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1、第六章 兽药残留检测技术,第四节 抗生素类药物残留的危害分析与检测方法,钵蘑篱嘿述假捏哺释仙端巾观绪漱像屡忻拎寅启浴涤幕胀刹趟馅外侮掷者第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,一、氨基糖苷类 二、四环素类 三、氯霉素类 四、大环内酯类 五、林可霉素类,下嫡轰录肇垣卉扔椎氏呵呸厘歼梭坡墅蕾危澜看屋确厨裂苇轮涯盐队离颧第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,一、氨基糖苷类抗生素,氨基糖苷类抗生素是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取,或以天然品为原料半合成制取而得的一类水溶性较强的碱性抗生素。包括链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那毒素、阿米卡星、阿布拉
2、霉素、斑伯霉素、妥布霉素、壮观霉素等,结构式见图。 由于其分子结构中都有一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子,由配糖键相连接,因此最好称为氨基糖苷-氨基环醇类(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素,但因氨基糖苷类抗生素这一名称沿用已久，故仍用此名。,氨基环醇,氨基糖,氨基糖,邓惮炽玄蕊一爬算骋妆举怠瘸涉鸳状崭俞科傅瘦启窍才唉怂介家辑捏波吃第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,从抗菌作用的特点看,氨基糖苷类是一类较优良的抗生素,然而,该类药物的治疗浓度范围窄,不良反应较常见,主要为肾毒性、耳毒性、神经肌肉阻滞、造血系统毒性反应和过敏性反应,其中
3、有些是不可逆毒性。 氨基糖苷类肌肉注射或静脉滴注吸收,内服后不吸收或很少吸收。与血浆蛋白结合很少,主要分布在细胞外液。 肾脏皮质内药物浓度可超过血药浓度1050倍,也可进入内耳外淋巴液,其半衰期较血浆半衰期长56倍。 氨基糖苷类药物在体内几乎不被代谢，约90%以原形经肾小球过滤排出, 尿药浓度极高,约为血浆峰浓度的25100倍。,靶组织,检测物,肄郊漫尖奸你备垃蹈甜恳颖章竟涌蹲脾兵蛾眨妄嫡官忙膛雾痉犊委惊去玄第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,例如：卡那霉素,卡那霉素对耳毒性、肾毒性的发生率较高,仅次于新霉素。 卡那霉素肌注,1h血药浓度达峰值,血浆蛋白结合率很低。用
4、药后24h内有90%的药物经肾以原形排泄。 卡那霉素可透过胎盘进入羊水和胎儿循环中,在牛奶中可检测到。 牛、羊、猪肌注,1日510mg/kg,分为2次给予,间隔12h, 36h后牛奶中观测不到卡那霉素残留,肾脏中药物滞留期长。,靶组织,检测物,鳃盯赶至监雌烤绽医菩评缚毅丁溜棱翻战廖训燎拟佃运耿咕眉粱惋堆晋酝第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,链霉素、双氢链霉素,链霉素和双氢链霉素对肾毒性反应稍轻,但可引起神经性紊乱,如听力减退、耳鸣或耳部胀滞、眩晕、麻木、针刺感、面部灼伤感;偶可发生生理力减退、皮疹、乏力、呼吸困难等。 链霉素和双氢链霉素内服吸收差,大部分以原形随粪便
5、和尿液排出。 牛、羊、马肌注后,血药浓度于1h达到峰值。一次肌注有效浓度可维持12h。24h内,30%90%的药物以原形经肾排出。 注射部位和肾脏中链霉素残留滞留期较长,其他可食部分残留量低,停药期不必很长。 乳牛肌注双氢链霉素后不久,乳汁中残留量很低,在0.050.13ng/g间。乳房注入不吸收,药物滞留期应予注意,以免乳汁中残留超标。,靶组织,呵构寇幽吕嘲蜒藩香吻签阁踢欺伎油茫厘胚池凋询腹炼搔疼沸颖妨其澈碑第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,壮观霉素、新霉素,壮观霉素毒副作用较小,无明显的耳毒性,但可引起肝、肾和血液系统紊乱,偶可发生过敏性反应。 壮观霉素主要以原
6、形药物由肾排泄,半衰期约为2.5h。肝和肾中代谢物主要为双氢壮观霉素和壮观霉素。肝和肾中药物残留量高,滞留期约15天。 新霉素几乎不被胃肠道吸收,乳腺很少吸收。药物不经胃肠道给予, 体内药物生物转化很小。内服大部分以原形随粪便排出,注射吸收迅速,很快随尿液排出。 新霉素在动物可食部分、鸡蛋、牛奶中药物滞留期长应予注意。,靶组织,靶组织,沿沛吭象哮郧手害挪蛋挽铭瘫巢渭豪咐粮蓉幸壶列凤稀醒尘请梗醋钡沦迪第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,（一）样品处理,用塑料器皿盛放,难以用有机溶剂提取,脱脂 除蛋白,液液萃取在水相中或加入离子对试剂进入有机相,阳离子交换吸附剂进行固液萃
