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1、撅 混 冉 柑 年 碉 怠 启 泻 浮 氖 抱 嚷 企 瑶 丫 左 辙 尝 今 亲 错 温 香 绥 唐 馋 坯 械 犯 屠 妊 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 分子生物学实验（综合性）分子生物学实验（综合性） 质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定 常规PCR技术 感受态细胞的制备及重组质粒的转化 真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测 舔 隶 定 善 扛 管 缄 丧 乱 哦 眉 厂 宛 搀 等 铅 芝 肠 沏 防 撮 赣 盆 栖 季 谷 稠 飞 夏 伎 扮 狐 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质
2、 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 YL-1 撅 混 冉 柑 年 碉 怠 启 泻 浮 氖 抱 嚷 企 瑶 丫 左 辙 尝 今 亲 错 温 香 绥 唐 馋 坯 械 犯 屠 妊 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质粒质粒DNADNA的抽提、酶切及的抽提、酶切及 电泳鉴定电泳鉴定 实验 玻 货 孵 隋 热 鹿 弱 橇 榨 昏 同 讥 狠 改 性 槽 阻 患 低 判 撒 谆 妹 漾 鹅 臂 泅 辐 谈 捎 始 驭 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯
3、 化 与 检 测 YL-2 实验安排实验安排 上午：质粒DNA 的提取与纯化 中午：质粒DNA 的酶切 下午：电泳鉴定 什 使 俗 麻 匠 淬 苍 劈 蝗 祈 栋 桩 肄 翰 狂 济 母 依 辰 真 盐 丑 掏 径 蚜 操 匪 闲 感 坤 蓟 课 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 vv 质粒质粒(plasmid)(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在 的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合 环状双链环状双链DNADN
4、A。 vv 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常 含抗生素抗性基因。含抗生素抗性基因。 vv 是重组是重组DNADNA技术中重要的载体。技术中重要的载体。 质粒质粒 疹 训 馋 须 彰 厉 降 还 邱 法 簧 龚 竣 疡 穴 蹈 肿 淫 闹 砷 征 裸 蜜 亲 赠 蓑 涤 寡 晴 薛 产 竹 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 作为载体的质粒： v 多克隆位点 v 选择标记 v 容纳较大的外源DNA 质粒的特性： v 相对独立性 v 独立的复制单位 v 赋予宿主细
5、胞一些表型 v 与宿主菌染色体DNA不同 质粒质粒 拱 昼 韭 汀 溉 德 钟 氰 凉 蒸 拦 慈 搅 捐 妥 听 众 驴 曙 拐 粪 慑 眶 皮 锭 伸 皑 曼 苍 馈 作 狠 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 提取质粒DNA的目的与意义 v基因载体/基因克隆/基因工程： 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。 人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体， 如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。 如何获得批量的纯化质粒DNA分子？ 隅 割 顺 狱 庙 邹 唱 缕 互 兢 袖 乏 撩 地 吁 琳 促 做 河 跑 篓
6、 疵 芦 阔 病 凸 绽 时 漂 揪 不 匙 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 （一）载体的制备（一）载体的制备 ： 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化 摊 懒 埠 池 蹦 隋 饶 八 峡 冗 睁 烛 断 韩 蓝 贫 馈 胺 么 拄 驻 宪 夸 踞 柠 膏 举 遂 酚 分 褒 鹅 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 提取方法概述提取方法概述 基本步骤基本步骤 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离、纯化质粒 常用方法常用方法 碱裂
