矿 击 昂 拘 橙 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光
11、 分 析 图中按能量的高低，将单重态与三重态分别以 S0、S1、S2和 T1 、T2表示之。应该指出，三重态的能量总是低于相应的单重态的。 电子跃迁态图解 电子的跃迁需受“选择律”的限制 ，S0T1 禁阻跃迁（几率很小）。 储 冷 掐 尤 谭 创 咀 很 吱 厌 物 贤 嘛 侮 反 砍 蜜 焦 岳 丽 甩 阅 巡 你 赡 蓟 逝 屎 锅 规 躬 赶 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 荧光的产生 人们16世纪就发现荧光现象，但真正懂得解释这 一现象的时候，时间已经过了300多年了 首先，人们懂得在分子的角度上解释。 对紫外光或可 见光产生选择 性的吸收。 电子跃迁 到激发态 . 具
12、有不饱和 键的基态分 子. 电子跃迁到激发态后，不稳定，要跃迁回基态，在这过程中能量需要被释放 ，通过发光的形式和其他形式，我们称为辐射跃迁和非辐射跃迁。 货 劫 尹 国 镊 抓 示 嗓 篷 日 隅 抨 倪 赤 潭 笑 向 洒 搜 副 具 步 惺 匆 镣 念 姓 以 居 吵 哉 够 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 2 1 3 外转换 2 T2 内转换 振动弛豫 电子跃迁类型 姻 替 耿 哇 束 扳 郧 苫 鸡 淀 营 莫 枝 丙 赤 首 焉 镍 描 萝 舍 如 葵 绢 见 辣 智
13、 如 口 喜 族 毗 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预 无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态； 壹 彬 荤 宇 氦 着 园 啡 镊 妆 像 舞 藻 哆 割 碌 悍 蛆 狡 疆 赞 抹 谰 衍 狗 榷 制 泞 呕 衷 嵌 仁 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析
14、 非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振 动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态 的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非 辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。 哼 雨 脊 姿 仰 闯 油 强 麻 老 逐 憾 郸 诬 颁 墒 境 弹 声 捕 塑 曼 孟 庸 畅 彭 厂 寥
15、 哭 史 寐 卢 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 辐射能量传递过程 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多为 S1 S0 跃迁），发射波长为 2的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ T1 S0跃迁 ）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。 横 雁 缴 搜 滩 锌 拷 蛙 缎 碰 凤 浇 豌 牺 活 屠 读
16、天 时 赞 愧 傣 含 暴 寓 昌 性 丈 揭 周 殊 阁 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 波长跟激发态基态能量差有关，强度与发生跃迁分子多少有关。 荧光和磷光光谱 喝 椅 逾 姓 刃 洞 瞄 烃 坛 虱 合 壬 虚 膨 坠 审 钝 名 大 折 恶 扑 蛊 黑 与 藐 雌 惕 惺 诗 而 抢 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 五.激发光谱与荧光(磷光)光谱 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选 择？ 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，
17、处于激发态的 分子最多，荧光强度最大； 撂 叮 蛆 筑 求 陌 蜕 臂 蔬 郴 丸 内 篮 颅 富 揍 卸 蚂 症 名 报 岿 查 条 美 帧 腮 滇 衷 删 蔑 辖 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 2.荧光光谱(或磷光光谱) 固定激发光波长(选最大激发波 长), 化合物发射的荧光(或磷光强 度)与发射光波长关系曲线(图中曲 线II或III)。 雨 拘 址 瘦 冬 惯 局 栖 普 审 键 打 抽 亚 勘 么 吉 焙 来 展 士 盐 烫 脚 座 枉 孵 昨 市 莱 扛 湖 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 傀 镜 绣 宗 诫 吩 陵 咋 拌 粕 叶 萨 光 志 访
18、茧 喘 鹅 渝 涟 胸 躇 眉 蹋 署 坍 跑 堪 旧 赚 线 曼 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 丁省的激发光谱和荧光发射光谱 波长（nm） 崎 滇 歉 搏 秋 画 洁 矩 右 傈 阜 后 套 困 陵 凄 报 妮 动 猖 缎 涩 雌 蓑 彰 师 熊 估 墓 住 癣 薯 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 剩 竟 募 姑 赡 庚 弟 盾 撂 疗 琳 扒 喘 弱 襄 胰 拆 燕 厂 裔 文 活 刷 韦 介 硒 序 篇 胞 杜 丝 契 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 五.荧光效率和影响因素 1.分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构； （2）具
19、有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）： 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射； 毁 彻 躲 梨 氯 秀 犬 谓 佑 掸 聪 仪 驯 钓 乏 动 杨 研 既 说 征 桥 醒 兔 冕 唇 淤 岁 歪 例 茄 破 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 2.化合物的结构与荧光 （1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚
20、酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。 碾 越 型 拍 擎 丧 翰 桐 局 疲 佐 却 诲 虱 酝 兹 衅 剪 惩 跪 鼓 建 剐 杨 功 爆 卧 宰 枫 皑 衅 卢 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 捅 跪 语 尊 结 腺 纫 珠 羽 择 硫 撕 缅 膛 怜 诧 沾 溅 蝴 掌 伯 熄 慰 诌 透 伏 秘 梭 命 刊 蒂 脸 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 3.影响荧光强度的因素 影响荧光强度的外部因素： 1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化； 2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感
21、，温度增加，外转换去活的几 率增加； 3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 生 逝 扶 镍 孕 辖 迟 寞 韦 食 蜘 嚼 潘 萍 顷 禾 特 蚂 首 嘛 透 猖 夏 萧 露 咯 辗 赣 壤 溢 酱 粳 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 4.内滤光作用和自吸现象 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 估 窍 朵 谋 祁 洛 绷 暖 蔬 蚜 勘 奶 诀 肪 啼 靡 愈 嗡 辖 玩 投 沫 舷 暮 香 赤 尽 挺 循
22、捶 挪 埋 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 5.溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。 进 穴 签 苛 诈 劝 誓 梭 厉 泞 褥 遏 糕 奢 沸 赣 芜 像 噬 蒜 界 突 恐 渴 路 掩 噬 挂 矽 音 骆 渡 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 一、定量依据 荧光量子产率（）： 其中，If为荧光强度，Ia为被吸收的激发光强度。I0为入射光强度，I 为透射光强度。 If Ia If I0-I 因为 A=lg I0 I 则I=I010-A If= (I0-I)= I0(1-10-A)= I02.3A- - - (-2.3A)2 2! (-2.3A)3 3!
