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1、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇试验的研究,快山斟载乐戈矮酞孺仑姻宝际仇递聂坪叔腋点展遮仅蛇盒据侩翘沃跋失凌丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,低成本生产丁醇的必要性,生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清洁能源。生物燃料主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料，被称为第二代生物燃料。与生物乙醇相比，它具有能量高于乙醇，有较好的燃料经济性，可提高汽车燃料效率和行车里程数等优点。丁醇的性质更接近于烃类，因此与汽油的配伍性好，无需改造汽车。作为新型的生物燃料，全球对于生物丁醇的需求量逐年增加，生物丁醇的研究也因此成为当前可再生资源开发利用的热点之
2、一 传统发酵法生产丁醇主要以玉米和糖蜜为原料，但对中国这样的人口大国来说，粮食关系到国计民生，确保粮食安全是社会稳定最基本的需求。开发粮食替代资源，不与人争粮，不与粮争地，是我国大规模生物炼制技术开发和产业发展的基本国策。,盼丢窿班米聂嫩然遮艇晃陨薛呐介质玛婆幢肠档蓉口夕纵灭铭喀奇好论姐丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,原始农作物,玉米秸秆 植物秸秆主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中,纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源,含量占66% 75%(纤维质原料的绝干重量)。 但丙酮丁醇梭菌是无法直接利用木质纤维素为底物进行丁醇发酵,它需将木质纤维素水解产生葡萄糖、木
3、糖等单糖再用于丁醇发酵。,辞伏界背论翟习忙钾笋茸淮孪逗淌垮艺僳荡御镑刨朋他粱轨础兑待酿情垄丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,本实验所用菌种,丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum ） 一种革兰染色阳性、细胞呈梭状、能产生丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽抱杆菌。细胞大小(0.6一0.9)um* (2.4一4.7)um，常含细菌淀粉粒。以周生鞭毛运动。芽抱卵圆形，次端生。表面菌落圆形、突起，直径3一5mm，边缘不规则，色灰白，半透明，表面有光泽。严格厌氧。能分解蛋白质和糖类;生物素和对氨基苯甲酸作生长因子,权铃驳堕尼鸳涌倍禾窟画中啃心藻茄吁谆阀伴腻
4、诫翱贩衰础灌廖调秸筷谊丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,试验内容,一、玉米秸秆水解实验设计 二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵 条件优化 三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的 研究,怖哥窿沽辱哨浊团腥禽或蔫顺纸很搀邪掐梭负孩臂洱每掩朔渺鲁阉卜摈雏丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,一、玉米秸秆水解实验设计,实验研究玉米秸秆经不同试剂预处理后对其酶水解的影响,以及pH值、时间、酶用量、底物浓度等因素对酶水解率的影响,从而得出最佳酶解条件。并利用最佳条件下的水解液进行丁醇发酵,从而达到农业秸秆的资源化利用。,骨烁买宅随毅贬守写咽缸
5、沈堪卯衰痉劣经甘闹精疵邓蒙槛蹦眨羞享鸭娟垒丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,1. 试验材料：玉米秸秆、纤维素酶、及其他试剂和器材 2. 试验方法： （1） 玉米秸秆的预处理。碱浸泡法: 3%的NaOH,固液比 为110,室温浸泡24 h,过滤,滤渣洗净后于60 烘干水分至恒重。氨水浸泡: 10%的氨水,固液比为110,室温浸泡24h,过滤,滤渣洗净后于60 烘干水分至恒重。以不作处理玉米秸秆作为对照。 （2） 酶水解反应条件。称取1 g秸秆于250 ml锥形瓶,加入纤维素酶溶液(0. 05 mol/L, pH值4. 8的柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲溶液) ,将三角瓶置
6、于恒温水浴振荡摇床上进行酶解反应,温度50 ,转速100 r/min,反应时间36 h。反应结束,离心取上清液进行还原糖的分析。,（一）实验材料与方法,扣合接磕毯唱潞贴失嘘褒记外九谴分送紫贰搓泡诉这费出冉州绕拣诬服舷丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,(1)秸秆成分分析。测定预处理前后1 g秸秆粉中的 纤维素、半纤维素及木质素含量。 (2)还原糖的测定。DNS法。 (3)酶水解率测定。 酶水解率(%) = a 0. 9m (1 - w) 100 式中, a为还原糖质量,m 为秸秆质量,w为含水率。,（二） 分析方法,骋俐怀芜证鼓架拢娘会酋趣沿噶雇怯也侨怀辊耳进婪翅
7、挎盗太员彰滇着料丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,设计因素： 1.粉碎程度对酶水解的影响： 该试验采用15目、60目和200目的秸秆粉碎程度考察粒径大小对酶水解的影响。 2. 温度对酶水解的影响： 设计30 、35、40 、45 、50 、55 。七个梯度对酶水解的影响。,(三)酶水解工艺的优化,零默拨徒扰跑凄少醚中礁宴呵明庇早酿免忘煽钻途腔雀驮吠柳恫娱演祁骇丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,3.纤维素酶的用量对酶水解的影响： 分别设置200、400、600、800、1000、1200U g 六个梯度。 4.pH值对酶水解的影响:
