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1、水溶液中酶含量的分析测定 曾平 03081064 莎 速 卜 茸 液 木 顽 蛋 暗 陷 收 风 还 郧 蠕 面 蝉 弹 绝 净 蘸 吊 陈 吠 贤 左 知 炸 助 茧 即 桩 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 为什么要测定酶的含量？ 酶的应用十分广泛：作为分析试剂（检 测血糖或尿糖浓度，ELISA体系中作为 指示剂）；多种有机化合物的实验室和 商业合成(如从葡萄糖产生果糖)，生物 大分子的降解（如淀粉生成葡萄糖，基 因图谱中DNA的特异剪切，低相对分子 质量化合物的降解），特定生物大分子 的合成（如PCR反应中合成DNA）等。 因
2、此，很有必要对酶的含量进行测定。 舞 侯 叁 楔 严 唐 兰 树 呈 痊 椭 消 枝 非 茸 咒 积 淳 陈 异 缩 程 吭 枢 慌 舔 瑞 来 谆 抑 信 潞 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 酶含量的主要测定方法 双缩脲法双缩脲法 Folin-酚试剂法 Folin-酚试剂法 紫外吸收的直接测量法 紫外吸收的直 接测量法 结束语 凝 慈 堵 唁 请 吗 镁 魄 啃 刀 要 词 泅 届 眉 盎 令 掌 粮 镍 掐 混 恐 瓦 吞 芳 焊 廊 疫 压 埃 辜 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量
3、的 分 析 测 定 该方法基于碱性溶液中Cu2 +与蛋白质 中两个邻近肽键的专一性反应。因此， 不同蛋白质之间氨基酸组成的差异不会 显著影响测定结果。 习 擂 勘 之 按 黍 芯 薄 粪 并 淬 北 酪 砰 扛 杂 锡 岸 锭 辉 盲 互 窃 窃 绅 擦 值 珐 捣 桂 纱 顽 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 1. 配制适当浓度范围的蛋白质标准液（通常为 120mg/mL之间）。 2. 取1mL各标准蛋白质溶液分别加在不同的试管中。 用1mL蒸馏水或合适的溶液作空白对照。 3.取1mL各待测溶液分别加到不同的试管中。 4. 取1m
4、L双缩脲试剂（1.5gCuSO45H2O，6.0g酒石 酸钾钠溶解于300mL 100 mgmL-1的NaOH中）分别 加到所有的标准液、待测液及空白试剂中。 5. 试管在37保温15min。 6. 520nm波长处用空白试剂调零，测出各种溶液的吸 光值。溶液的颜色可保持几小时不变。 双缩脲法的主要缺陷是灵敏度低，因而不适用 于蛋白质浓度小于1mg/mL的溶液测定。酶含量的主 要测定方法 赶 炮 脚 咳 拌 藐 煌 萝 砸 镀 搪 里 剖 鳞 珍 记 户 女 行 怖 凿 王 巨 秤 父 秽 喀 雕 炽 濒 臻 媒 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的
5、分 析 测 定 实验实验材料、主要仪器： 、Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋 白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼 酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨 蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便， 灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5100g蛋白质。 Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样 品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外， 不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同 。、实验材料、主要仪器：绿豆芽下胚轴（也可用其它材料 如面粉）、722型（或721型）
6、分光光度计、4 000r/min的离心机 、分析天平、容量瓶（50mL）、量筒、移液管（0.5mL、1mL 、5mL）。 、试剂(纯度均为分析纯) (1)0. 5mol/L NaOH (2) 试剂甲： 滑 达 检 勋 垦 抹 例 球 拯 翟 分 怯 绪 橱 咽 约 辉 翁 羚 诡 做 稚 霜 睡 赡 赃 渤 棋 胖 迸 跳 机 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 (A)称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用 蒸馏水定容至500mL。 (B)称取0.5g CuSO45H2O，溶解后用蒸馏水定容至100m
7、L。 每次使用前将(A)液50份与(B)液1份，即为试剂甲，其有效期为 1d，过期失效。 （3）试剂乙： 在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠(Na2WO42H2O)和 700mL蒸馏水，再加50mL 85 磷酸和100mL浓盐酸充分混匀 ，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g 硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱 除过量的溴，冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿色，再滴加数滴液 体溴，继续沸腾15min)。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色 试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L 。 沾 唁 献 笋 跳 褪 此 蚊 棒
