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1、细胞融合实验 铁 鹊 屡 鸿 鼠 罗 具 力 驰 激 苯 莽 憾 萨 棘 咐 钮 吱 肤 锐 禾 蔫 办 胃 吧 苦 署 那 糜 侄 卫 猎 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 概念概念 促融合剂与融合技术促融合剂与融合技术 应用与意义应用与意义 重点重点 尸 淳 嗣 也 八 巫 箱 菜 履 怎 桃 梳 耪 容 张 厨 饼 臭 耸 七 拼 实 躇 辱 孟 闻 涝 挟 潦 檄 蔚 黑 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 一定义：Cellfusion l细胞融合：(Cellfus
2、ion)又称 l体细胞杂交 （somatichybridization） 是指将不同来源的原生质体 (除去细胞壁的细胞)相融合， 将两个或多个细胞合并成 一个细胞的技术。 撅 旗 砂 希 懈 窖 姨 蓉 震 妒 摄 奈 儿 练 嗜 岳 枝 曳 宽 稻 体 票 妇 积 巡 扶 岔 宗 姬 舍 逃 酒 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 健 齐 敲 脯 甜 迢 盗 火 商 劳 哈 寒 泊 越 妒 遣 景 殉 蜗 刻 拽 返 敞 狞 响 惫 吊 读 腿 膛 刘 只 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验
3、- 细 胞 融 合 人心肌细胞人肝脏细胞 种内杂交细胞 人细胞鼠细胞 种间杂交细胞 河 劈 抹 朝 铲 茂 笑 炳 塌 拿 揽 餐 姿 吕 牺 皑 傣 终 旁 落 挑 凡 竣 培 惧 讼 孔 峪 莽 证 辱 卡 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有 原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂 交细胞（hybridcell）。 种内杂交细胞（intraspecific hybrid cell）:同种细胞融合而成的细胞 种间杂交细胞（interspecific hybrid cell）: 不同种的细胞
4、融合而成的细胞 匀 滨 诚 炉 秒 恃 凋 昌 贞 芝 家 艘 保 蔡 迫 殆 墨 糊 周 求 涸 百 月 馅 褒 愁 侠 掀 脱 咬 馈 迁 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 非对称细胞融合（asymmetric fusion）：利用 物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活 后再进行融合。 虽 埃 醛 熬 俯 翔 抹 揉 固 仑 交 当 津 顾 窝 鹿 著 猿 介 蚌 珠 茹 牛 疫 猿 邀 琵 推 丘 隋 颜 柒 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞核或细胞质失
5、活的有物理和化学方法： 1.物理方法，如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活； 2.化学方法，核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸 (Iodoacetate)；质失活罗丹明（R6G，它是一种亲 脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作 用。 梢 县 肚 教 猎 日 噬 删 自 浦 讼 听 芬 刃 郴 睬 各 尝 够 奈 颐 宁 静 彤 改 秃 剥 艾 徐 儡 巷 刊 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 动物克隆 玫 芥 沮 充 钵 叹 揍 叁 贤 汇 旗 赖 扎 溉 殷 耍 琢 漠 瑶 腺 饥 辐 烩 旦 啡 芽 裴 揉 协 哑
6、 擂 殉 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 上海第二医科大学 陈莹博士 2003年，她将一5岁男孩的包皮细胞与一只已去除细胞核 的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。 苦 桔 竿 蛾 酸 烙 忍 源 蝎 顾 泵 眉 物 姐 镀 份 二 欺 疽 愉 害 神 沪 猜 杠 羌 琅 丁 筏 颐 邓 苫 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 二细胞融合的原理二细胞融合的原理 苗 沮 越 鸭 挂 符 哇 扳 吸 靡 婿 龟 颜 量 恃 旗 谅 恳 颂 瘤 霞 蝉 反 赫 卑 潜 知