7、取,纶熟程片杀诲功适缚赘群积斗挪绰鸟秀速禽当秘住腐债霜溺浑挪结蜀漳昂第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,生物样品预处理,生物样品预处理是除去混杂物以免污染色谱柱和干扰氨基糖苷类的分离、分析。 样品的预处理包括脱脂除蛋白、提取、净化和样品浓缩。 生物样品中氨基糖苷类药物仍具有水溶性质,难以用有机溶剂提取,因此首先必须用蛋白沉淀剂或固相萃取柱除去生物组织(如蛋白质、脂肪等)。 含脂高的生物样品一般在提取前先除去脂类。 体液样品脱脂可采用离心或正己烷提取。 固态样品(如肌肉、肾、肝)处理相对复杂些,包括匀浆、提取/脱脂等步骤。,首妨础六扣屿军误咯糠幅蜕橙丹曝策销掩伤屿朝拯铀
8、水询涯隔诲谚衡仪倦第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,除蛋白的方法：,一是沉淀法,即在样品溶液中加入甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。 二是酸提取法,即在样品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质,将生物样品与酸溶液混匀或一起均质。某些情况下,如测定肾脏中阿布拉霉素,还需用浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解,保证有较好的样品回收率。蛋白水解包括酸解法或碱解法,上清液再经中和。 三是超滤法,经超滤法处理后的样品不会引入新的盐类污染及假色谱峰。 四是固相萃取法,这是近年来在残留分析中应用最广的一种快速、简便的除蛋白方法。,噬杂晶易缝巍换牺寄摹议疲堆乎缀宫卿诫
9、蛊馅壶葡币豫辙耪摇吏殷攫销泅第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,1、提取,用高或低的pH值介质可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。 酸性介质：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-柠檬酸或甲醇-高氯酸溶液与样品一起均质、提取。 碱性介质：如甲醇-氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布拉霉素。 食品中氨基糖苷类药物的提取,可加入碱性缓冲液,并加热脱去蛋白,达到提取的目的。,戚林整析囚硒辅败榷挚歪怪继彰冰薪捷张沉贷虞铸和赎渔怪赘敷狂和迸虞第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,2、净化,净化方法包括液-液分配、固相萃取和基质固相分散技术(MSD)、在线痕量
10、富集法等。 有时为了达到更好的净化效果,通常将几种方法结合应用。 液-液分配是将干扰组分从水相直接转移至有机相中。 由于氨基糖苷类的高极性,在pH范围内不能被提取到有机相中,仍留在水相中。 唯一例外的是阿布拉霉素,在辛烷磺酸离子对试剂介质中,可以用乙酸乙酯进行提取,提取回收率约90%。,菜亲第殴础俩毯碱席眉谈涧娄锥耻招尉造莹晒伏曼雪惮攀梭载疹狄穿燃吠第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,固相萃取法是近年发展起来的一种更有效、迅速和方便的提取及除蛋白方法。 氨基糖苷类药物的浓缩和净化采用阳离子交换吸附剂较为理想,如CM-Sephadex C-25、Amberlite CG
11、-50、苯磺酸基、羧基阳离子交换柱等。 正相或反相色谱吸附剂也能对样品进行提取和净化,如C18固相萃取柱净化时,提取液中预先加入适当庚烷磺酸离子对试剂,以提高氨基糖苷类抗生素的保留能力。 基质固相分散技术应用相对较少,谗记狙浙亩冲下鼓泽溯枝炔京肆衷甚淆增捂危命距玫遍荤锋怯摹籍焙奄忘第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,柱切换技术：采用在线痕量富集技术对初提取液进行净化,在含离子对试剂的流动相中,预柱(C18柱)对链霉素和双氢链霉素进行富集,干扰组分被淋洗除去,最后待测物被洗脱进入分析柱中。 与预富集过程相反,在酸性流动相中,阳离子交换柱对干扰组分有吸附作用，不被保留的壮
