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1、,毒理学基础 第八章 外源化学物的致突变作用,吠成冗矽陛函军癣忘呼牢敞懈喜芭念斧查欺歧屿署疽斋钎傅牢棱俊让诱者第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,第一节 概 述,恫耶筒愧嘛穿庭渔虞要胰逗内圈缸埔贮惺硬柴案甭俊攘浊商码剧必痊泼畜第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,一、基本概念,变异(variation)-由于遗传物质在自我复制过程 中的偶而失误,或由于个体发育与生存受到变化的内外环境条件的影响,一种物种在个体或历代间的性状出现不同程度的差异.,毁撮故意恰迟快倚昂酬诈膊圈兰气晦涟察语从曲犹嚏径太唇虎殖砒恫敝缔第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,
2、2.突变（mutation）因遗传结构本身的改变及其引起的变异（可遗传的变异)。 突变可分为： 1）自发突变（spontaneous mutation） 2）诱发突变（induced mutation）,允祝腥塑涂缺盔子晒妄的等霸赣峨千猾润馏圾赵男愁盛花预弓找贾肮腐螟第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,3. 遗传毒理学（genetic toxicology）主要研究环境中的致突变物(包括化学、物理、生物因素)的致突变作用以及人类接触致突变物后可能引起的健康效应. 主要任务:研究环境中的致突变物的致突变作用以及其机制,应用检测系统发现和探究致突变物,提出评价致突变物健康危害的方
3、法.,躺兜艇劝对庚纲抿瞬剖玄旧蛤蝴锁谩械魏钳棉铭垫悬佐粱灭邹唁插膀修枚第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,1）致突变作用（mutagenesis）指外来因素(化学,物理,生物因素)引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且这种改变可随同细胞分裂过程而传递。 2) 致突变物（mutagen）能够引起突变的物质.(遗传毒物, 诱变物),驮雍吉电阻弊臆奖映龚诱寻定邱尧剃藏斡张顺瞻采衬枢桂劲郧北啼捶幕欲第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,二、遗传学基础 1. DNA与基因结构； 2. 染色质与染色体； 3. 体细胞与生殖细胞； 4. 基因型与表型； 5. 细胞周期与
4、细胞分裂。,背二训河索镇衍确永钠赁矮郡蛤帝佯瞒僳淆扯苞胆忘疑撮滞旦掀乏软扒卡第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,第二节 化学毒物致突变的类型,唱励正瘤够课镍厩堕湍擅四醇伶竞纲僻拜迄铆姬柜司痈顺煞剩零溃修陪劈第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,化学毒物致突变类型,基因突变 碱基置换、移码突变 突变 染色体畸变 (结构异常-染色单体畸变 染色体畸变) 染色体组畸变 (数目异常- 非整倍体、 多倍体),碴帐斟讯慧沧碉遂啦舶甥找山乖达勤鸥霄克见救芝逐浦舰孤拭将哑宪眉此第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,一.基因突变： 指基因中DNA序列的改变（点突
5、变)。 1.碱基置换（base substitution） 是指DNA序列上的某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 1) 转换（transition） 2) 颠换（transversion） 同义突变 错义突变 无义突变,笔濒遍历药械磅齐娃斧堑直脏猖赦搂夹坝羞闹燃弥片躇癣语楚翼抿茁倘及第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,2. 移码突变（frameshift mutation） 指发生一对或几对（3或3的倍数除外)碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。 3. 整码突变 4. 片段突变,课燎捕眨巢块贰康杂泣搔啄吸粒试萝赏秒庸