7、 伦 淖 狭 乙 茹 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 n n 荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验 将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素(fluorescin)结合, 人的抗体与发红色荧光的罗丹明(rhodamine)结合； 峙 拍 何 敖 抛 脱 牙 芹 惑 恍 耘 芽 屿 矮 霜 惫 事 枕 属 加 都 膳 钧 筒 庄 猖 宫 现 糯 乃 敏 缮 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 显微镜下的细胞融合过程显微镜下的细胞融合过程 磐 严 筷
8、张 畦 桔 吞 主 岔 笛 饱 痹 泼 和 狂 埠 实 阳 捶 洗 膏 劳 习 雪 棺 苦 潍 牢 良 眨 耐 颁 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞融合的过程 细胞互相靠近 细胞膜融合 细胞桥形成 细胞质融合 细胞核融合 抬 忠 颧 酗 蚌 宦 烧 纹 疟 轨 履 恼 新 令 奸 绥 抒 武 附 掳 险 署 啸 音 挠 美 钩 箍 牌 谈 赛 鸥 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 n n 细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互 相靠
9、近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核 融合主要步骤。融合主要步骤。 细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步，融，融 合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形 成细胞桥。成细胞桥。 冈 索 膝 贩 苔 镑 袜 烷 恼 奸 幻 耐 滤 鹅 堑 澎 扒 珊 绝 赐 礁 刹 房 求 戍 挺 疏 竹 贝 吕 优 晌 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞融合过程中两个细胞膜的变化细胞融合过程中两个细胞膜的变化 形成细胞桥的具体变化形成细胞桥的具体变化
10、 牡 涌 碧 雷 嘛 沥 涂 划 医 缔 梦 岛 灵 汞 描 曲 犬 墅 梁 汛 虐 蕊 进 村 跃 米 糊 埃 驰 雍 垢 斥 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞融合分为两种： 1.自发细胞融合 2.人工诱导细胞融合 雇 镭 世 套 瞒 淳 咏 招 氏 拱 虎 塑 递 屿 空 谆 馋 瑞 囊 匙 撒 蠢 意 店 嗣 儒 傍 赖 想 垄 迈 拂 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 （1）自发细胞融合 自发细胞融合（spontaneous cell fusion）是在未施
11、加任何诱导条件的情况下所 发生的细胞融合现象。 自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要 有以下几种情况： 1.精子和卵子受精 2.肌管的形成 3.胚胎着床 4.巨细胞的形成 5.破骨细胞的形成 6.肿瘤细胞融合 疹 果 拴 碍 擂 泼 悦 问 锚 储 崭 画 门 蹭 拨 碘 统 郡 虏 池 疚 悸 茎 记 埃 穆 习 邹 弄 陆 凹 裁 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 （2）诱导细胞融合 人工诱导细胞融合是在人为条件下发生的 细胞融合现象 常用的诱导方法有三种： 1.生物法（病毒诱导法等） 2.化学法（PEG诱导法、Ca2
12、+诱导法、 溶血卵磷脂诱导法等） 3.物理法（电诱导法等） 篷 射 租 准 耙 仕 征 嗡 侈 摔 砰 哉 糕 寐 剃 屁 砾 蜒 镭 粱 贝 礁 囊 污 剑 姑 龋 戌 炸 幕 观 嵌 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 1.病毒诱导法 常用的病毒：仙台病毒（Sendal virus), 又称日本血凝病毒 n（Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） n 属于副粘液病毒科，RNA病毒 ，圆球形 n 1962年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台 病毒可诱导细胞融合。 肿 炳 撤 毕 盖 拙 吝 扁 镇
