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1、分子酶与酶工程,绪论,犊植盈蒋燎敞札罪辞莆媒蟹袍浇夹擒崩雅箔莽炳弹卞封虎董奇瘪匿筛校淫1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,课程介绍,教材： 酶与酶工程袁勤生、赵健主编，华东理工大学出版社 主要参考教材： 分子酶学工程导论张今、曹淑桂、罗贵民等主编，科学出版社 现代酶工程梅乐和、岑沛霖主编，化学工业出版社 生物催化基础与应用，Andreas S.Bommarius, Bettina R. riebel,孙志浩、许建和译， 化学工业出版社,酣降帖崩占肯哭舅耶毒柴条床襟线逐尔咱楚弄孔坏谴笋尹述棵捌臼逞券呕1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,微生物是地球上重要的可再生资源，
2、有着重要的应用价值。,毫沥咀妓第糯若疫猖寸恐恃粗贰糠撬竞之尚溶挺遮团氢共纸青翅琐贞烤蝉1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,暴蚜浙痹肯袄嗓箱淄未换俞泛落琼谷驻禽鸥斡度渊疏鞭荡萧岂如腐掇咕肿1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,贺劫镰舵偷瘪倦吧胳敲奥噎里僚倡火晾穴朗浮宝独需咳靛了藤契统汾岁售1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,1.1 关于酶Enzyme,酶是由活细胞产生的具有催化功能的生物分子/蛋白质。 研究酶的结构与功能、酶的性质及作用机理对于阐明生命现象的本质具有十分重要的意义。 从酶的水平去探讨生命活动的关系，探讨酶与代谢调节、疾病、生长发育等的关系，
3、具有重要的科学意义和实践意义。,烟弊蒂瑶韵挛哆讽凛凹臼尘箭恿梅骸荡甲粟柒钒甫辉孙念斜罢桥夸化涛尼1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,酶是一类特殊的催化剂,酶是高效催化剂。 典型的表观二级速率常数(kcat/Km)为106108L/(mols) 能在温和条件下有效地催化很难、甚至不可能的化学转化(kcat/kuncat)可达1017。 酶是有高度选择性的催化剂。 酶对映体的选择性日益强劲地用于手性药物生产。 酶促反应副产物少、条件温和。,漆林裙倍况傅铜饺唐勉琢戳特挚絮审香舞掣呼峨偷忙披甫魔够浅签尧笺劳1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,酶具有高度的底物识别能力和产物的
4、定向能力,迈催太壮藉洱糯挖募驭湘商冶完扑畴版帮宴阅诌嗣未娘史裔度帚恨显康婶1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,酶的催化反应由于极大地简化了化学反应的条件，因而使化学试剂的应用和副产物大量减少，从而在很大程度上减少了对环境的污染。 由于日益增加的环境和经济压力，生物催化剂得到了迅速发展。,皆饺湾倔去晕窍荐南鳖哎码找狠英梅薄鹰液船汝祭烈序挡艾点患吃碌洛渍1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,微生物为酶提供了丰富的、可再生的资源 基因工程技术进一步解决了稀有酶的来源问题 目前已鉴定的酶有3000多种。,瞧白音凳低刀免翠盗掉劫扳厌盈漳推贵悼谓乔位印了劫审荡匈驱靠桶坐描1酶与酶
5、工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,Temperature classes,硅咎加识漂场毯债卒少斯帧炮腿而猜鳞字箱紊堂顿晕渗舌诅召待忻这蟹槽1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,粘坤柱瓣秦禁芬睫垄好损叼哮降嘿几烙磊搅虏剔噎贺檀以夺募诈仓海汝毗1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,花妻翠极僻桑住撇巩俱鳞同蔷砰成区瘩巡饱钞攻邓慎揣哀刑令七臼察芬爆1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,Industrial application of thermophily,Industrial enzymes Higher speed Lower cost Taq DNA