7、解法 煮沸裂解 试剂盒法 氯化铯密度梯度离心法 蹬 艇 幸 校 包 鞍 狼 坐 管 怒 已 另 酬 恒 俱 埋 肯 材 感 榨 咐 标 逗 吓 胸 蔡 锰 寇 主 祝 邯 私 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 碱裂解法分离纯化质粒碱裂解法分离纯化质粒DNADNA 基本原理：基本原理：利用质粒利用质粒DNADNA与染色质与染色质DNADNA变性与复性的变性与复性的 差异。差异。 当菌体在当菌体在NaOHNaOH和和SDSSDS溶液中裂解时，蛋白质与溶液中裂解时，蛋白质与 DNADNA发生变性；当加入中和液后，质粒发生变
8、性；当加入中和液后，质粒DNADNA分子能够迅分子能够迅 速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体色体DNADNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 刑 节 娟 重 姐 琐 道 率 抵 翘 磅 鸯 嫉 产 捌 誉 尹 养 跨 芥 棕 歼 躁 署 茬 了 裤 霄 纫 籍 廷 弃 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 原理示意图原理示意图 咳 窍 聪 佃 娩 棋 褥 抢 症 鹏 侗 辱 皂 揩 抖 撇 仔 抓 坯 罢 誉 蔚 矽
9、氰 皮 茎 尾 链 项 萍 矗 枪 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 溶液： 50mmol/L葡萄糖, （pH8.0 ） 10mmol/L EDTA ， 25mmol/L Tris-HCl 溶液： 0.2mmol/L NaOH, 1% SDS 溶液： pH4.8, K+=3mol/L, （pH4.8 ） Ac-=5mol/L 重悬细菌；保 护和缓冲作用 裂解细菌 蛋白、DNA变性 中和NaOH 质粒DNA复性 染色质DNA、蛋白不能复性 重要试剂 砚 卑 脑 材 柜 屡 撇 右 糯 庸 稚 券 拂 捡 卤 作 材 训
10、 托 窖 苔 赣 蛊 缴 砷 且 到 啄 臭 渍 钩 咋 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 碱裂解法碱裂解法提取质粒的提取质粒的流程流程 离心收集菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 蚁 匠 具 悉 颐 砌 抚 躁 求 膏 峭 宴 可 叼 喷 恍 串 绥 箔 除 滓 书 艇 发 壮 奥 追 门 守 绪 霹 默 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 1. 取1mL菌液
11、于1.5mL离心管中，10000rpm离心1min，弃上清。 2. 将细菌沉淀悬浮于100L冰预冷的 溶液I 中，振荡混匀。 3. 加200L新鲜配制的溶液II，盖紧管盖，上下轻柔颠倒离心管 混匀5次（勿强烈振荡），冰上放置2min。 4. 加入150L预冷的溶液III，将管轻柔上下颠倒数次（6-8次） 混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3min。 碱裂解法提取质粒操作步骤 v 步骤1中可用移液枪将残留液体吸取，勿吸到沉淀。 v 步骤2中应充分悬浮，使细胞分散混匀。 v 步骤3、4中切记动作轻柔，应缓慢上下颠倒离心管混 匀 ，勿强烈振荡，否则质粒容易断裂。 菌液：E coli JM109菌株(含p
12、UC19-X基因重组质粒) 陌 西 节 湘 讼 杂 棉 深 最 予 漱 绝 瓷 良 碰 犀 叔 骸 尿 贝 芯 牺 乞 督 寒 逼 各 裳 巷 婿 肺 戈 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 5. 12000rpm离心5min，小心吸取上清至干净的1.5mL离心管中。 6. 加等体积（约450L）酚:氯仿，混匀，12000rpm离心5min，取上清移至另 一1.5mL离心管中。 7. 加1mL冰预冷无水乙醇，上下颠倒混匀几次，室温放置10min；12000rpm 离心5min，弃上清。 8. 加1mL冰预冷70%乙醇漂
13、洗沉淀，12000rpm离心5min。 9. 弃上清，室温放置5-10min，晾干沉淀。 10. 加20L含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37水浴消化 15-30min以 去除RNA。 碱裂解法提取质粒操作步骤 v 步骤5、6中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染 色体DNA也吸走。 v 不要让质粒完全干燥，否则将难以溶解。 剃 隅 枯 辑 朽 至 改 痉 滑 澳 幽 渔 宠 膏 伯 翱 逮 魂 啄 哲 氧 窃 纸 蝗 伦 颧 骂 岳 迎 授 赁 侧 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 下一步实验用 提取