13、搬 拼 屡 胆 强 朝 比 泉 圾 描 弄 租 党 毕 己 表 侥 撒 随 摧 尧 抒 困 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 病毒促使细胞融合病毒促使细胞融合 两个原生质体或细两个原生质体或细 胞在病毒黏结作用下胞在病毒黏结作用下 彼此靠近，使两个细彼此靠近，使两个细 胞膜、胞质间互相渗胞膜、胞质间互相渗 透透 - - 细胞核互相细胞核互相 融合融合 ，进入正常的细，进入正常的细 胞分裂途径，杂种子胞分裂途径，杂种子 细胞细胞。 咀 汤 精 覆 仅 填 不 拒 谓 缓 羞 秀 琳 佯 友 梁 涧 阉 淆 憎 券 扁 否 暑 环 孤
14、拉 光 巍 皂 宦 伙 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 2 2化学法（聚乙二醇）化学法（聚乙二醇） nPEG: 聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG ） n分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH n性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、 沉淀蛋白质的作用 n 分子量 1000-6000u，可作诱融剂。 20世纪70年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合 蒙 摸 瘤 谊 滥 蔬 瑟 闹 印 妻 骇 页 循 碎 畅 筛 页 歌 距 棵 刻 芝 仑 策 美 蘸 陷 魄 羌 毒 龚 叹 细 胞 生
15、物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 n n 分子量小的分子量小的PEGPEG，融合效应差，又有毒性，融合效应差，又有毒性， 分子量过大，则粘性太大，不易操作。分子量过大，则粘性太大，不易操作。pHpH 偏碱时融合效应最高。偏碱时融合效应最高。 n n 用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子 量为量为40004000者，常用浓度为者，常用浓度为5050， pH8.0pH8.2pH8.0pH8.2 腿 猩 隅 复 沙 红 错 头 并 绘 睹 碌 身 阀 摩 到 屋 激 宪 乡 典 韶 捐 婚 气 捍 消 赌 肿 效
16、飘 讨 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 聚乙二醇 普遍认为聚乙二醇分 子能改变各类细胞的 膜结构，使两细胞接 触点处质膜的脂类分 子发生疏散和重组， 由于两细胞接口处双 分子层质膜的相互亲 和以及彼此的表面张 力作用，从而使细胞 发生融合 颤 参 你 律 褂 仁 舔 因 徘 闹 续 年 螟 渤 雁 俘 皑 呐 天 厚 妙 止 俱 湿 网 暖 森 苇 潞 子 筛 且 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 基本原理基本原理 n n 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)是一种多聚
17、化合物，商是一种多聚化合物，商 品名卡波蜡品名卡波蜡(Carbowax)(Carbowax)。 杰 淋 教 朵 缔 滁 址 灵 狐 悯 钉 襟 寂 陨 锈 傅 故 凿 唬 喂 晤 褒 标 范 训 贿 镶 揪 辉 见 沛 运 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 原理：PEG带有大量的负 电荷,和原生质体表面的 负电荷在钙离子的连接下 ，形成静电键，促使异源 的原生质体间的粘着和结 合，在高pH,高钙离子的 溶液的作用下，将钙离子 和与质膜结合的PEG分子 洗脱，导致电荷平衡失调 并重新分配，使两种原生
18、质体上的正负电荷连接起 来，进而形成具有共同质 膜的融合体。 馏 鸵 戒 酶 傅 盗 甭 延 糕 琴 吭 烈 操 厘 屉 踏 栽 瓢 鞭 原 胎 轮 脾 基 剃 勿 稻 掺 恋 铃 昏 湃 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 融合过程中应注意 事先要做好两种原生质体的识别标记，如色素 、缺陷型、抗性标记等。 原生质体的密度应在105个mL左右，两种原生 质体按1：1等量混合。 常用PEG的分子量通常为40006000，加热熔化 与Eagle溶液配成50(WV)浓度(小分子质量的 PEG配成55浓度)。加入PEG后，24培育 1020m
19、in 注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包 裹一层膜形成凝集体，会降低融合率)，缓缓加入 高pH、高钙离子溶液15min后用冲洗液清洗，离心 收集原生质体。 茅 廖 朽 脑 咸 恿 丑 枝 嘉 傍 斌 淤 眠 皖 副 漾 膜 参 请 丹 怀 册 零 显 号 理 哇 沮 割 赚 蔗 节 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 3.物理法一电融合诱导法物理法一电融合诱导法 1981年，Scheurich和Zimmermann发明了电诱导细胞融合。 电融合槽 在直流电脉冲的诱导下，原生质 体质膜表面的电荷和氧化还 原电位发生改变，使异种原
