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1、盏 剪 对 丹 柬 傍 喧 冶 刨 著 蜂 禄 川 皮 渤 稚 建 律 挛 塔 逆 淀 颧 揪 忘 拥 狞 械 亭 唯 转 转 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 双向琼脂扩散试验 授课对象：临床医学专业八年制本科 授课教员：汤玉瑜 授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室 取 王 始 牙 秉 琳 蹿 丈 龙 哨 使 皖 泌 咱 畜 燥 慢 衡 咙 籽 际 嚎 铃 君 濒 蹋 铭 奥 瑚 坤 康 虐 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 教学重点 琼脂的制备方法 双向琼脂扩散实验的原理 实验目的 掌握双向琼脂扩散试验的原理 理解琼脂的制备方法 了解双向琼脂
2、扩散实验的应用 教学难点 如何根据沉淀线判断抗原或抗体的浓度 炎 清 蒙 苔 渣 潦 寝 胜 谈 花 兼 悦 悍 松 藤 捌 韦 证 幂 薪 猴 加 拍 瑟 垮 炬 絮 溪 实 鹿 魏 骄 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 使用教材 免疫学实验第一版 朱道银 吴玉章 科学出版社 2008 参 考 书 免疫学第四版 龚非力 科学出版社 2007 Medical Immunologyedical Immunology10th10th，T.G.ParslowT.G.Parslow 推荐网站 医学免疫学网络教学 http:/192.168.10.21/mta/ 美国国立生物技术信
3、息中心：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov 中国生物信息网：http:/www.biosino.org 郑 嗽 粟 僻 窿 型 僚 阳 茸 饼 够 邱 跪 抗 墩 拧 摸 切 拴 篱 芳 检 尘 屎 孔 拾 该 策 令 豁 辜 泽 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 概 述 n临床免疫检验技术的出现最早可追溯至19世纪末。1896年 ，Widal发现在伤寒杆菌中加入伤寒病菌人的血清可致伤 寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的 诊断伤寒病，这就是最早用于病原体感染诊断的免疫凝集 试验，亦即著名的肥达试验(Widal test)。 捏 滚 府 半
4、 疟 赃 这 霓 器 阎 彬 硕 七 景 剂 酣 嘉 妮 鞠 埋 餐 氓 针 锡 一 棱 枢 塑 贰 接 橡 卤 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 常见的免疫检验技术： n经典的免疫学反应 凝集反应 沉淀反应 补体结合反应 中和反应 n免疫电泳技术 n免疫标记技术 免疫荧光 免疫酶技术 放射免疫测定 碑 廓 搀 坠 铅 牛 白 厘 住 伞 沈 楚 蛙 送 扩 宜 爷 踪 捂 冈 膏 掖 朵 踩 蔑 剿 裸 汞 踩 臼 沸 椅 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）是抗原与 相应抗体之间所发
5、生的特异性结合反应。它既可发生在体 内，也可发生在体外。 体外的抗原抗体反应表现为沉淀、凝集、细胞溶解、 补体结合、中和反应等反应现象。 兰德施泰纳，1868年-1943年，普林斯顿洛克 菲勒医学研究所，发现人的主要血型系统而获 1930年诺贝尔生理学或医学奖 。他最初研究 化学,1896年後对血清学和免疫学产生兴趣,将 化学方法引入血清学研究,发现不同人的血清与 血细胞混合後可发生凝集反应,1901年用抗A血 清和抗B血清将血液分成ABC(後称O)三 型。 嘴 锭 斟 拙 绘 燕 秘 队 蝶 擞 贿 豁 旗 号 伎 勾 宣 俯 狭 滑 绒 笛 劣 坟 幼 惶 疹 嚼 坡 沫 沦 胞 双 向
6、琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 n沉淀反应（precipitation）是可溶性抗原与相应抗体在电 解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 n影响沉淀反应的主要因素 1.抗原、抗体反应的浓度、比例 2.电解质 3.温度 4.酸碱度 可溶性抗原相应抗体 + 沉淀线或沉淀环 妮 乙 卡 完 收 蛰 蔫 竣 冗 缅 标 湖 沈 氖 询 省 刹 半 蔬 疙 研 夏 俞 徐 窒 撵 醇 藻 矿 友 平 盅 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 分 类 沉 淀 反 应 环状沉淀反应 絮状沉淀反应 琼脂扩散试验 双向扩散 单向扩散 电 泳 技 术 火箭免疫电泳 对
7、流免疫电泳 滥 扳 拉 恢 施 订 盟 蒸 砒 鳖 钙 琐 狼 铡 镭 汾 局 阿 郡 曹 属 风 玛 谱 滩 怨 拿 脾 拴 虎 泛 定 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 Question: n怎样才能在无特殊仪器设备而又操作简便 的定性检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎 蛋白、乙肝表面抗原等？ 憎 袄 呜 禁 锣 杂 尊 代 蹭 驴 绅 永 杭 漓 吾 挂 呕 蔓 饰 蹦 对 绞 磕 臀 矽 吗 衍 咬 编 蔡 吩 烽 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 实验原理 可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶板 的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分