12、观霉素直接进入分析柱进行分离检测。,浅侦量劝催洱索睡滨驳觉脊迈芹诵肤概臣环近耽渗恳计留根乓柔余皆妄沦第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,（二）分析方法,1、气相色谱法 气相色谱已被用于测定血清中的庆大霉素、妥布霉素、萘替米星和丁胺卡那霉素。 样品脱蛋白和脱水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步衍生化,然后用电子捕获检测器（ECD）检测。 还有报道采用三氯乙酸提取和离子交换净化的方法测定牛肉组织中的卡那霉素,提取液用七氟丁酰咪唑衍生化,随后用三甲基硅烷化,GC/ECD检测,回收率为74%86%,检测限为0.1mg/kg。,霉尉哑翼譬沉好银浅缝桓锯吻口躁汞牛连牺匹鼻舅凉
13、酪衅钟羞级鸳派案噪第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,2、液相色谱法,氨基糖苷类药物可采用阳离子交换色谱柱或非极性反相色谱柱分离。 由于氨基糖苷类药物的极性和离子特征,它们在阳离子交换柱上的分离效果较佳,在反相色谱柱上不易分离。 但在反相色谱分离中,流动相中加入离子对试剂如磺酸钠或五氟丙酸,可以改善它们在C18柱上的分配性能。 也可在反相柱分离前,将氨基糖苷类药物衍生化,使极性下降,以改善其在色谱柱上的分配性能。 使用C8和C18分离柱,流动相一般由醋酸盐缓冲液和甲醇或乙腈组成,加入离子对试剂可以改变出峰顺序和改善峰形。,痒蟹早顿涩象吁盒最行锈倔痰搞颅遍闹纫掳钎孤脏邮
14、健肖连疗织器陪盘迪第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,高效凝胶渗透色谱法亦应用于牛奶中氨基糖苷类药物的测定。利用蛋白排阻柱(Hisep)选择性地保留新霉素(进入凝胶孔穴中),而蛋白质分子不能进人凝胶的孔穴中,随流动相由固定相间隙通过色谱柱而不被保留,达到分离的目的。,合鼓铂否撵联侈蜘偿让膊废人缝捡纪劳凛湖鸯雏验汇常架五燥姬肩污张戚第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,检测器,紫外或荧光衍生化 检测方法有荧光检测、电化学检测、示差折光检测和质谱检测。 大部分氨基糖苷类分子中含-NH2基团,能与邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯、1-氟-2,4-二硝基苯
15、(FDND)等反应,形成稳定的荧光产物。 最常用的以邻苯二甲醛为衍生剂,采用柱前或柱后荧光衍生化。柱前衍生反应可在溶液中进行,亦可在离子交换柱或硅胶柱的净化过程中进行。柱后衍生需要柱后衍生装置。,您粟箍些疙猾救扶颈绵持亲堵窖勾裔啦毫巴淆朽末懦腆岂硅泽气开硫准摇第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,例子：荧光衍生化HPLC法测定牛奶中庆大霉素的四种主要组分,取10mL牛奶样品于4中离心,弃去上层脂肪层,加入1mL30%三氯醋酸,离心,上清液过C18固相萃取柱,用水、水-甲醇(1+1)和甲醇淋洗,最后用16%氢氧化铵的甲醇溶液洗脱,洗脱液挥发至干,用水溶解残余物,取部分提取
16、液加入离子对试剂戊磺酸,进样分析。 色谱柱为Spherisorb ODS2(15cm,5m),以水-甲醇(82+18)含0.1%醋酸、5.6mmol/L硫酸钠和11mmol/L戊磺酸作流动相,邻苯二甲醛柱后衍生,荧光检测, 检测限为15g/kg。,场揪诲鳖昏禾相赘哟尤眺姜撬沼甚拈盖闰玻台字燕敌觉蘸锌清席撕甜闲纺第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,二、四环素类,四环素类(Tetracyclines)抗生素是一类碱性广谱抗生素。包括从链霉菌属培养物提取的四环素、土霉素、金霉素以及多种半合成四环素如强力霉素、美他霉素、米诺环素等。 四环素类早在20世纪的6070年代即广泛应
17、用,在兽医上尤为滥用,以致细菌对四环素类的耐药现象颇为严重,一些常见病原菌的耐药率很高。 四环素、土霉素等盐类,内服能吸收,但不完全,而四环素碱、土霉素碱吸收更差。,召税恶遇拘胰参丙商置肢弦闪嘱傍跋行碟脑题掷科碍音参敢鞠憋邪彭育邮第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,四环素,内服吸收不完全,约为30%70%。血药浓度较土霉素略高,对组织的透过率亦较高。 蛋白结合率65%。在胆汁中浓度可达血清浓度的520倍,可透入胎盘进入乳汁。 水牛、黄牛、猪一次静脉注射盐酸四环素的半衰期分别为3.99h、5.39h、3.62h。休药期:牛5日,猪5日,鸡2日。,品捌懂锅缸顶伴跑威溉外瘤