20、 生质体黏合并发生质膜瞬间 破裂，进而质膜开始连接， 直到闭和成完整的膜形成融 合体。 洒 薛 形 掠 烬 署 殉 蛾 硬 祈 希 隔 侍 鸿 稀 池 疑 残 义 烷 则 络 忠 稀 实 虹 匆 奄 帖 苛 镐 屠 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞电融合 原理： 悬于大小不同的两平行电 极间的低导电率溶液中的 细胞，在1100MHz和100 1000V/cm的交流电场中 ，会向小电极移动，并极 化成偶极子，而沿电场方 向发生双向电泳，此时再 加上适当强度和持续时间 的高压电脉冲，即可使相 邻细胞膜的接触区产生可 逆电降解，从而
21、触发细胞 融合。 应 啄 颠 援 岭 遇 扑 援 撕 粗 土 每 翘 萧 狡 拼 喘 姻 排 隐 猾 伎 渗 惫 狈 戍 劝 窃 沁 相 窑 膝 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 +-+- +- + -+ 偶极子 电诱导法原理 + - -+ 羔 先 恰 冉 阔 卉 悲 肃 烙 血 蛙 曲 啪 津 遣 垂 几 代 帝 胜 陕 畔 愈 娜 汁 嚎 封 钾 筹 踊 绥 痰 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 双向电泳：在交流 电场的作用下（ 1MHz，150V/cm） 细胞膜上正
22、负电荷 分离，产生偶极， 两个极化的细胞会 发生相互的紧密接 触。 注 茧 叉 烹 屿 屡 唱 操 婿 犹 侦 糙 中 壹 团 倔 删 尿 茹 径 翘 僚 滚 谬 魏 麻 夜 怀 帚 言 臃 毕 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 霖 侮 浅 肢 胚 姨 踞 骏 膀 耐 宰 蹦 熬 憎 翌 铰 历 蛰 躲 孔 悸 共 款 压 茧 泞 套 乞 颇 位 沪 广 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 夹 逼 顽 咏 铭 吨 金 撞 罗 千 豢 娠 咖 抽 摘 环 从 音 鲜 闹 远
23、盆 馈 匿 恐 熊 掳 俐 掖 班 尸 灸 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 原生质体电融合过程 1）在高频电流电 场下的相互接触。 2）脉冲刺激后30s 3)50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原 生质体融合完成。 树 马 砖 溃 耽 锭 象 聊 泼 棵 贿 嚣 打 白 琉 躁 野 次 沏 图 峨 盟 卓 庚 屋 唇 妄 楚 敌 爽 愁 羌 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 注意事项 1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸 馏水并选用适当的非电介质溶液
24、，如 甘露醇等配制等渗性介质。 2）注意控制高频交流电压和直流脉冲 电压的强度和时间，以防止细胞连接 成串或发生可逆性降解。 磁 粉 销 叙 嫂 赶 独 臻 胜 嘘 藤 掺 倡 渐 佰 咐 复 节 地 割 谢 塑 腺 秧 砌 陇 膘 蒲 骄 胚 乳 小 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 优点： 融合率高，达7080，甚至100 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、 方便简单；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱 导过程可控制性强等。 域 机 拙 搔 腰 质 匀 次 谎 毛 侗 计 身 伙
25、 灿 弗 逻 析 俭 卸 磺 弗 循 泅 甫 咯 汇 意 启 疾 彪 凹 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 融合指数（fusion index）: 反映细胞融合的效率 有两种计算方法： 1.FI=（对照组细胞数-试验组细胞数）/ 试验组细胞数 2.FI=多核细胞中的细胞核数/所有细胞 中的细胞核数 析 追 什 菲 斯 墟 赘 菩 该 叁 冬 午 笑 救 栖 沸 况 圾 盗 海 誉 浚 荧 图 巾 粥 盯 递 刀 临 谚 薛 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 不同细胞融合的
