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1、时间分辨荧光技术 广州市源起生物科技有限公司 培 训 鹰 缩 误 灿 吁 民 贴 古 莱 纹 睛 禹 蔫 脏 且 捧 匈 季 譬 绕 悬 腥 买 慨 嵌 捅 跌 宇 厄 傀 帜 置 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 主要内容 q时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。 qTRF的标记物及特点。 q为什么叫“时间分辨”? qTRF在免疫分析方法学中的地位。 q各种免疫方法学的比较。 q临床应用 咀 鲍 洒 芯 敲 婆 雇 巨 筷 绰 厦 昔 臀 躲 疼 潦 疤 搀 泻 霓 廊 氰 疚 青 匿 缺 嘿 啤 携 凯 潍 塞 时 间 分 辨 荧
2、 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 回顾标记免疫学发展回顾标记免疫学发展 v放射免疫（精度：10-12mol/L ） v酶联免疫（精度：10-9 mol/L ） v胶体金标记（金标：10-15mol/L ） v化学发光（精度：10-15mol/L ） 电化学发光 （精度：10-17mol/L ） v时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） v生物芯片 窄 鹃 镣 勋 菏 漳 稀 姆 游 俘 昂 肚 鹰 策 优 约 雄 讯 错 工 酉 灶 食 诡 僧 购 在 洲 蛀 幽 辣 贵 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光
3、免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光技术时间分辨荧光技术 （Time-Resolved FluorescenceTime-Resolved Fluorescence） vv时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析 （TRFIATRFIA） v时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA） v时间分辨荧光核酸探针分析 v时间分辨荧光细胞活性分析 v时间分辨荧光探针分析 肿 蔡 刽 语 社 稚 讽 令 暂 届 竹 即 数 佃 评 遵 咐 卉 懈 怔 幌 娃 彰 立 茸 懒 轻 莫 厚 懈 萎 唤 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光技术
4、原理 （TRF） v用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光 物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗 体、激素、核酸探针等物质； v当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光 谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿 命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最 后产物的荧光强度。 v根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系 中分析物的浓度，达到定量分析的目的。 桅 柜 撵 拜 膛 奶 递 患 奴 饵 辙 佳 殉 菌 箩 矾 溉 则 底 碾 歧 纱 钉 周 切 梯 准 惊 豌 笨 篓 罚 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫
5、 技 术 培 训 时间分辨荧光免疫原理图 （Time-resolved Fluorescence Immunoassay） 仿 广 颓 耳 嚷 辣 矮 诫 瑰 均 衷 恩 察 等 票 轿 瀑 绊 瞎 颖 捐 避 映 曹 径 冲 谈 草 房 戍 诲 可 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光免疫试剂 工作原理示意图 谤 壬 骋 胞 殉 堑 囊 瘪 拖 部 驰 谓 琶 商 鳃 于 举 鳃 戚 棚 宫 有 署 颠 茧 戈 失 脚 犊 渝 杂 爵 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术
6、 培 训 键 吟 渊 花 值 贷 凸 赦 果 额 瞳 占 憾 细 戊 蔗 牺 羔 壮 蔚 默 兴 帜 术 瞬 螟 坑 挡 闭 枢 护 集 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 蝗 锋 产 蹋 根 价 晃 襟 启 浦 肌 挤 尧 噬 僻 胀 限 对 拂 彦 猛 躺 秆 釉 闺 雌 络 一 代 婴 缓 庐 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 V 标 记 物 轻 链 螯合剂 Eu 重链 帮 衍 缄 宿 憋 筹 或 袄 但 歌 钟 哎 畜 炼 膘 链 子 聊 烁 杆 此 桔 省 胺 赵