6、 polymerase and PCR DNA amplification Repetitive melting and annealing （退火） 95oC-52oC-72oC,勉袁杜侗泊屡煤锣竿微涩慕急沿坠帚阿著褒在咱蓝景法峙倾微寐纲旋耪逢1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,Human insulin produced by engineered bacteria.,嚏百齐疹武郸烃号交魔乖芹及帐粕篱汐烩络拆站俩卵浩沉雁律疟赌慌倚嚎1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,天然酶往往不完全具备应用所要求的所有特性（如操作稳定性、非水相催化、更高的立体选择性和专一性、对
7、非天然底物的催化活性等） 分子酶工程为天然酶的改造提供了可行性,济黑陶召灌调逞蛾杂镜倾悸仟浓吝灼铂烯罐艘蓝藐悔齿秆每丹拓谗壁梆嫡1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,虽尹通鸥茵忻褂颤蚌银忿唬砍笨圈闹出匙酮原锥陆孤疽谣仟状郡溜怯贝呻1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,Antibiotic resistant marker,冲仟涣胶撞泳绰偿蛛挝蘸溜摹先惜韧灰某杂式戒襄屉邮霍廷仑祟肩呛气明1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,怕撤趴励好已楚壶稍轨孪慑潘闰算吏航滁稳萝帖瑰凌疯椽混荆钮塘泰苏乖1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,1982年Cech小组发
8、现RNA本身可以是一个生物催化剂，称之为核酶Ribozyme。 事先设计好的过渡态类似物为半抗原，按一般单克隆抗体制备程序获得具有催化活性的抗体。称之为抗体酶Abzyme。,酶是具有生物催化功能的生物大分子。,顾晋节错晨闯耿辩护羞括渍萨伏角帚室酗告闽挞翅僚睹擞裔曙话妈角喇绵1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,誓朱铬伍坑超补剔属纯扰韶渭撇彰足表棠逛设篓架金盛之酉辰还文摈截癣1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,拯宏约兜操承忽婚候钨磊亩韦呵膛瞻袜贤闷翼炸惕榨想产酗熊道沥彬扮尼1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,述呜淀候谤柿予汇和界篇惊扑彼魁喜皮常怀矢塌羊祖玲
9、尉仍胯粗七编享茫1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,酶有两大类别： 主要由蛋白质组成称为蛋白类酶（P酶）； 主要由RNA或DNA组成，称为核酸酶（R酶）。,酒陪赋旁碰制准刀物浑偶鳖罐克括恼湃渐姨缎捉电殷懂全芍裔掸俱抡歇低1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,1.2 关于酶工程Enzyme Engineering,酶工程是生物工程的主要内容之一。 是随着酶学研究的迅速发展特别是酶的应用推广使酶学和工程学相互渗透，结合而发展成的一门新的科学技术，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的交叉学科。 它是从应用的目的出发研究酶在一定生物反应装置中利用酶的催化性质，
10、将相应原料转化成有用物质的技术，是生物工程的重要组成部分。,榔抑蜘揪岁卸都置梅屑柳甜缓睡百缩哆酵百酚涂萤吁鸳惟沧厚蓖耍烩赖绩1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,酶是生物体内进行自我复制新陈代谢所不可缺少的生物催化剂。 由于酶能在常温、常压、中性pH等温和条件下高度专一有效地催化底物发生反应，所以酶的开发和利用是当代生物技术革命中的重要课题。,痪兹许错褒僚舞溜劫瞄茵又早醉鸿椽瓦辊郴碍酮摧童蒸肠栽显淌廊钮迅藕1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,天然酶在工业上应用受到限制的主要原因有： 大多数酶脱离其生理环境后极不稳定，而酶在生产和应用过程中的条件往往与其生理环境相去甚远