26、条件及其主要应用 来源前处理融合的方法主要应用 动物细胞不需仙台病毒, PEG，电融合生产单克隆抗体 植物细胞脱壁PEG,电融合创造植物新品种 微生物细胞脱壁PEG,高产优质新菌种 尘 涧 舟 掘 促 窗 顽 意 溅 茬 市 脚 无 削 赞 番 道 罩 芜 间 芦 普 狱 云 剧 洪 霜 恐 做 豢 焉 痔 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 同核体同核体异核体（杂交细胞） 未融合 未融合 加入融合剂 融合细胞的类型 俐 捌 屑 赃 吐 徽 臻 秒 团 瓢 咳 力 漳 琼 峻 尧 丢 饿 盅 迁 匈 笨 酗 纱 滦 撬 雨 楚 汽 律
27、 太 肩 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 同核体：由同一亲本细胞融合而来 异核体：（heterokaryon）有不同亲本细 胞融合而来 异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细 胞含有两个不同的细胞核。 煤 鲤 茸 训 衔 介 揩 躬 湍 津 廊 得 鞍 尽 舶 夸 蓟 岩 陵 囚 拭 势 辆 鞘 搪 丝 问 溅 丹 刑 割 钝 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 动物细胞融合影响因素 动物细胞融合中，除促融剂外，其他如细胞性质、温度、 pH、离子强度及离子种类等均全影响细胞
28、融合效率。 亲本细胞表面性质影响较大 细胞种类不同，融合效果也不同，如腹水癌及株 化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。 如仙台病毒诱导-腹水癌细胞融合时，于37 振摇时易于 融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34振摇则融合 率下降。在37时不振摇则-不融合。 篡 芦 轰 墅 纤 筏 捂 浙 砌 烩 忙 烛 贞 科 汁 蜀 福 豁 盐 俘 虽 啪 辜 黄 船 泳 奶 单 寿 段 焦 综 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经 常不融合。空气中含氧量大
29、于20时有一定融合 率，但有些细胞在无氧条件也可融合。 有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋 白质亦发生变化。 实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+，但有 效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为 0.1mol/L。 最适合的pH为7.4-7.8之间，在此范围之外，融 合率均较低。 侠 彦 莲 舀 途 伴 妮 绒 摸 拣 孤 界 痈 捣 尖 噬 腆 啮 轮 铸 喉 堑 履 牛 紫 袄 织 郎 癌 巡 周 韦 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 比较常用的杂种细胞筛选方法比较常用的杂种
30、细胞筛选方法 n n 1 1遗传互补筛选法：遗传互补筛选法： n n 2 2 营养互补筛选：营养互补筛选： n n 3 3温度敏感筛选法 芍 陛 淬 扶 本 巧 维 谎 太 轨 丝 谜 漏 阅 烷 佰 痹 启 剪 曰 僵 惠 掐 属 峡 埋 葵 揪 澄 筏 享 饭 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 1 1）遗传互补筛选法：遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功利用每一亲本贡献一个功 能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令 杂种细胞表现正常。杂种细胞表现正常。 n n 亲本亲本A A：HGPRTH
31、GPRT- - /TK /TK + + n n 亲本亲本B B：HGPRTHGPRT + + / TK / TK - - n n 杂交细胞：杂交细胞：HGPRTHGPRT + + / TK / TK + + n n 在在HATHAT培养基中杂交细胞存活，培养基中杂交细胞存活，A A、B B死亡死亡 键 康 魄 凤 耕 沦 憋 资 溃 瞧 化 龚 犯 巷 蓑 醚 预 截 人 侥 弟 扇 苗 还 娩 汝 闺 之 徒 敖 嚷 盗 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 2 2）营养互补筛选系统：营养互补筛选系统：细胞在缺乏一细胞在缺乏一 种或几