8、 絮 盼 袖 厢 瞥 驹 扎 欲 魂 窝 块 臂 需 灿 椿 轧 兜 撑 耸 凯 摘 靶 帽 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 实验操作： 1标准曲线的制作 （1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精 确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内， 用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的 残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量 瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250g/mL的 牛血清白蛋白溶液。 （2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普 通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和 蒸馏水，
9、配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液 。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min ，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要 快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋 白质的1号试管为对照，用722型分光光度计于650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。 确 像 弓 帘 途 频 犬 雁 国 菏 姆 釜 祝 泽 舔 揣 恕 刑 柬 匝 宙 甄 闪 磁 炭 佃 署 聊 搬 哟 冈 买 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量 （g）为横坐标，以光密度为纵坐标绘 制标准曲线
10、。 漏 枚 湛 亚 骂 摸 妊 明 决 泪 淋 岸 遭 勃 卤 慨 股 凉 恶 弱 吏 钢 钳 棺 脯 扭 倦 翌 埠 挤 哄 栈 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 样品的提取及测定 （1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中 ，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离 心管，并用 6mL蒸馏水分次将研钵中的残渣 洗入离心管，离心4 000r/min、20min。将上 清液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻 度，作为待测液备用。 （2）取普通试管2支，各加入待测溶液1mL ，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min， 再各加试剂
11、乙0.5mL，迅速混匀，室温放置 30min，于650nm波长下测定光密度，并记录 结果。 晾 伪 驳 蜗 恍 涸 浪 砷 挛 伊 闪 问 欺 孵 颇 肉 狰 锤 喀 摹 兢 万 趴 累 纫 想 屹 嫂 瓶 人 彬 睁 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中 查出相对应的蛋白质含量X（g），再按下列公式计 算样品中蛋白质的百分含量。 样品中蛋白质含量（）=（ X（g）稀释倍数 样品重（g）106 ）*100 另外：进行测定时，加Folin试剂要特别小心，因为 Folin试剂仅在酸性pH条件下稳
12、定，但此实验的反应 只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin 试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试 剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程 度减弱。酶含量的主要测定方法 幼 任 计 颗 烛 鬃 撒 苑 钢 唬 穷 蚜 护 帅 力 中 筹 柞 跳 嫉 蹬 旋 娶 棉 滥 固 泅 鸡 凸 芳 炭 嘱 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 用于粗略估算的紫外吸收的直接测量法 蛋白质对电磁辐射的最大吸收峰在280nm处 ，这一特性是直接测量紫外吸收法的基础。 该方法的主要优点是简便非破坏性。核酸是 本方法中最常见的
13、干扰物质，可以通过测定 260nm处的吸收值加以校正（260nm处，核酸 的吸收值大，而蛋白质的吸收值小）:蛋白质 纯溶液的A280/A260值约为1.8，该值会随着 核酸含量的增加而减小。也要注意溶液中任 何游离的芳香族氨基酸在280nm处都有吸收 ，使蛋白质含量的测定值偏高。含有少量核 酸的蛋白质溶液的最简单的校正步骤如下（ 要用石英制比色杯）： 半 暖 伏 刃 茫 姻 甩 使 乒 荒 锯 倚 活 寇 腔 驮 弟 秃 作 带 苦 苔 砰 卫 绵 盆 斧 暇 榨 恿 屈 缘 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 测定溶液在280nm处
14、的吸收值（A280） :若吸收值大于1，适当稀释后重测。 测定260nm处的吸收值（A260）。 用关系式：蛋白质（mg/mL） =1.45 A2800.74 A260。酶含量的主要测 定方法 油 拈 喳 暮 害 哟 榜 毯 扭 师 行 员 镍 柑 廷 念 瘤 朝 娩 褪 尹 敢 爆 斌 碰 瓦 属 磁 屏 湖 挺 鸥 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 主要参考文献： .董慧茹等著复杂物质剖析技术 .Allan Jones,Rob Reed and Jonathan Weyers著 李玲等译生物学实验技术 .Kent K.Stewa
15、rt Richard E. Ebel著上官 棣华等译生物体系中的化学测量 4.何锡文等著分析化学1995.23生 物体相关物质的分子识别分析 痞 为 沃 巷 嫉 葛 计 蹬 永 燥 猴 对 嗅 钱 洛 遂 龙 贮 均 袋 钓 臼 斯 朝 夫 辞 碘 揍 哟 花 周 控 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 THANK YOU！ 谢谢观看 钠 懒 帘 冰 郭 堂 娩 以 仁 兆 然 淑 锥 伯 散 跋 蔫 约 益 停 驯 洞 鬃 共 界 靡 遂 址 娃 静 呆 坏 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定 水 溶 液 中 酶 含 量 的 分 析 测 定