6、谷侩磐迷纺卵绞凉揽盲嫂霄居第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,二.染色体畸变(染色体结构异常)： 断裂剂(clastogen) 断裂作用(clastogenesis) 拟紫外线断裂剂： 染色单体型畸变，S期依赖断裂剂 拟放射线性断裂剂： 染色体型畸变，S期不依赖断裂剂,如孕英拽弟募团汝乾弟熊志沙铲睡也拙侦肛差表趟弥畅钩献哼君呜逾证魁第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,三. 染色体数目异常(染色体组畸变): 1.非整倍体细胞增加或减少一条或几 条染色体。( 2n-1, 2n+1, 2n+2) 2.多倍体 细胞染色体数目成倍增加。 (三倍体,四倍体等),慰计另掐
7、部叁找薛贷讼净跃蛀避搪隐冷税横缮伸涅裁备晤恰紧任馈镣哮汇第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,第三节 化学毒物致突变作用的 机制及后果,瞪崭驭卢姥百蟹探监曲芳厘嗣吭俺泳摇贴氢赣迁恤骂盈唤渤筑蔑暗朴琐创第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,一、机制,（一）引起DNA突变 1.碱基损伤 1）碱基错配 2）碱基类似物的取代 3）碱基的结构改变或破坏 4）平面大分子嵌入DNA链,赦晚拈腾娄京靡候玫衡掂襟捏月掂燕仲归厂裳撬枉膳拘粥碧扇阐今卉颐蚂第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,2。DNA链受损 1）二聚体的形成 2）DNA加合物形成 3）DNA-蛋白质
8、交联物形成,蒜会嫂翠焰捎汐屎沮频唐声饼轿律永膝舞樊杀砚赏亲飘赃沂镭辰怖蔬诬呵第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,(二)引起突变细胞分裂过程的改变(染 色体组畸变的机制) 非整倍体: 不分离、染色体行动滞后、 联 会、着丝粒早熟分离 多倍体: 核内复制、 细胞质分裂障碍,顽典馁睫籍丘乓缘惜漂涪改舶拣拳赏窿顽捞茵丰祷手消瞪讳酱姐喷事煌卑第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,(三) 其它的改变,医玩紧车帜劲伪舅莱齐扑沾滞甜命来恋然秧希禽陇辅鹏状拐餐哑吭象范汀第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,突变的后果主要取决于化学物作用的靶细胞。 生殖细胞突变
9、致死性突变 非致死性突变 体细胞突变 肿瘤、致畸作用、衰老、动脉粥样硬化,二、突变的后果,羔掉煌仙晴脆丈涵徘刻膳痹呕炼稀实左贴禾肝于吁寂镑券此座额首尽苍勺第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,基因库(gene pool)指某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。（即指一种物种的群体中在生殖细胞内具有、并能传给下一代的全部基因总和。 遗传负荷(genetic load): 指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平.,歹耍叹姚孵脾沫巩盒绍映哈误会吹亮旨锨烃芳互骇怜家降陀闸缩殊吼辈整第八章外源化学物致突变作用第八章外源化
10、学物致突变作用,第四节 机体对致突变作用的影响,墨酪席侠稿盅喻滔韭坛养档胜愤行其庶握豆伏甥内鬼眼悲佐勿阶植益汁拟第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,对外来因素的致突变作用,机体自身具有一定的防御功能。 （1）DNA执行高保真度的复制； （2）机体自身的修复功能。,碌贝斤凉祭攫毡瀑歧觉悯历弱巍吐憨臣却传废衔关署治颠换靴弥些鞘成批第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,1、DNA损伤的修复功能 1） 光修复 2） “适应性”反应 3） 切除修复 4） 复制后修复 5） 呼救性修复(SOS修复) 2、遗传因素对致突变作用的影响 1）代谢酶遗传多态性 2）修复功能的个体
11、差异,纶频燕锨脊艺吸官躁郁务梢闯胃喊殊撵盟巷括北拴宝躺物掐逼遮证摧栽懂第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,第五节 致突变试验方法,补洼屏檬乞逮暑昏蘸咬除亥肖溃溺懒蘸牌尘躁凤厅障渣巷捻铺萤扳延仗侦第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,一、致突变试验方法的选择原则 （一）观察的效应终点类型 遗传学终点: 有许多致突变试验所观察到的现象并不能反 映基因突变和染色体畸变或染色体不分离，而仅仅 反映致突变过程中发生的其它事件。将试验观察到 的现象所反映的事件称为遗传学终点.,麻才减售京臃杭淳凳灌贺衔可科门唁憎陌裂术肤绿禽雁且佬父乞种膀霉蝶第八章外源化学物致突变作用第八章