32、种营养成分时，不能生长繁殖种或几种营养成分时，不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细 胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞 。 n n 亲本亲本A A：色氨酸缺陷型：色氨酸缺陷型 n n 亲本亲本B B：苏氨酸缺陷型：苏氨酸缺陷型 n n 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸 的培养基上培养，而亲本细胞均会死的培养基上培养，而亲本细胞均会死 亡。亡。 名 塔 闷 饮 舜 哼 念 鞘 忠 军 恒 猾 渤 医 粒 侮 媒 找 布 熄 逸 常 慕 肾 套 僵 鞍 酬 俗 栈 耪 胚 细 胞 生 物 学
33、 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 3 3）温度敏感突变型温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一杂种细胞的筛选：一 般的培养细胞能在般的培养细胞能在3232度到度到4040度的范围内度的范围内 生长，但温度敏感突变型的细胞能在高生长，但温度敏感突变型的细胞能在高 温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 n n 亲本一：低温敏感突变型，可在低温下亲本一：低温敏感突变型，可在低温下 生长，在高温下死亡。生长，在高温下死亡。 n n 亲本二：高温敏感突变型，可在高温下亲本二：高温敏感突变型，可在高温下 生长，在低温下死亡。生长，在低温
34、下死亡。 n n 杂种细胞能在高温和低温下生长。杂种细胞能在高温和低温下生长。 廖 洞 应 窟 魏 蹿 雀 氰 弃 邱 诉 峡 腐 淹 鞠 啪 慈 扦 瞪 稗 粪 藉 参 妒 庄 特 粥 祖 甜 租 个 脊 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞融合的应用 1.用于基因定位 2.用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗 2.用于动物育种 3.用于细胞治疗 4.用于生产单克隆抗体 5.用于研究核质关系和肿瘤发生机制 挽 贸 收 僧 狰 省 渐 哄 着 么 晰 缴 领 技 粱 粱 卡 案 做 仙 抛 剩 包 吝 乒 挽 俩 瞄 娄 务 估 剔 细
35、胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞融合应用细胞融合应用 n n 一一. . 单单单单克隆抗体克隆抗体 1975 1975年英国科学家年英国科学家 MilsteinMilstein和和KohlerKohler将将产产产产生抗体生抗体 的淋巴的淋巴细细细细胞胞 同同肿肿肿肿瘤瘤细细细细胞融合，成功建立了胞融合，成功建立了单单单单克隆抗克隆抗 体技体技术术术术，而，而获获获获得得19841984年年诺贝诺贝诺贝诺贝 尔尔医学和生医学和生 理学理学奖奖奖奖。 媚 筛 雹 停 丧 食 季 劳 巨 捅 泡 一 嵌 哮 各 烦 隐 泡 匠 烧 匿
36、 赌 兰 庐 苫 米 扔 答 穆 熟 疙 秀 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 forthediscoveryoftheprincipleforproductionof monoclonalantibodies Georges J.F. Koehler FederalRepublicofGermany BaselInstituteforImmunology Basel,Switzerland b.1946d.1995 Car Milstei
37、n ArgentinaandUnitedKingdom MRCLaboratoryofMolecularBiology Cambridge,UnitedKingdom b.1927(inBahiaBlanca,Argentina) d.2002 科莱尔米尔斯坦 淹 冀 伍 蛋 北 薯 峦 医 无 圾 鳞 抢 逾 谍 蓬 解 铀 霹 直 倔 道 剖 咏 兢 昧 闭 鹏 欢 育 括 莎 却 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念 n n 单单: : 单个细胞单个细胞 n n 克隆克隆: : 无性繁殖无性繁殖
38、n n 抗体抗体: : 化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强 漾 寓 睁 截 黄 烯 帛 轮 缉 贸 祥 丁 毒 昌 图 过 塘 萨 柯 匙 八 画 吵 跺 酿 卧 嗜 力 霄 衍 伊 瑶 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 亲本细胞的准备亲本细胞的准备 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选 可分泌特异性单克隆抗体 的杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的克隆化培养 单克隆抗体的生产和纯化 生 产 过 程 俄 惧 庞 伏 遵 房 膜 札 犊 迈 赔 冀 栽 滴 奶 瓦 然 只 猩 俘 赎 崎 公 歧 醉 靡 御 镣 抹 玄 库 乱 细 胞 生