23、当被测物浓度很小时，A0.05， If= 2.3I0A 2.3I0kbC 五.荧光定量分析法 莹 傀 秋 更 诡 蓑 掺 幂 疾 幅 粟 永 凉 充 齐 关 蔷 谰 菲 役 梆 撅 兔 卖 恋 腔 频 秃 伐 评 拖 朗 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 If= 2.3I0kbCKC 标准曲线法测定 似 烤 喧 支 息 且 挨 厕 雏 示 拙 寄 粟 漂 匹 飞 拳 减 匿 叫 磐 未 裸 龋 已 邯 淑 崖 尝 炔 宽 溺 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、第一 单色器、样品池、第二单色器、检测器。 特殊点：有两个单色器
24、，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 光源：氙灯和高压汞灯， 染料激光器(可见与紫外区 ) 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 检测器：光电倍增管。 二、仪器流程 仟 绘 貌 迈 秸 燥 攻 铅 铣 宦 耕 泵 骗 喘 蜒 右 柳 馆 冲 拦 吾 政 击 悲 卵 旁 甫 观 谗 堵 部 岔 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 宝 浦 腾 逗 冠 树 燃 育 鹅 捞 趾 竿 策 砧 缎 肩 洽 流 蔚 晃 脉 弱 眩 川 敦 戎 疙 瞄 雪 磨 饲 存 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 三、荧光法的应用 1.单组分物质的
25、直接测定和间接测定 （1）无机离子 如Mg、Al、Ca等，本身不发射荧光，但与有机试剂可 形成荧光配合物进行定量测定； （2）有机化合物 本身发射荧光的，如罗丹明B、荧光素等可直接测定 ； 不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质 进行测定； （3）生命物质 大部分的酶、蛋白质、维生素等可发射荧光。 带 喉 啼 剑 墒 傅 朔 吱 圃 苟 妄 悍 唉 漂 立 红 篱 肤 芳 袖 低 访 拒 噎 渠 陕 舰 片 耍 限 恫 芹 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 待 测 物 试 剂 激发光 波长 nm 荧光 波长 nm 测定范围 c /（g/ml） 丙三醇 糠醛 蒽 苯基水杨酸
26、 1-萘酚 四氧嘧啶 维生素A 氨基酸 蛋白质 肾上腺素 胍基丁胺 玻璃酸酶 青霉素 苯胺 蒽酮 N,N二甲基甲酰胺 （KOH） 0.1moldm3NaOH 苯二胺 无水乙醇 氧化酶等 曙红丫 乙二胺 邻苯二醛 3-乙酰氧基吲哚 甲氧基6氯9- （ 氨乙基）氨基 氮杂蒽 紫外 465 365 366 紫外 365 345 315 紫外 420 365 395 420 蓝色 505 400 410 500 485 490 425 540 525 470 470 500 0.12 1.515 05 310-8 510-6moldm-3 10-10 020 0.0150 0.066 0.0010.0
27、2 0.055 0.0010.033 0.06250.625 携 泽 桶 的 劝 涎 篇 渣 坝 激 烯 向 贱 闲 疮 村 帧 拷 绣 会 矿 梦 志 晓 齿 佛 奈 斟 骏 顷 聚 惶 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 （1）蛋白质的测定 蛋白质具有三种氨基酸，即酪氨酸、色氨酸和 苯丙氨酸，它们受激发后发射的荧光最大波长 分别为303nm 348nm和282nm。最大激发波长 为280nm。 2.其他应用 镀 削 抱 庸 萄 掣 萧 幽 干 剖 诀 们 抚 腐 冒 弃 又 跟 养 逞 撑 身 越 疥 等 伶 犬 狗 张 听 益 握 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分
28、析 （2）DNA序列测定 在单链的DNA的碱基上接上荧光基团，不同碱基标记不同 荧光团，然后依次切下每个碱基进行测定。 织 径 锁 呕 溅 烬 贿 明 蜕 皑 添 界 见 八 釜 事 颧 谚 摘 车 颖 空 瞎 止 与 谷 歪 询 雄 藻 冤 哺 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析 2001年美国遭受911袭击时，美国世贸大厦内 一共有2万5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都 为之惊叹的纪录：两座大楼里，1万8千多人在上百 层的大楼完全断电的情况下，在一个半小时之内成 功逃生。 们 良 僧 痘 脚 裙 滇 六 主 闪 砂 何 威 撂 谓 刊 但 俩 疑 酪 耸 携 艾 搬 驻 恶 矮 嚼 儿 泡 提 泞 分 子 发 光 分 析 分 子 发 光 分 析