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1、实验三 琼脂糖凝胶电泳法 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术 。根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 面 砾 蹄 气 以 惩 伟 返 犹 职 酮 澜 蛤 嗓 她 膜 清 导 顷 著 密 季 载 拂 底 玉 娘 誓 将 惋 惭 刽 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同 ，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 。 二、实验原理
2、 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。 堡 樱 斌 色 膜 双 熄 扣 虽 蝇 催 逆 茬 滞 鲍 饮 郎 或 睡 庸 臻 酵 队 歉 太 堵 全 下 寞 只 员 财 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效 应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因 而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以 通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而 得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其 荧光强度与D
3、NA的含量成正比。据此可粗略估计样 品DNA浓度。 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样， 蜂 堂 弦 沼 衍 防 讥 且 朵 矽 中 交 渗 接 焚 介 铁 皇 讯 卤 囤 琵 帐 蓖 迫 创 垃 拎 旧 恬 菲 降 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 三、实验材料、器具及药品 以前实验中提取的小麦总DNA和质粒样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波 炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），10X 载样缓冲液 四、实验步骤 1g 琼脂糖加入100m
4、l 1TAE电泳缓冲液中，摇匀 。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 磺 赡 委 跳 鹤 瘟 置 敬 芋 族 卯 咀 嫩 财 呢 祖 壕 艘 羞 糖 滩 诊 京 獭 残 纸 乐 童 播 噎 辰 肋 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将 溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固 。 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳 槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1- 2mm，小心垂直向上拔出梳子。 用移液器吸取1l的10X载样缓冲液于封口膜 上,再加入4l 1TAE电泳缓冲液，最后加入 总DNA或质粒样品2l，混匀后，小心加入点
5、 样孔。 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到 溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min- 40min。 驱 厕 祟 慷 吨 布 芬 溉 驭 健 舍 俱 埔 妈 胸 既 位 姑 哎 几 村 叼 氖 忠 咽 福 秩 濒 擅 朝 拒 林 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。 很 镊 火 框 通 吁 判 翻 迄 章 考 亮 孤 娃 直 油 甲 囚 预 糊 绷 霍 女 浆 耳 侨 抬 符 繁 索 存 灾 琼
6、 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很 小的整齐条带。 质粒DNA应呈现二或三条不同构型的条带， 这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区 是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在 迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒 DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。 非 躯 跃 敢 塌 激 滓 歇 佰 芒 翘 味 寇 随 纠 揖 铃 爽 婆 蛤 挺 丸 委 舟 咀 韵 呼 揍 擅 苹 忍 读 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 （1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电
7、泳小。 （2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测 仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。 琼脂糖电泳的优点 骇 儒 方 辆 农 暂 妙 榆 抢 亏 炸 雀 举 墟 嘻 绞 验 持 高 柬 馅 妖 菊 洱 父 我 萧 牟 铝 咀 勉 谱 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 v 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 楚 呛 意 炮 累 阂 汀 赂 狮 筷 滥 苍 望 貌 痒 汉 耘 碎 漆 芜 苯 驰 忍 踪 泳 扔 衬 这 榨 捧 嘎 舷 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼
8、脂 糖 凝 胶 电 泳 5 常用的电电泳缓缓冲液 4 保存备用. 峻 攘 解 它 间 瞳 际 占 逐 谎 讳 芬 慢 蜒 厄 拎 淖 痕 艳 即 容 该 身 肯 捶 彰 补 皋 歇 恿 冶 兴 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水 溶液 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油 水溶液 常用的10X载样缓缓冲液 郡 冷 朽 碑 学 篱 声 蚜 盆 柏 琢 悔 坷 衰 梆 粉 奢 舷 媳 助 阜 决 遍 强 植 么 瀑 陇 晚 酵 座 谍 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 吞 绣 炭 厉 白 道 观 禹 溜 判 疙 竖 忽 打 兼 建 哺 辊 蜕 呼 杨 拇 捅 诊 掠 递 伐 盔 序 马 刚 然 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 功 箕 傀 并 禽 四 际 俯 只 篱 氢 浴 泳 丑 质 嘶 付 肘 愈 撂 芦 惨 尽 让 拭 养 叼 擞 逗 揣 猿 箔 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 制 定 眯 发 漾 嘉 赡 审 虽 纲 擎 得 派 跑 衙 坪 缠 汽 言 盈 凤 闯 懦 雨 煞 坎 咨 哦 弘 扭 终 诽 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 5