39、物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 单克隆抗体的大量制备过程单克隆抗体的大量制备过程 n n 一一 细胞融合前准备细胞融合前准备 n n ( (一一) )动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 n n 在腹腔免疫在腹腔免疫1 12 2次后的次后的2 24 4周，于融合前周，于融合前3 34 4天加强免疫天加强免疫 一次，这样可以使抗原最近激活的一次，这样可以使抗原最近激活的B B淋巴细胞定位于脾脏淋巴细胞定位于脾脏 ，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明 ，脾细胞
40、与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是，脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是 在抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性在抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性 抗原的免疫量常为抗原的免疫量常为10-100ug10-100ug，经皮下或腹腔注射免疫，经皮下或腹腔注射免疫1-21-2次次 （间隔（间隔2-32-3周），周），3 3周后周后50-500ug50-500ug抗原加强免疫，加强免疫抗原加强免疫，加强免疫 一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞 抗原常用抗原常用2 102 10 7 7 用细胞
41、腹腔注射，不需佐剂。用细胞腹腔注射，不需佐剂。 n n 一般取最后一次加强免疫一般取最后一次加强免疫3 3天以后的天以后的脾脏脾脏，制备成细胞悬，制备成细胞悬 液。液。 堆 痰 曹 朵 低 硅 涤 察 酌 幂 壮 线 研 湘 炔 躯 舰 卿 苛 嗣 惕 壳 提 近 阿 剥 胳 劈 庭 空 讶 锄 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 n n 淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠 或小鼠。或小鼠。 n n 免疫方法：体内法或体外法。免疫方法：体内法或体外法。 n n 体内法：对细胞或微生物抗
42、原可直接注射如小鼠体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠 体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂 混合乳化后，注入到动物体内。混合乳化后，注入到动物体内。3 34 4天后，在无天后，在无 菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率 在在9595以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。 n n 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为1010 7 7 个个/ml/ml，加适当浓度抗原，加适当浓度抗原，3 34 4天后，收集被刺激天后，收集被刺激 的淋巴细胞。的淋巴细
43、胞。 雍 连 樟 擂 爽 盏 忻 织 讽 挖 焚 窝 论 桌 汁 幕 噬 攀 捍 班 嚷 缉 铱 得 车 郡 宋 魏 镊 删 茎 酥 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 n n 小牛血清的选择小牛血清的选择 n n 供血的新生小牛必须是健康牛的产仔，并在产后供血的新生小牛必须是健康牛的产仔，并在产后2424小时小时 内抽血，此期间不得吸取母乳。内抽血，此期间不得吸取母乳。 n n 以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及 滤菌，全过程在滤菌，全过程在3636小时内完成。经滤菌的血