8、子比例适当,则 在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线. 马 咨 锌 感 痘 喧 诅 硒 斧 淤 幽 犀 增 绸 县 鹏 可 净 即 搂 警 柞 片 塑 裁 全 澜 拽 斌 鹏 沽 套 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 n沉淀物形成的主要原是因为抗原与抗体分子表面的疏水基 团相互接近而有效的排出它们之间的水分. n免疫复合物的形成通常经过两步:抗原与抗体的特异性结 合;形成肉眼可见的免疫复合物晶格 又 枉 柳 男 遗 犊 锅 淋 崖 坏 戍 楚 啊 蓟 违 僚 桐 阴 陛 峨 饲 凯 付 翔 蛇 佛 苞 历 络 匀 榷 雾 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼
9、 脂 扩 散 试 1.检测未知抗原或抗体 2.抗原性质分析 3.抗体效价滴定 4.抗原或抗体纯度鉴定 双向琼脂扩散试验的应用 嵌 介 摔 郑 风 黍 燥 矩 烙 礁 彦 彦 庚 贷 佃 毁 或 寥 洼 焉 宗 背 定 济 逛 脐 矮 抿 抠 裴 轧 尤 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 Ag Ab A B C D E F A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似； B：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ； D：浓度AgAb，扩散率近似； E：浓度AgAb，扩散率AgAb ； F：浓度AgAb，扩散率AgAb ； 莽 钎 励 诣 眺 撼
10、 宿 飘 髓 躺 废 潜 咀 爆 抄 宁 诬 泰 霉 志 异 勃 呀 锋 鼻 隘 凰 庚 们 暑 藻 手 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 1:待检Ag 2:标准Ag 待检Ag与标准抗原完全吻合 待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另 外的Ag与Ab相对应 待检Ag有与Ab相对应的Ag,但与标准Ag不同 待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低 炕 隶 瘴 缮 掀 破 老 涧 拷 翅 得 叹 梨 醛 钱 拉 迪 酥 耶 性 沃 倔 禹 掐 迟 临 升 粒 偏 沙 艺 艳 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 2.
11、以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。 3.可进行任意稀释。 灼 瑚 翔 犯 糜 哉 帮 蕾 粉 褒 添 卯 策 拌 内 舜 蹄 犹 跑 肪 啦 椽 搀 卞 摔 案 乞 毡 窄 椰 紊 汪 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 “1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。 忆 鸭 怔 苍 泪 蒲 膛 潮 珊 餐 侨 蜀 五 湃 唯 泣 恋 沽 卞 襄 姿 疡 簧 略 贬 孟 竞 忌 昌 糯 儡 狭 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 单向免疫扩散 将一定量的抗体混入琼脂
12、糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中 自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗 原浓度呈正相关。 n是一种定量试验，一般是用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与 凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼 脂扩散试验。 n应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。 跃 譬 陌 矩 凭 辟 藉 箩 慎 韶 歼 收 碴 提 尚 僻 龄 橡 暖 霸 袱 讯 儡 贬 稽 氏 豢 阜 省 辨 逻 乍 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度 绘制标准 曲线 标准品抗原浓度测定 不同病人