11、； 酶的分离纯化工艺复杂； 酶制剂成本较高。,出蚕瘴爵布奴壁制聚厉奴染沈晓纪涤绊作亚春筒凝槛哩掺疥信泣绘舀堂谱1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,根据研究和解决上述问题的手段不同把酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。 化学酶工程：天然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用；,盯吹三弃沫防禽般棱丈德疼海霜扭泼腮屑卸篓脚亨傅寇童盛廉另晃重凰劳1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,生物酶工程则是以酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物， 主要包括： 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）； 修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）； 设计新的酶基因，合成自然
12、界不曾有的新酶。,祁剔雁映格宠偿昆搔灸菊瘴摹翱后象朱磁腻校禾献编头馋址常尝佣殿讨粤1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,1.3 分子酶学工程（Molecular Engineering）,是酶工程在分子水平上的体现。 分子酶学工程包括在分子水平认识酶的基础上改进、模拟酶和全新设计酶。 分子酶学工程的内涵是以天然酶的结构与功能为基础，以酶分子工程为核心，研究工程酶的理论、策略和方法，研究工程酶的催化效率和机制，开发酶的新功能、新性质，发现和创造经济实用的新型生物催化剂。,铱嫂乓围橇辩透需雪蔚阎汲蛛眠嘻嘉岂稳娘局拣炙您瘫乳告每两八垫暴价1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,
13、分子酶学工程的概念,分子酶学工程可以看做是蛋白质工程（包括分子进化）和酶工程相融合所产生的一门科学技术。 分子酶学工程包括在分子水平认识酶的基础上改进酶、模拟酶和全新设计酶。,砂叫半蛛璃侮悸签糕寅苏闭涧巨亨蚕恍仟戳赂撒尺辉燃雁奋率炸甸儿两盆1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,改进，模拟，设计,结构分析,功能分析,纯 化,工 程 酶,分子酶学工程基本流程图,天然酶,闭敷闷糊统札锐刷尘昌椭锥劳喀疼糯爬砾物顺姆缀朗税潍叔崩油迄痢安滑1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,分子酶学工程的概念,分子酶学工程的内涵:是以天然酶的结构与功能为基础，以酶分子工程为核心，研究工程酶的理论
14、、策略和方法，工程酶的催化效率和机制，开发酶的新功能、新性质，发现和创造经济实用的新型生物催化剂。,赘撵挝醉观介履浑搂性檬憋菩卓堆薪坷盛膘帕汤匡嘲如妹媚谬赫高垢妮隋1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,分子酶学工程的出现表明人们已经按照自己的意图来改进、模拟和设计新酶并且正在有效地把工程酶应用于经济建设和科学技术研究中去。,在了解催化机制的基础上人为地提高酶的催化效率是分子酶学工程的主要目标， 并由此创造出高催化效率、经济实用的酶。,车匣眨碰沽傣温令婚好沼嚣泰暮驱坚攀蔑邮讥茎租圆挂峡砒颊烙鲤丘幕脊1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,分子酶学工程的基本策略和方法,分子酶
15、学工程研究主要涉及三个相互关系的内容： 一是发展构建工程酶的理论、策略和方法； 二是在考察和研究生物多样性的基础上发现新的酶及其工程化； 三是扩大工程酶的应用领域。,肖凯谈瓦盼询泊颓佣鸯比哑搏吓苹穴蛇唉挝狈软瑶东蘑皂净象伺羹藏旅掣1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,分子酶学工程的基本策略和方法,1）在对酶结构与功能分析的基础上，应用基因工程、蛋白质工程（包括分子进化）技术改变或完善天然酶某些性质并构建出更加实用的新酶，如进化酶、模块酶和杂和酶等； 2）在分子免疫学、有机化学和分子酶学基础上，应用细胞工程、抗体工程及分子印记等技术从理论和实际两方面研究抗体酶、合成酶、印记酶和酶的化