44、清置小时内完成。经滤菌的血清置2020保保 存。存。血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定，血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定， 在确实无污染的情况下方可使用。在确实无污染的情况下方可使用。 n n 每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成1010、2020、 2525于基础培养基和于基础培养基和HATHAT培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交 瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞的细瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞的细 胞毒性。胞毒性。 n n 轻微溶血的血清，而无细胞毒性者仍可应用。轻微溶血的血清，而无
45、细胞毒性者仍可应用。 n n 在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培 养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可避免由于肉眼观养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可避免由于肉眼观 察的疏忽。察的疏忽。 冗 婆 研 渣 夕 钻 歼 石 泌 烘 屯 遣 使 绽 沏 颊 叔 么 翔 抛 记 狠 鸣 竹 合 谚 嚣 协 裁 妥 侵 括 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 B淋巴细胞的准备 红细胞 将红细胞注入小鼠皮下或腹腔 取出脾脏 B淋巴细胞 亲本细胞的准备亲本细胞的准备 蜕 吨 匪 句 侧
46、 览 国 虽 花 拨 以 五 粤 登 柄 扮 装 应 锨 薯 惮 爽 奈 垣 刷 恍 妹 赋 嗜 曙 键 爽 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 ( (二二) )骨髓瘤细胞的获得与培养骨髓瘤细胞的获得与培养 n n 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一 品系，这样杂交融合率高，也便于接种品系，这样杂交融合率高，也便于接种 杂交瘤细胞在同一晶系小鼠腹腔内产生杂交瘤细胞在同一晶系小鼠腹腔内产生 大量大量McABMcAB。 n n 骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细 胞培养液。小
47、牛血清的浓度一般在胞培养液。小牛血清的浓度一般在1010 2020，细胞的最大密度不得超，细胞的最大密度不得超1010 6 6 个个 mlml，一般扩大培养以，一般扩大培养以1 1：1010稀释传代，每稀释传代，每 3-53-5天传代一次。细胞的倍增时间为天传代一次。细胞的倍增时间为16-16- 20h20h。 亲本细胞的准备亲本细胞的准备 枢 溅 曹 泽 拦 真 逸 溉 立 挞 市 痕 帚 磕 惋 茂 琳 吗 叼 拨 橙 扯 镣 饥 范 考 灌 掳 厘 陈 褂 抵 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 骨髓瘤细胞的准备 骨髓瘤细胞：是
48、癌变的浆细胞， 可以分泌免疫球蛋白，所以必须选择 不分泌免疫球蛋白的缺陷型 骨髓瘤细胞，多用多用BALB/C BALB/C 小鼠的骨小鼠的骨 髓瘤细胞。髓瘤细胞。 伍 季 纺 毁 诌 苑 溃 肺 磕 费 麓 澡 郴 燎 毋 姓 灰 逻 发 蓄 针 阶 味 文 炮 烛 沮 凑 矣 个 阵 压 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细胞融合 加入PEG作融合剂 B淋巴细胞骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 1 2 3 4 衣 阵 蒲 济 坡 七 永 膀 磨 耶 旺 丰 丽 熊 霄 咬 乍 唐 惑 孝 假 肌 碧 艘 帕 旷 般 捧 豆 幂 踢 戚 细
49、胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合 二二 细胞融合细胞融合 n n 融合条件除了融合剂以外，还包括温融合条件除了融合剂以外，还包括温 度、培养基和培养板等。我们首先分度、培养基和培养板等。我们首先分 析用析用PEGPEG作融合剂时的条件选择。由作融合剂时的条件选择。由 于作用时间不一样对细胞的毒性也不于作用时间不一样对细胞的毒性也不 一样。用于融合的分子量一般在一样。用于融合的分子量一般在10001000 40004000，一般作用浓度在，一般作用浓度在35355050之间之间 ，PEGPEG作用作用1 12 2分钟，以分钟，以PH8.0PH8.08.28.2时时 融合率最高。融合率最高。 孟 添 荣 禽 柜 循 刹 声 够 此 狞 哺 蓬 梗 辣 驾 边 脑 万 曾 午 十 移 狐 纫 郎 偏 敌 撂 弘 驹 攻 细 胞 生 物 学 实 验 - 细 胞 融 合