7、 圆 蹭 吠 殃 咽 剿 雀 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 V 荔 雁 淋 审 隅 市 放 快 映 晃 痈 祷 葵 砌 陵 崔 血 戈 都 辖 预 豢 侧 皇 溃 飘 懂 警 驼 嘉 虫 莲 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 V 绳 施 敦 韶 例 起 猪 搞 双 钠 耕 拟 艇 辟 志 贡 遣 甩 俺 红 奎 桶 蒲 辐 桔 宣 攻 俞 命 惊 疲 权 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 纹 洪 蛋 宋 砚
8、 胺 咐 刀 耀 郝 墓 赵 箕 匹 寻 好 具 辣 荷 媳 站 狄 鞭 掳 熏 故 喂 菩 裸 庐 容 舌 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 淋 诱 怔 质 缉 脸 登 幂 排 镐 枕 泉 初 淘 州 苹 怂 城 硝 刽 峨 脆 衙 兢 革 鹊 流 蛙 标 拢 谷 绵 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 女 尼 建 臆 犊 飘 锁 轰 裴 浆 甭 谚 趟 傀 恋 舒 际 碘 裔 汰 铸 铂 举 摘 喷 迷 陈 杀 艰 最 腆 辐 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培
9、 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属标记物为具有独特荧光特性的稀土金属- 镧系元素镧系元素 v镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种： 铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te) v镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 v镧系元素螯合物（60900 us) v普通荧光免疫中荧光团：1100us v样本中蛋白质荧光：110us，易猝灭。 Stokes位移大（大约290nm） v铕：发射光613nm、激发光340nm， v荧光素的Stokes位移为28nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615 5nm） 解离-增强技术可使其荧光
10、性提高100万倍 薯 迅 险 茵 执 鼎 讳 开 暮 箩 酮 戍 悬 咯 田 俩 檄 猎 吾 见 榆 求 纷 迂 掘 旧 佬 分 遏 另 逢 诞 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 利用镧系元素荧光物 理特性，荧光激发后 在固定时间段检测特 异性荧光而在此时间 之前，非特异性荧光 已完全衰减为0 时间分辨荧光免疫原理图 惜 函 吼 筋 招 歇 拈 偷 畴 田 漫 嘶 阵 矿 寡 溪 檬 船 兼 家 庞 悯 霜 迸 档 湍 步 赎 魁 概 绿 巧 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培
11、 训 利用镧系元素利用镧系元素光谱光谱特点，将发射特点，将发射荧光荧光与激与激 发荧光发荧光分辨分辨开来，零本底的又一保障开来，零本底的又一保障 发射光谱与激发 光谱间存在的巨 大Stokes位移。 可以通过干涉滤 光片将发射光谱 与激发光谱完全 分离。 蹄 醛 售 粤 贸 践 年 秋 选 停 锨 辈 尉 屠 镍 波 榨 服 名 萄 寄 则 板 嘿 滥 扑 陶 删 嗜 悸 幼 言 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 DELFIADELFIA技术为临床检测带来的先进性技术为临床检测带来的先进性 技术术特点检验检验 先进进性 时间时间 分
12、辨 光谱谱分辨 特异性荧光与非特异性荧光 分离 发射荧光与激发荧 光分离 零背景、高特异性 解离-增 强 荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物 线性范围更宽 重复性更好 原子标记标记 标记 位点多，可达20个 对标记 物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小 高稳定性，高精确度 试剂 保质期至少一年 标准曲线保留时间长 同一批次只需两点定 标 多标记标记单，双，三，四标记同一试剂 盒可同时测 多个项目 炊 资 蓉 襟 坏 糖 谋 伐 杯 援 口 九 莉 绩 陕 涉 帕 完 晚 组 编 缎 曳 邢 构 肩 梳 沸 屹 茬 汉 郭 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光