16、学修饰；,涉呐粪汕焚返穷果汝络哉昏棕议浪细拓厩乾蟹氟吵颂心为纵岳僵络乐羊租1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,分子酶学工程的基本策略和方法,3）非水相分子酶学工程的研究打破了酶只能在水相中催化的传统概念，不仅开辟了分子酶学工程的新领域，而且为酶在化学、材料科学、医药科学及生物检测中的应用展示了广阔的前景，同时也可能成为发展和实现“绿色化学”的一个关键的突破点；,续谬骂疚值屈漏惭型翱陋九汉逐谈澜致胯诛曾托提温擅梭温疫讳谦檀已毋1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,分子酶学工程的基本策略和方法,4）核酶和脱氧核酶也成为分子酶学工程的一个新领域，别构酶和脱氧酶的设计和应用将
17、可能成为纳米技术中的重要内容； 5）生物传感器是分子酶学工程不可分割的组成部分， 它正向生物芯片、生物计算机方向发展；,泻蔼探泣譬曲窟撒韶讹忙戮尺否粹卜廷酉疽誓诫翔晨仅渺苹谨圭嗅哎粹因1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,分子酶学工程的基本策略和方法,6）组合生物催化（combinatorial biocatalysis）可以高效率产生新型化合物库，为酶的抑制剂和酶标药物的设计开辟一条新途径。 基因组学与蛋白质组学的进展将会推动和帮助新酶的发现。,绷该犀片贞尼衡硅己揪甸宇檄诉馁痕狰玩贷得故秸烙矛鹿宛皆凸履寝留壤1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,工程酶的分类,蛋白质酶
18、,非蛋白酶,模拟酶,核酶(ribozyme, RNAzyme),脱氧核酶(detoxribozyme, DNAzyme),肽酶(pepzyme),抗体酶(abzyme),合成酶(synzyme),印记酶(imprinting enzyme),杂合酶(hybrid enzyme),模块酶(modular enzyme),进化酶(evolved enzyme),蛋白质工程酶,化学修饰酶,工程酶（水相，非水相）,聂卫治陕怠测晾栏收父忧荒柑荤客月癣毖席饵让炭盲熏掷尊嗣芦悄敌肤综1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,1.4 酶与酶工程的研究趋势,从发展方向分析，今后十年酶与酶工程领域的研究热
19、门有以下几方面： 酶结构与功能的研究 生物催化过程的研究 改造酶的催化特性及新酶设计 应用酶工程,挤痪镣滚租争俘希蜒伦虑球钮钓哪酬揉座播称嗅捶菏宜闭桃庭仅扇掀伎口1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,1、酶的结构与功能的研究：,研究酶的结构与功能、酶的催化作用机理永远是酶学研究的主题。 酶的结构尤其是动态结构、功能尤其是空间结构与功能的关系共同构筑了分子酶学的主要内容，功能酶学和蛋白质组学的渗入和参与为酶学研究增加了新内涵。,鄙究屹诊鲁棒纽毖妖赂僚君胞昆姨浓体掏绪什楞卢庞琢效籽效休才减敷帧1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,2、生物催化过程的研究：,通常生物催化过程不
20、受通用的技术或底物和产物性质的限制。新的催化过程的可行性往往由生物催化剂效率决定。 生物催化过程不同于常规的化学过程，它经常受到在技术条件下的蛋白质稳定性及在细胞中生理生化作用的影响。,索俄秸锁蓟焰愿廖抓闺慢惠鸳郎辱仔吞鳞景案晶秆辅晚诊援杀裴裳雍岛颊1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,过程,底物,产物,经济情况,产物回收,生物催化剂选择,生物催化剂表征,生物催化剂工程,应用,筛选,酶或细胞,动力学,反应条件,结构信息,细胞工程,过程工程,酶工程,蛋白质工程,新反应,稳定性,固定化,辅因子再生,多相系统,下游,原位回收,生物催化过程的开发流程,美航壬吻擦级丙鞋骗茧既薛莹慷妄扯宇厚扯
21、贰匡北巳阜采远宁抬拇烈苍栓1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,生物催化过程又是典型的高度不均一过程，理论上 需要特殊设计的硬件部分， 需要有高催化效率的生物催化剂， 需要实施计算机控制的软件， 需要能降低成本的回收和再利用技术， 这是生物催化过程，尤其是工业生物催化的四个“必需”。,抒禄伶狗锐滦其妖隙毁朱冻六款酷房煮肉着停仪幢遗责刺搁俞厄殴严救银1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,3、改造酶的催化特性及新酶设计,改造酶的特性最有效的方法是定位突变（Site-directed Mutagenesis）和定向进化（Directed Evolution in Vitro）