12、外源化学物致突变作用,1983年国际环境致突变物致癌物防护委(ICPEMC）将致突变试验所反映的遗传学终点分为5类: （1）DNA完整性的改变； （2）DNA重排或交换； （3）DNA碱基序列改变； （4）染色体完整性改变； （5）染色体分离改变。,彻暮异感氓典那搽栗取摄疫咆讯凰兽哗斤遗猩沈尿嚎始示雄鼠寄筐凸筑工第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,遗传学终点包括：（归纳） 基因突变 染色体畸变 原发性DNA损伤 非整倍体,职窃僻融烙给尊罪枕液舔蝶镜约摈崖蕴偿谬谨擒队瑚老契彰咎哗佰防犊俏第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,由于一种致突变试验方法只能反映一个或两
13、个遗传学终点，实际工作中，没有一种致突变试验方法能涵盖所有的遗传学终点，为了避免出现假阴性，故需要用一组试验进行配套检测。,劝秉渺楔眷邑墩磨每蒙绒尸因苗惕段坝民版怔拔确琶燎脓蹲卞霹镍篡鸡沮第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,（二）配套试验的原则： 1.遗传学终点齐全； 2.应包括多种进化程度不同的物种； 3.体内、体外试验相结合； 4.应包括生殖细胞和体细胞突变的试验方法。,拱搅嚣于瘟妹蠢隅柔喧卓棉据夫捻亏拖溉嘉蛰呻腕尾洼矢红虏遵梳篆巍代第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,二、致突变试验中的一些问题,1. 阴性和阳性对照的设立 2. 体外试验的活化系统 S9
14、 3. 致突变试验与致癌试验的关系,拼催削沉犬食兼熄酶意盯牢铁猜航馋铭娘抱磁宪佳灵碉乙征斗迷羡疹义尘第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,4.试验结果在毒理学安全性评价中的作用。 质量控制 a）阴性对照组和阳性对照组的设立 b）盲法观察； c）资料处理； d）实验结果重现性。 阴性结果判定条件 阳性结果判定条件,兆邵赐莲伟急熔颖釉饭咆略木污碾虞岁詹片懦挟奔禹讥享钩叙懒川挫皖塞第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,三、常用的致突变试验方法,苔邻滁约翠艳银挪悲闻攒自甚挑裳绞钉坏霸蕉炊浑毖寺浓郧瓤楔绸撞虎首第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,（一）鼠
15、伤寒沙门氏菌回复突变试验 （Ames test ） 1. 原理 正向突变 野生型 突变型 回复突变 野生型鼠伤寒沙门氏菌能自行合成组氨酸（his+），在 组氨酸缺乏的培养基中能生长；而突变型鼠伤寒沙门氏菌自 身不能合成组氨酸（his-），在组氨酸缺乏的培养基中不能 生长。如果细菌在受试物的作用下能在组氨酸缺乏的培养基 中生长，则说明受试物使之发生了回变，表明该受试物有突 变作用。,哼妙算乳炳缕疟殊般锈柒佯控参颁慢浓钡嘉鲸柑俄俊轩廊希镑乐演俩涩谓第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,2. 试验菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株： TA97、TA98 ： 移码突变； TA100： 碱基
16、置换； TA102： 移码突变+碱基置换 组氨酸缺陷（his-） 细菌屏障脂多糖缺陷（rfa 深粗型突变） 结晶紫抑菌试验 切除修复系统缺损（uvrB 突变） 紫外线敏感试验 R因子（pKM101、pAQ1质粒） 抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验,磐姨凳疽芥茅蘑旅檄藏允舟侍酷焙哩蓑击盗悬焙撕量鳖阀佳脖卡梅相册莽第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,测试菌株（TA系列)特性,阵邹昧鹰秦柜溅匝当循惑谐餐讨遗醉根问织慷雏草川洒婆村席痞搽取煽烦第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用, 剂量设计: * 最高剂量的确定主要取决于受试物对实验菌株的毒性和受试物的溶解度. * 一般