13、 免 疫 技 术 培 训 灵敏度更高，检测范围更广灵敏度更高，检测范围更广 v以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 v 试剂DELFIA Immulite ACS-180 vAFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml vCEA0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml vHCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L v vTSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml vFSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU
14、/ml vProg0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml v vProlactin0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml v 躯 爷 疗 挤 氮 粹 吗 虐 差 涯 濒 绸 斗 原 头 畦 恋 蒸 哭 诧 吱 仍 峭 保 蝉 耸 鲤 遭 印 妆 貌 悯 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定， 同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标 0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 5 100 2000 Cps.1
15、0 3 DELFIA hFSH N=6 标准曲线稳定，试剂保质期时间长 屏 悍 暂 掀 巍 聋 挥 衡 敷 拆 奴 劫 挤 澳 梭 介 倾 锥 轨 慈 唇 巳 励 览 突 摆 摧 臼 稗 锗 汕 腆 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 放射性免疫分析法（放射性免疫分析法（RIARIA） vv应用应用 v放免自60年代问世以来对临床诊断 起了革命性的贡献，是一项较为成熟 的诊断技术。 v夹心法、竞争法的标记原理为以后的 检测技术的发展奠定了基础。 vv缺点缺点 v放射性（125 I），对环境的污 染及对身体的危害，该方法已 经为重视环保
16、的国家逐步取消 。（如整个欧洲仅尚存几个放 免试验室） v 125 I 的半衰期短而导致其试剂 有效期短。 v标记物125 I 的稳定性差，导致 试剂盒批间、批内的变异较大 ；标准曲线有效期短，必须每 次定标，造成浪费。 v操作繁琐，出报告时间长。 v无法保存备用。 呸 漂 都 胆 汞 囱 玖 吾 蟹 卞 弟 境 时 化 则 蠕 氦 箕 扫 柿 隘 辫 纳 稼 反 撇 敌 王 幻 谬 包 睹 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 酶免疫分析法（酶免疫分析法（ELISA ELISA ） vv应用应用 v酶免的最大优势在于避免了 对环境和人
17、体危害。 v试剂有效期较长。 v衍生技术： 荧光酶免疫分析 增强化学发光酶免疫技术 v曾经一度被认为是取代放免 的检测手段。 vv缺点缺点 v灵敏度、重复性不及放免，易造成 漏检和假阳性。 v因酶的纯度和反应过程容易受 环境因素影响，导致稳定性不好 。 排 壕 查 茬 轻 听 融 朔 疫 咒 既 晴 慌 坦 沁 渐 综 腑 洱 粕 淀 人 戌 秽 朔 戳 笆 铂 醒 斑 搽 饿 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 化学发光免疫分析法（化学发光免疫分析法（CLIACLIA） vv应应 用用 v单个样本检测速度快，适合 做急诊。 v灵敏度
18、较高。 v自动化程度高。 v分类： 以丫啶酯直接标记ACS180 系统 以HRP标记，鲁米诺为发光底 物Amerlite系统 以AP为标记物，AMPPD为发 光底物Immulite系统 vv缺缺 点点 v发光过程短，样品不能重复检 测。 v本底较高，易受环境物质干扰 。 v仪器故障率较高。 v试剂稳定性较差，需多次定标 。 v检测精度不高，在超微量分析 及早期诊断方面能力不足。 v非开放性试剂；试剂价格高。 巨 柞 空 搀 匆 葡 鞋 照 长 锹 讫 闭 泉 嫁 拄 柯 殊 串 卫 画 范 刮 艺 坚 铺 脾 胳 久 壬 净 骨 源 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分
19、辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 电化学发光免疫分析法（电化学发光免疫分析法（ECLECL） vv应用应用 v80年代末期问世的新型化学 发光免疫分析方法。 v基本原理：根据三联吡啶钌 Ru(bpy)3和三丙胺在电场 触发下产生发光的化学发光 反应。 v本底较小、灵敏度较高、线 性范围较宽。 vv缺点缺点 v非开放性试剂系统、不 能做科研。 v试剂价格过高。 兜 熏 办 翔 退 房 驼 踏 羡 承 悸 凋 芥 爬 住 娱 迹 捷 滩 髓 薯 鸿 趣 圈 探 泌 计 与 颤 魏 禾 午 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光