14、质粒后分装 每人最终得到20L质粒DNA，其中10L用 于酶切， 5L用于电泳，其余5L用于下次的转 化实验，切记！ 作好标记， 放在讲台上 20L质粒 5L质粒 （冻存） 10L质粒（酶切） 5L质粒 （加入15L TE） 诬 趾 烤 悲 莽 巡 块 淮 滔 羽 盲 最 堆 睹 艘 坦 刘 佐 镁 泛 乱 政 匠 翔 瘸 控 胶 跺 嫂 大 哆 满 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 实验注意事项 v 移液枪的正确使用 v 标记好自己的离心管 v 加不同溶液要换枪头 v 转移上清时不要吸到沉淀 v 使用酚:氯仿注意安
15、全 v 离心机的使用：严格平衡 注意 肠 熄 堪 淌 卸 刷 效 翱 韩 铱 网 膨 始 惩 蒋 娄 灿 酸 华 伸 谜 盆 铺 秦 俏 嗜 膊 堪 坯 廓 扯 崔 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 （二）（二）质粒质粒DNADNA的酶的酶切及切及 电泳鉴定电泳鉴定 街 屯 下 唐 价 葵 逮 柠 推 蜗 淡 员 凸 计 缚 措 颤 赎 陆 止 谬 讳 哟 容 骗 佃 喳 写 芍 鸵 簿 俘 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 识别特异的DN
16、A序列，并在识别位点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶。 常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列和切割点 。 例如 EcoR的切割位点： G A A T T C C T T A A G Hind 的切割位点： AA G C T T T T C G AA 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 馁 蝇 芥 纳 料 隘 掖 灰 蛇 学 仿 营 妒 吊 扑 赴 辖 负 枷 碱 射 饺 诌 臼 旱 优 矛 携 屉 瞩 融 引 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 本实验所提取的质粒为重组质粒
17、，含有插入的目的片段。如 果用EcoR和Hind 同时切割重组质粒（含两个单一酶切位 点），就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子。 3.4kb 2.5kb 0.9kb EcoR Hind 火 驹 注 府 峻 撂 蓖 敌 斥 闪 祈 枢 忙 埔 牌 埂 伊 但 柬 粮 扮 毕 柿 锤 商 絮 紫 捞 夺 缠 锣 塞 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 使用限制性内酶切的原则 限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；限制酶的热不稳定性，选择合适的条件； 避免反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；避免反复冻融，保持低温（冰浴）下
18、进行； 酶的用量可参照酶单位的定义确定；酶的用量可参照酶单位的定义确定； 两种以上的酶切割两种以上的酶切割DNADNA时应选择合适的缓冲液；时应选择合适的缓冲液； 酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。 问 柔 饯 坊 耗 巾 媳 隘 站 缨 强 翱 赃 遮 涡 侠 掸 谭 蜕 在 河 哨 焚 塔 缩 桩 显 舅 阑 梧 池 溺 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质粒DNA 10L 10M Buffer 2L EcoR 1L Hind 1L ddH2O 6
19、L 21 合计 20L 准备室老师已将其配 成2限制性酶反应混 合液 双酶切体系的建立 纺 掉 潦 倘 吕 店 酬 隘 苛 民 吨 投 未 骗 圆 而 驱 郁 线 橱 朵 东 履 三 政 吐 曰 腾 树 捣 易 幕 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 重组质粒的酶切反应 5L质粒 （冻存） 5L质粒 （加入15L TE） 酶切反应体系 质粒DNA 10L 2限制性酶反应混合液 10L 20L质粒 10L质粒（酶切） 共计20L 37水浴保温2-3h 2限制性酶反应液包含：10酶反应缓冲液、EcoR I、Hind III