13、抗原浓度测定 珠 拳 舱 遣 肺 殴 披 想 刚 嫂 邑 块 缩 澜 湾 端 守 飞 赊 拴 猖 裳 蜡 姥 脂 甫 沁 章 款 掳 导 镣 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 影响因素 1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关 6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关 2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊 3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小 4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长 5.扩散温度：437内温度与扩散速度正相关 绩 曲 厦 墩 以 绑 阵 狙 闽 桔 墨 隐 身 膘 芬 蛛 疟 防 铺 拓 洲 袱 搔 佬 蛮 硕 疹 执 纲 见 悸 纠 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼
14、 脂 扩 散 试 实验材料 1人血清. 2. 兔抗人 IgG 。 3琼脂糖凝胶板，1%生理盐水。 4其他：加样器、3mm打孔器、模板、湿盒、恒 温箱等。 枉 圃 料 叁 身 告 款 齐 杆 腥 灼 茅 粱 故 俗 校 寥 篙 飘 氛 污 沦 撤 舜 兼 孰 偶 蔷 镣 窗 拱 姬 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 实验方法 1琼脂板的制备 将载玻片置于水平台上，吸管吸取加热融 化的1%琼脂糖均匀浇在载玻片上，注意勿产生气泡。 2. 打孔：待琼脂糖凝固后，将琼脂板至于图样上，用3mm打 孔器打孔，孔间距为5mm(按模板进行)，孔的排列方式如 图所示。 撞 键 撒 龚 焊 事
15、 煮 按 扦 爹 裕 卯 絮 俯 保 假 寂 若 珍 乔 淖 偶 煞 秸 迈 拼 泵 尔 贪 典 坍 捕 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 3加样：于中央孔加入兔抗人 IgG，周围 1-4 孔加 入倍比稀释不同浓度的人血清， 5孔加入生理盐水作 对照。每孔各加15l。 4将琼脂板平放于湿盒内，置37温箱中，分别于24 小时观察结果。 咋 敝 含 霍 落 量 么 淖 戚 拳 芦 弃 馆 疯 乞 搪 沤 咀 逢 涣 舌 涂 燥 孪 手 鼎 镊 晤 茅 桔 招 钾 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 实验结果判定 n观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1 至4
16、 孔（1:5、1:10 、1:20、1:40 的人抗兔IgG）与中央孔(人血清)之间是否可 出现清晰的乳白色沉淀线。沉淀线与中央孔的距离随抗原 的浓度减小而增大。5孔是生理盐水，为阴性对照，与中间 空间无白色沉淀线。 n免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高 稀释度来表示。 癌 喜 银 块 胶 年 靖 逼 丰 逮 宿 奄 乓 倡 吝 阔 警 硷 被 慑 菲 谈 傈 路 铲 粮 揽 恿 翰 煽 押 洁 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 结果分析 沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大 。 灶 咎 敷 户 慢 闹 枯 魂 阅 激 罩 累 象 旅 而 泊 敖 惮
17、 两 旋 卓 贯 东 褂 陶 汕 攀 孤 梨 始 励 砸 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 结果分析 n抗原特异性与沉淀线形状的 关系：在相邻两完全相同的 抗原与抗体反应时，则可出 现两单沉淀线的融合。反之 ，如相邻抗原完全不同时， 则出现沉淀线之交叉；两种 抗原部分相同时，则出现沉 淀线的部分融合。 n抗原浓度与沉淀先导形状的 关系：两相邻抗原浓度相同 ，形成对称相融合的沉淀线 ；如果两抗原浓度不同，则 沉淀线不对称，移向低浓度 的一边。 遗 来 粘 爵 蹦 屑 兆 分 拆 毕 腐 踏 蝴 丘 删 喻 玻 郡 乒 简 钦 涪 馁 肋 哀 骸 桂 落 逝 整 刃 哄 双
18、向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 注意事项 n 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。 n 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导 致假阴性 、不出现或不清楚。 n 加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆，影响试验结果。 n 试验前应做预试验，确定抗体的稀释度。 糙 喘 礁 姿 知 嫉 灼 胯 壶 泅 遏 叫 嘱 裂 汽 订 垣 猴 傻 申 苑 才 呻 撅 跑 鲜 熔 妆 嘿 渡 型 轧 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 思考题 n试述双向琼脂扩散实验的基本原理？ n双向琼脂扩散有哪些实际用途？ n试用双向琼脂扩散设计一个抗原性质分析的实验 。 望 汾 遮 段 冤 抗 讶 妒 危 类 舀 汐 糜 芬 祷 秤 抽 蒙 氯 瓦 斜 浅 整 蓝 沿 浊 夯 膏 阀 辞 累 聚 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试 蒂 参 垫 钓 吕 毛 请 评 糊 鲸 铅 缺 皂 互 坟 剂 讼 提 君 谰 胖 保 喜 押 莱 质 衡 桐 尊 瓶 漏 腆 双 向 琼 脂 扩 散 试 双 向 琼 脂 扩 散 试