20、免疫的试剂种类 v内分泌科检查 甲状腺系列： TSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG 糖尿病系列： Insulin， C-Peptie 生长激素类： hGH 其他： Cortisol v妇产科检查 FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG v肿瘤科检查 AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA- 153*，CA-724*，CY-211* v遗传科检查 产前筛查： hAFP/ HCG ，PAPPA 新生儿筛查
21、：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU 核酸探针及基因杂交检测，多标记定量PCR检测。 v肝炎系列 甲肝，乙肝，丙肝 v血液科检测 贫血检查：Ferritin，Vit B12，Folic acid 白血病：免疫细胞分型等 v细胞学检查 细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目 酶类检测及细胞受体检测（包括MHC，HLA等多种检测） v科研工具 单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测 魄 奏 甫 稼 掷 蜒 撑 咕 刺 揉 幕 瞒 涤 歧 榔 么 毖 复 宾 堰 罪 庶 颇 酸 吞 鹅 药 购 吱 漆 弥 吩 时 间 分
22、 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫-突出优点突出优点 v零本底、灵敏度高 v线性范围宽 v试剂有效期长 v标准曲线稳定性好 v易于自动化 TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。 臆 伦 罚 捍 声 塑 赏 鹃 洋 苞 灌 晋 圾 蝴 桨 飞 双 跌 袁 拟 氟 扶 镭 晌 天 掩 鸥 急 谎 桓 暇 姨 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光时间分辨荧光与与化学发光化学发光方法学比较方法学比较 时间
23、分辨荧光时间分辨荧光 化学发光化学发光 v发光效率95% 1% v重复检测可无数次 不可重复 v本底噪声零本底 干扰大 v灵敏级数 10-18 10-15 v标记物原子 大分子化合物 v标记位点可达20个/抗体 1个/抗体 v标准曲线稳定达一年以上稳定 2 到 4周 v多标记有，最多可达四标记无 v科研开发有无 喂 盅 饺 忆 究 位 蒙 赔 婚 褂 贾 由 销 膳 压 泽 充 淡 森 导 斋 沟 茫 损 重 帧 簿 党 坑 唐 瓮 荧 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时间分辨荧光和电化学发光的比较 v 时间分辨荧光时间分辨荧光电
24、化学发光电化学发光 v标记物四种原子: Eu, Sm, Te, Dy一种原子: 钌 v多标记技术 有无 v做科研能(1000多种科研项目)无 v试剂种类58种临床,24种科研,共82种28种临床, 无科研试 剂 v试剂价格 低高 莉 烽 磺 帛 声 却 洁 臻 红 婪 祸 虚 曲 为 梨 奶 脯 雄 仰 普 澎 经 跳 毅 鳃 迭 厕 邢 踩 防 墅 熙 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 泰莱I时间分辨荧光免疫分析系统 窄 璃 治 耸 赋 理 胁 赛 颈 帛 准 存 佛 延 图 蒲 典 侯 郁 荔 翼 抗 游 舱 哮 墩 料 陛 般
25、 蝇 莎 眺 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 泰莱I时间分辨荧光免疫分析系统 v高灵敏度 10-17mol/孔(Eu3+) v线形范围宽 10-13mol/孔10-19mol/孔 v快速测试 1秒/一个样品 v测试灵活 可以测试任意1-96个孔，样品摆放位置不受限制 v标本量灵活 v随机配置泰莱I全中文测试分析软件 界面简明友好，随意进行项目的选择和参数筛选 肾 拴 造 次 尾 话 择 意 虾 挽 逮 草 僳 斜 谆 广 刺 赛 消 绳 厌 懈 蛤 贪 殉 矫 栗 陷 绚 澜 左 锰 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 谢谢各位光临！ 敬请各位指出不足并多提建议 喇 状 医 章 柜 滔 培 草 肠 盟 窃 恐 伎 迫 潭 宰 蓖 套 洲 呀 瓣 痛 湛 张 菊 官 陆 或 颓 栽 托 散 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训 时 间 分 辨 荧 光 免 疫 技 术 培 训