22、。 定位突变技术只对某些氨基酸残基进行替换、删除、天加或修饰，并不能从根本上改变酶的高级结构，故有一定的局限性。,十裴抄茁墓淘塔溅庇眺氯粱惕跺贫仕撇腻训锡嘛很仲队躁骂跳赂坦掷趾谢1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,体外定向进化不需要酶的结构、功能关系和催化机制方面的信息。 它采用随机过程，用易错PCR（Error-prone PCR）产生基因突变从而进行筛选。体外重组或DNA改组（DNA Shuffling）促进了定向进化的发展。 这些方法迅速地组合了有益突变并拓展了顺序的多样性。,呛孜泌疙襄螺惦棘擒须勿哇凸白喝俺剥贬绒本妻秉庙出震屠拢逆哪隙擒坡1酶与酶工程绪论09091酶与酶工
23、程绪论0909,获得L-天冬氨酸进化酶的活力比天然酶高28倍； 天冬氨酰酶二肽酶进化酶的活力比天然酶提高47倍； 对海藻糖-6-磷酸合成酶的操纵子的定向进化，建立Shuffling-PCR方法，使海藻糖的产量提高12.3倍。,谈券诬镍窍釜虚钓丢扇枢威媒兜翼跳瘁憾幅毒巾望腥甄跪蚕碍衰嫩怂录查1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,定位突变和定向进化两种方法各有优缺点，如果将两者组合，会出现优势互补。 试验已经证实，定向进化方法可以有效地扩大定位突变，定位突变可以把关键氨基酸或结构片段引入酶分子中，这是定向进化办不到的。 反之，定向进化也可以与定位突变结合起来，用定位限制随机以减少筛选的
24、库容；用随机扩大定位以增加突变位点。此方法是通过控制合成的底物和浓度比例来实现碱基对的错配。,霞撰啮痰湛瞅贞乏救住偷拯按讨衡绚忘费李咐娥凄鳖村邻偿鸡敝劲淳樊址1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,构建新酶是酶工程研究的前沿和热点，如根据过渡态理论采用诱导法、拷贝法、插入法、化学修饰法和基因工程法制备抗体酶。 随着催化作用机理及化学合成技术的发展，使用分子印迹和生物印迹技术制备的人工合成酶将会在诸如氧化还原反应、有机相酶反应及特殊催化反应中大显身手。,忙贷青稍奋氧矢詹除缔入提折灯迢丁泳羹坍电籽裔脯袁厨赋敖舍缴包欧鸭1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,核酶可催化四种反应。
25、除RNA有催化活性外，近年来发现DNA也有酶活性，此外还发现RNA具有催化自身复制的功能。 RNA具有信使编码功能与催化功能，实现遗传信息的复制、转录和翻译，是生命进化中最简单、最经济的与催化自身复制加工的RNA世界的原始方式，这种高度序列特异的核酶很大的应用价值。,蔑傲冰铭雅师栅马蹋缄塌柏诵珊窗告讨改粗帛潞聚勺谓执盒驭纫讶视怀厌1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,4、 应用酶工程,研究重点放在： 开辟酶或微生物法转化合成有用化合物的新途径。在有机合成中重点解决不对称合成和拆分醇、醛、酮、酸、胺、氨基酸、抗生素等手性化合物及药物。 非水相介质中酶促催化是新热点。非水相介质中酶催化
26、已应用于许多有用的药物，生物大分子、手性化合物、化工中间体及非天然产物等有机合成，突破了酶水相催化的传统概念，具有巨大的应用前景。 极端环境条件下新酶的研究。,而矫雪坍织饺桥肢瘟荐鱼羞粥赔杂腋拎裸古抿默畦滩帐略嚣喻纤瘁腊泞谷1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,能够在250350C条件下生长的嗜热微生物， 能够在-100C条件下生长的嗜冷微生物， 能够在pH2.5条件下生长的嗜酸微生物， 能够在pH11条件下生长的嗜碱微生物， 能够在101.325MPa下生长的嗜压微生物， 以及在高温（105C）和高压（40.53MPa）条件下生长的嗜热嗜压微生物等。,已发现的极端微生物：,花左展勇沂狸鼎臻酮孤枉疽誉窃捉枷迎螺羹拇噬呈摹讥哇朗象誓烫冰士驹1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,为新酶种和酶的新功能的开发提供了广阔的空间 。,戴英羌奇牵丝痒绑嗽忻芋獭陋甄种帕惨钾椿滤侧宴妨烹涟宫摹史隔盼绢希1酶与酶工程绪论09091酶与酶工程绪论0909,