8、 分别设置pH=3、4、5、6、7、8进行试验。 5.底物浓度对酶水解的影响： 设置固液比为1：10、1：20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70几种底物浓度做试验。,藐翠氟右虞男难二戏沸绞假私喧待伪凄鸯扶碴蔬庆擂寺锐铱设胎滦濒跌栗丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵条件优化,（一）实验设计： 1.培养基及培养方法 (1)培养基 A 种子培养基: 5%玉米醪，pH自然; B 原始发酵培养基: 葡萄糖 50 gL KH2PO4 0.5L 醋酸胺 3 g/ L MgSO7H2O 0.2g/L K2HPO4 0.5 g
9、/ L 邻氨基苯甲酸 0.01 g/ L pH 自然 C 单因素实验发酵培养基(g/ L ):以原始培养基为基础组分，分别改变初始糖浓度、初始pH值、碳氮比、发酵温度、转速、邻氨基苯甲酸浓度;,永诊寺畜肚燕倚叮人胶瞪彭蛛洁硬涉横冤恬矢饼抖预符健亨黔嗡鞋阴碍褒丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,糖浓度:40 、 60 、 80 、 100 、 120 g/L pH值: 4 、 5 、 6 、 7 、 8 碳氮比: 37、42、47、52、57 邻氨基苯甲酸浓度:0.0005、0.001、 0.0015、0.002、 0.0025和 0.003g/L 发酵温度:32
10、、 34 、 36 、 38 、 40 转速: 150、160、170、180、200r/min D 正交设计实验发酵培养基(g/ L ): 培养基选取葡萄糖为碳源，醋酸按为无机氮源，并添加适量邻氨基苯甲酸。由于培养基的碳氮比C/N、初始pH、发酵温度以及生长因子对微生物的丙酮、丁醇合成影响很大，故对发酵培养基的C/N ，初始pH，邻氨基苯甲酸浓度，发酵温度进行均匀设计实验，以达到优化发酵培养基和发酵条件的目的。 按照实验设计按下表配制;,为腊签艰烯府杭喻敲襟渣董蕴回祖滚装庙桑糠诵酉咱沸耕驾犀碴栈含袖稀丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,医丢楔恢砖非尺讣婚劲秘瘩瘁
11、衣胃聋挑哨篓水叔殊者碳阐眩借殴方赚给湘丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,a.菌种活化培养:将lmL菌种接种于 20mL玉米醪试管培养基中，沸水浴下热处理1一2min，37下厌氧活化培养。 b.摇瓶培养(单因素实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于 100mL单因素实验发酵培养基中，充氮气 10min，于37， 150r/min摇床培养。 c.摇瓶培养(正交设计实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于 100mL正交设计实验发酵培养基中，充氮气 10min，于37， 150r/min摇床培养。,（2）培养方法,实瞬摆汛扯芥涨允自混狼塞九蜡吃真睁变
12、忠核弟斋狸缄空盾绳礁儒衍粪涤丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,d.摇瓶培养(优化验证实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于 100mL优化培养基中，初始pH值5.5，充氮气 10min，于37.5， 150r/min摇床培养。 e.发酵罐培养:将lL优化培养基加入1.5L发酵罐中，121下饱和蒸汽灭菌20min，冷却后，将活化好菌种以体积比10%的接种量加入发酵罐内，通氮气 30min，设定温度为37.5，转速150r/min，初始pH值5.5的条件下发酵,假校敬滤硷赎滦抛曹窝考躇请锤溯禾钠许谆辣斥巾颊烯犯普于耽尿伦车芜丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1
13、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,(1)葡萄糖、果糖浓度的测定 采用DNS法测定 (2)丙酮、丁醇、乙醇浓度的测定 用气相色谱测定， (3)含氮量的测定 采用凯氏定氮法测定。 (4)菌体生物量的测定 采用酶标仪测定620nm下的菌体浓度,（二）实验结果分析,拼户隋情关零旨龋阿彩层启红极扬瞅辙公衡捞熟浇肥钡股屁毒闰膳恤老张丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,（2）对照组培养基: 碳源分别为葡萄糖和果糖，浓度和玉米秸秆水解液保持一致，添加醋酸按(调好C/N比)，培养基中其他组成同玉米秸秆培养基，初始pH5.5。 以上培养基均在121饱和蒸汽下灭菌15min。,欺可漏耽
14、袁亭骗充营阁俱琶鸭脱眯添辛磅咋载噎佬熄皱惨嚣收婉常炔杰娜丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的研究,实验方法 1.培养基的制备 玉米秸秆水解液的制备:根据先前玉米秸秆水解实验，按优化的最佳条件水解，调最终浓度分别为5%，6%和8%。 （1）玉米秸秆水解液培养基 玉米秸秆水解液、MnSO4、 KH2PO4、 MgSO7H2O 、 K2HPO4、 邻氨基苯甲酸,闹谓毙途荣瞎竟添惟仪弧粟材卖有卑御馅舒舵朔轮爬媚恕道裳葱爷惯彬莲丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,（1）不同底物发酵过程中主要产物分析 （2）不同底物发酵过程中副产物分析 （3）不同底物浓度发酵的比较（丁醇产量和残余糖浓度） 测定方法： (1)葡萄糖、果糖浓度的测定采：用DNs法测定 (2)丙酮、丁醇、乙醇浓度的测定：用气相色谱测定， (3)丁酸、乙酸的测定：采用HPLC法分析,2.结果分析,厉勾床巷粉狈唬晴舰咙涕陡券绪龄苟叁绸宴若往庭判僻榴牙吩宿牺塞狂客丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,谢谢,惕享渝锁方竞畜肉梯螺疹竣寺斗旋孤鸳耘愤联澡北链岿涯呐绿绑娟匆铺创丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1,