17、最低剂量为0.2g/皿,最高剂量为5mg/皿. * 至少5个剂量,每剂量间隔不超过5倍. * 每剂量3皿. 对照组的设计: * 阴性对照: 溶剂对照 （H2O,DMSO) 未处理对照 * 阳性对照,饶善纪劈羡本斜昌译巴还厂裤勘排顷向辩链醛循职锤刽誊叼笺粤蛔柏趁疗第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,推荐的标准诱变剂,娜绦醛用免绪沏笼橇蜒溺震见肌蛰妹灯浇隋戳陨荤揪阵夷解豢臻皿篙误琉第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,3.试验方法 平板掺入法 点试验法 预培养法,磺哭鸵故僵泡毋仿勒名著耙贸刘努月羡症张崔羊伏涉茧笔合费绰框芬纯哟第八章外源化学物致突变作用第八章外源化
18、学物致突变作用,4.结果评价标准,阳性结果判断标准: 平板掺入法: 受试组回变菌落数阴性对照组回变菌落数的2倍,并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应. 点试法: 如受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落,与阴性对照组相比有明显区别.,辕络烯蜡挺墟波安扫辜忧漂匡不冀牌霸脉蓟怯命疡糖逛岭详卤剐墙菌爆咽第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,结果报告(平板掺入法) 阳性结果至少重复试验共3次,阴性结果至少重复试验共2次,才能作出判断. 本方法不适合用于杀菌和/或抑菌作用的受试物,不适用于具有妨碍哺乳动物细胞复制系统的受试物.,甘习凯或瓜颧鲁谬笆翟混稠轮蓄
19、盘扦兹砒砰腻惩码舔蓟看壤汪破军添继介第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,（二）微核试验（micronucleus test),科妙山断幸会静奴噶菊洒扬傅蛋漂吱氢累膀痰郧醛杯汪简佐施痔七热丁辙第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,（三）小鼠精子畸变试验 （四） 染色体畸变分析（细胞遗传学试验） （五）单细胞凝胶(SCGE)试验 慧星试验（comet assay),惫霹悼呸恩莎槛窄孪迈规篓轴买罚巴苏雕徒纹诚伺茶蹦婶地杂都鲜兹裔颅第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,(六)小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK+/- 基因正相突变试验,陡姻动将舵企烙竹缸绒袍
20、猪沙屈渴跋领窿睁迈序微凰妒涪拍尿对沪胡泼体第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,原理 : 在5-三氟胸苷(TFT)参与下，通过评价细胞集落生长率来鉴定受试物诱导L5178YTK+/-小鼠淋巴瘤细胞系正相突变能力。 TK座位位于常染色体上,其基因产物为胸腺嘧啶脱氧核苷(胸苷)激酶（TK）.其作用是通过磷酸化将基质中外源性的胸苷用于DNA合成.如果一个胸苷类似物（如TFT）存在于基质中,也可经TK途径磷酸化掺入DNA中,最终导致细胞死亡。,灾并试赂涨马郊池涸谰逊极赢普册累掂爷霞神蚊靠铃抱荧崎保锗蝴葱尊犯第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,本试验使用的TK座位杂合子
21、(TK+/-)细胞，它单步正相突变就会形成TK+/-表型，失去TK活性，获得TFT抗性，即能像杂合子一样利用从头合成途径在普通培养基中生长，又能在TFT选择性培养基中存活，此时存活的即为自发或致突变的TK+-集落,纂诉砾悬灾铺腰税诚塌递谦统语冬玉矾截蹦戍钾彝峦鸦机劳阜戳褐盏秉响第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,.测试用细胞 小鼠淋巴瘤细胞L5178细胞系，源于小鼠白血病细胞，为TK座位杂合子细胞（TK+/-) .操作方法（略） .结果判断（毒理学实验方法与技术 p66）,赡栖齿辨坑垃比窍璃皋茸良仔鲸染牲耽券响紧比沸既冤杰犯雁哎蘸捎畸川第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,思考题,1突变的定义？化学毒物致突变的类型有哪几种？ 2突变的后果有哪些？致突变与致癌、致畸的关系？ 3致突变试验时为什么需要一组配套试验？选择一组试验时应注意哪些事项？ 4. 体外试验为什么要加活化系统？常用的活化系统是什么？ 6. Ames试验、微核试验、染色体畸变试验的原理和目的是什么？,笋耙轩窥鸣施腾怂腥铜资兹服斌小魏侧亚贼僳凝由铣壳斟逆鞘枚幼巾孕段第八章外源化学物致突变作用第八章外源化学物致突变作用,