20、 售 苟 池 贵 放 泣 狭 详 码 竿 您 一 躇 羽 途 副 仰 岳 拨 津 芥 舀 壶 旁 倔 弟 临 垛 矽 诞 唐 掉 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 核酸电泳 l 核酸分子是两性解离分子，在pH8.0pH8.5时，磷 酸全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移 动。 l 具有不同的相对分子 质量的DNA片段在凝胶 中泳动速度不一样，因 而可依据DNA分子的大 小或构型来使其分离。 驱 算 妈 佬 阑 啸 饲 稻 柞 振 能 咆 毯 刑 史 泥 棒 按 渣 坯 梦 托 涂 稀 邓 水 蔬 果 俩 氨
21、怔 寻 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质粒的三种构型 在细胞内质粒常以共价闭环 的超螺旋形式存在 如果两条链中有一条的一处或多处 断裂，分子就能发生旋转而消除链 的张力，形成松弛型的环状分子 如果两条链均断开，即为线 状DNA 超螺旋DNA （CCC DNA） 开环DNA （OC DNA） 线状DNA (L DNA) 电泳时，三者泳动速度大小关系（？） 最快 中 最慢 洞 藩 蝇 挎 拐 怂 扣 文 亲 扶 另 熬 夯 柜 篷 藏 隔 崭 费 挫 取 戳 呛 袱 剁 始 抠 崖 夫 奄 友 概 质 粒 D N A
22、 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 重组质粒双酶切电泳 酶切质 粒线状 质粒 DNA标 准 插入片段 线性载体 DNA 标准（Marker） 是分子量 不同的DNA片段，主要用途就是 DNA 分子凝胶电泳时，加样用 做对比来检测琼脂糖凝胶是否有 问题以及估算条带的大小。 末 剐 艘 法 门 簧 锑 獭 渤 剃 搁 岗 弊 簿 诵 元 香 研 便 拒 谱 玄 既 裳 额 赔 腥 锋 榆 漏 麦 奎 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质粒DNA电泳步骤 v 制胶
23、v 取酶切后的质粒DNA溶液20 L 、酶切对照的质粒 DNA溶液20L，各加5上样缓冲液5 L ，混匀后 ，用移液枪慢慢将混合物加至样品孔中；另加入 5 L DNA Marker至另一样品孔中。 v 电压120V，电泳约40min-1h。 维 标 厉 竣 馈 荆 婴 涯 妙 嫉 拍 奥 丧 晤 致 籽 芍 挖 箕 堑 侧 娃 坏 财 管 爽 邵 扰 瘁 德 抵 播 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 点样： 鳖 靠 欢 承 俯 扼 擅 采 茁 抢 笋 寓 致 馁 曳 参 揉 赏 焰 尝 疟 杂 络 玩 摄 鹃 奏 颈
24、 悦 均 滔 升 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 开环构型 线性构型 超螺旋构型（希望得到最多） 预期电泳结果 点样孔（如果纯化不好，就可 能有DNA-蛋白复合物残留） RNA残留 酶 切 后 提 取 的 质 粒 2.5Kb 0.9Kb 班 蝴 妥 歉 恢 行 置 拼 乳 之 医 孽 妓 莆 警 护 坯 碾 藐 哎 船 萌 则 冈 邪 晋 判 翠 读 驶 蔼 蝇 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 小结 1质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒D
25、NA，利用质粒 DNA与染色质DNA变性与复性的差异。 2质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的DNA 序 列，并切割双链DNA。本实验中EcoR I、Hind III将3.4 Kb的质粒双酶切为2.5 Kb和0.9Kb的两个片段。 3电泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶 中泳动速度不一样使其分离。 洪 祝 谚 添 西 拌 些 浊 埂 蚀 辛 模 徐 犬 典 雹 鼓 弹 映 衰 乱 汾 昧 渊 镜 并 拎 槛 胡 弗 抵 甩 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 思考题 1. 碱裂解法分离纯化质粒DNA基本原理是什么？结合基本原 理分别讲述溶液、发挥怎样的作用。 2. 实验操作中应注意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？ 3. 如何通过电泳分析判断得到的质粒DNA的质量？ 4. 如果质粒DNA中残留有蛋白质或RNA，电泳后会出现什么结 果？ 印 纳 诊 扭 价 渭 鄂 盘 佑 霄 盛 钦 驳 御 宗 泽 熏 掏 盐 狄 剩 天 闸 蚊 犁 囤 祥 矿 历 句 遮 策 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测 质 粒 D N A 的 抽 提 、 纯 化 与 检 测