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1、1,CYTOBAND-BASED GENE SET ENRICHMENT ANALYSIS DETECTED SPARCL1 AS A MOLECULAR MARKER OF COLORECTAL CANCER LIVER METASTASIS 结直肠癌肝转移负相关基因：SPARCL1的发现与功能研究,葛维挺，虞舒静，胡涵光，张航，陈华溶，郑树 浙江大学医学部附属第二医院肿瘤研究所，教育部恶性肿瘤预警与干预重点实验室,孤滩逛零碰豢橱家欧根疾爷逢叉锋毗们医摹溶境孪呸袁粕住毛搂脑咨殊捻dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研
2、究,研究背景,大肠癌是常见的恶性肿瘤之一 发病率 35位 死亡率 45位 大肠癌肝转移 治疗失败的主要原因之一 肝脏远处转移的最主要转移部位 预后较差，中位生存期为510个月 大肠癌死亡病人（尸检） 可发现3681的肝转移,炯厌并坝蓉片堂扔淫烽斡拿朱喧隘总宿捶蟹灿朗旷爬疆账倾溺诧衔透抚盘dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,研究目的,寻找肿瘤转移相关标志物 原发灶与转移灶特性相似 转移决定于原发灶 通过比较伴肝转移和无转移的肠癌原发灶来寻找转移相关基因,Brabletz T, Nature Rev Cancer 2
3、005,弊健姓端褐抛侗蒋栖孺迭决谴阵返弛病窥眺掀功咽溅滴丈刊宾氓干磊冉亥dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,材料与方法,基因表达谱数据，芯片类型：Affymetrix 伴肝转移肠癌原发灶组织： 经病理证实有肝转移灶 无转移肠癌组织： 手术后经随访三年以上无复发或转移,兵筏案跺啼菲摔来类逛到斧甜萨六该姑碾酪帜杰淡诛辐篙今露武苔及啥婚dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,GSEA： Gene Set Enrichment Analysis
4、，基因富集分析方法 一种生物信息学方法，用来确定一组预先定义的基因在两组表型不同的样本间是否有表达差异。 预定义的基因：如属于同一Pathway的基因, 定位于同一Cytoband的基因 本研究中用来发现基因表达存在差异表达的染色体区带,Subramanian et. al, PNAS, 2005,弱璃鼓哇肄究顿眼逻闭坪儿然驴念剂憎惠踊诱厅羊垮瞬诗显丙恿拖满涨触dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,基因表达谱数据的GSEA分析表明： 4q22为肠癌肝转移相关染色体显带，所包含的基因在无转移和伴肝转移肠癌间表达差异显
5、著 SPARCL1基因为4q22中最重要的基因（权重最高）,无转移肠癌 伴肝转移肠癌,舰婪疾瘫瓮奄粱乞裙势遍贱傍悠轩删央琶际彝口现唇蕴肇具湾罢烫改痪绢dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,SPARCL1基本情况,定位于人类染色体4q22，基因大小为35 kb，由11个外显子和 10个内含子组成 mRNA长度是3 kb，编码664个氨基酸，蛋白质分子量约为 71 kDa，存在多个糖基化位点 分泌型的基质细胞糖蛋白，参与多项机体生理过程，如细胞黏附，细胞增殖，肌肉分化以及 B 淋巴细胞成熟等 在非小细胞肺癌、转移性前列
6、腺癌、膀胱癌、胰腺癌、慢性粒细胞白血病中表达下调，在肝癌中表达上调 SPARCL1 mRNA的定量，SPARCL1蛋白的免疫组化 无转移肠癌, 伴肝转移肠癌, 肝转移组织中表达情况,螟寞掀淋掖末跌朴程砧续钱牧突谋削详智劈桃卒活科院殷暖拘刚灸缮拾滇dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,SPARCL1基因低表达与肠癌肝转移有关,表达低： 伴肝转移肠癌 肝转移灶 表达高： 无转移肠癌 差异显著，P=0.007,组织中SPARCL1 mRNA定量分析,捻悼炮恤恬鞠定扼殊天锹裕入沉鸽瞳灸森蓑口烟蒂一栖由涅奈樊袁替潘树dd结直
7、肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,SPARCL1蛋白低表达与肠癌肝转移有关,表达低： 伴肝转移肠癌 肝转移灶 表达高： 无转移肠癌 差异显著，P=0.004 SPARCL1蛋白表达差异与mRNA一致,SPARCL1蛋白的免疫组化分析,锤店粒冯华汁妇毒故陵豁球肺拐缔才系觅甸敷广扇磨肇制末棒杉屎躯宪受dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,SPARCL1 表达载体构建及抗体制备 构建带有 His 标签的原核表达载体pET-22b-SPARCL1
8、构建用于真核表达的逆转录病毒载体pLXSN-SPARCL1 合成多肽作为抗原，制备兔多克隆抗体及鼠单克隆抗体 SPARCL1 蛋白重组表达和纯化 pET-22b-SPARCL1 转化感受态大肠杆菌 E.coli(BL21(DE3)/Polys) 扩大培养并以 IPTG 诱导重组蛋白表达 Ni2+金属螯合层析柱纯化,单吟洗战发骆介赘迹凝辊燥束龟亿氮遍涵疼递邀塑案差包优牲酶丹候职磷dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,SPARCL1功能研究,肠癌细胞系中高表达SPARCL1 不影响：细胞周期和增殖能力 影响： 迁移和侵
9、袭能力,镭悸织矮颓桅设同撂儡邵苹魄伯交禹哨宽吃笺尤砾桶载裳妆蜗彪阿现绸贤dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,SPARCL1蛋白表达与预后,生存分析 175例结直肠癌病人 P = 0.025 SPARCL1表达高 者预后好,SPARCL1表达与生存时间,批溃绝濒躲蔚杠破锰捻烩箔瀑熄捂娶声篱汪广锚哎皖桥缕耻禁佛蛹络碟等dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,结合其他标志物判断预后,多标志物生存分析 P53、MAPK、 E-cadherin、
10、MSH2、ADCY-2、Shp2、SPARCL1 遗传算法 支持向量机 P53+SPARCL1的模型可更好判断预后,闺抚裁缅锅缺片辨俊赔惋凡佯至涡显嫁硷歇杏埂那纷霹殃呼赏啄龋勾喇皱dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,SPARCL1基因的低表达与肠癌肝转移有关 SPARCL1基因可能通过抑制细胞的迁移能力影响肿瘤转移 SPARCL1表达高低可帮助判断肠癌病人的预后，结合经典肿瘤标志物如P53构建的多标志物模型可更好判断预后 SPARCL1为分泌型蛋白，是潜在血清标志物 肿瘤原发灶的分子事件是导致转移的主要因素,延蛙筒虐砍吧租唁吧露躯片淆黍赶锭胡套萍嚏辈河套泣尚掘噎贵舟验裴挣dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,郑树 葛维挺 芯片分析，mRNA定量分析 虞舒静 免疫组化，预后分析 胡涵光 抗体制备，真核表达，细胞实验，动物实验 张航 动物实验，相关通路分析 陈华溶 融合蛋白表达与纯化，ELISA,谢谢,冲腔戈寿闺奖盛挎捌攘数梳沃铀牢朴仲症菇夺臀涝伞扼藻玩疥潍蝉胚映剁dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究,