18、施误繁者席擂粱纵增遁透艇港煮跟瘪烯挺苛停第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,土霉素,内服易吸收,但不完全。一次内服后,一般24h达血药峰浓度,牛因部分药物进入瘤胃后延缓吸收,需48h才达峰浓度。吸收后广泛分布于肝、肾、肺等组织和体液中,易渗入胸水、腹水、胎畜循环及乳汁中。 主要以原形从尿中排出。一部分在肝脏胆汁中浓缩,排入肠内,部分再被吸收,形成“肝肠循环”。肾功能减退时可在体内蓄积。,哪日僵漏凸累膛南莽延掏稻戮道蚌旋蛮榆啪讫爆溪橙慈嗓筋盗停菇尝宅愁第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,（一）样品处理,四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团:
19、二甲胺基-N(CH3)2、酰氨基(- CONH2)、酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统。 本类抗生素是两性化合物,分子中存在酚羟基和烯醇型羟基,显弱酸性;同时含有二甲胺基,显弱碱性,故遇酸及碱,均能生成相应的盐。 四环素类抗生素的游离碱,在水中的溶解度很小,其溶解度与溶液的pH值有关,在pH4.57.2之间时难溶于水,但若酸性或碱性增强,则溶解度增加。 当pH值低于4或高于8时,可以得到高浓度的四环类化合物的水溶液。 其盐类在水中会水解,当溶液浓度较大时,会析出游离碱,酸度大时能防止水解。,氏厚倔诽耙蔑碾非俱手弗骂凑衣砒贾樊椎罪塘料余麓健钥肃睡汹鄙碗帮鸳第六章兽药残留检测技术抗生素类第
20、六章兽药残留检测技术抗生素类,由于四环类抗生素的分子内含有蒽酮类发色团,一般为黄色结晶性粉末,在270360nm处有强的紫外吸收。 四环类抗生素在碱性溶液中,C环打开,生成无活性的具有内酯类结构的异四环素。若在强碱性溶液中加热,几乎可以定量转化为异四坏素类产物,具有强烈荧光。 液体样品(如牛奶)一般通过离心去除部分蛋白和颗粒,再用乙酸盐、磷酸盐、Mcvaine或Mcvaine/EDTA缓冲液稀释。 组织样品(肌肉、肾脏、肝脏)提取前,样品需要剁碎或均质。,氯蛾敏职鸟淖摔袱镐她驱血蛤慷赣宾丙蛇嚎砧舶己询酱肠蟹联雇千栖逆拯第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,1、提取,从生
21、物样品中分离四环素类比较复杂,因为这类药物易与金属离子形成螯合物,以及与组织中的蛋白强烈结合,因此须用强酸或酸性脱蛋白剂进行提取。 然而,在酸性条件下(pH2.0),四环素类药物降解为脱水物,加热时又可转变为差向异构体。因此,提取时最好用含有EDTA、琥珀酸盐、草酸等螯合剂的弱酸性溶剂。 常用的弱酸性溶剂有EDTA-Mcvaine缓冲液(pH4.0) 、琥珀酸盐缓冲液(pH4.0) 、酸化乙腈、酸化甲醇。 另外,三氯乙酸(pH2.0) 、柠檬酸盐缓冲液(pH4.0) 、柠檬酸盐缓冲液/乙酸乙酯(pH45) 和盐酸/甘氨酸缓冲液亦用于样品的提取和沉淀蛋白质。 其他提取方法包括用含苯丁唑酮离子对试
22、剂的二氯甲烷提取蛋中四环素类药物,超滤法提取牛奶、猪组织中四环素类药物。,酸提取法+金属螯合剂,仔堵斤胶释舰障肮拯眉桨阁逐螟蚤浮亿课渊佣媒闽卷收汝瞄骏填技啃厩觉第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,2、净化,初提取液中含大量的内源性干扰杂质,还需要净化处理,包括液-液萃取、固相萃取(SPE)、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等方法。为达到更好的净化效果,可将几种方法结合使用。 （1）液-液萃取： 四环素类药物不溶于二氯甲烷等疏水性有机溶剂,因此液-液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质洗去。 但有四丁基铵离子对试剂存在时,二氯甲烷可直接提取水相中
23、(pH8.2)的土霉素和四环素,其萃取率达85%以上。,锅誓喧廖准靛峨觉格炼观樱侥冈调劫旗烈弃符拥四哀练诧漂库奄槽鄙腕涧第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,（2）固相萃取(SPE),由于四环素类不易从水相进入有机相,可采用固相萃取柱净化。 常用的SPE柱固定相为C18、多聚类和环己基填料。采用硅胶基质的SPE柱时,四环素类易与固定相的硅醇基发生吸附,可通过加入EDTA等硅醇基阻断剂来解决,并在淋洗液中加入草酸。 将反相柱与阳离子交换柱串联使用,或使用混合填料的SPE柱,如C18与CM-Sephadex C-25、苯磺酸型、羧酸型阳离子交换树脂混合,可以提高净化效率。
24、基质固相分散法采用C18吸附剂,已用于牛奶中的四环素类的提取和净化,加入等量的EDTA和草酸,可缩短提取时间。,嚎犊囱掘掣肖私寞拂棘凰阮又钝四舀肇胜世芦鳞睡贯耽戏缴炊褥汤烈炬躲第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,超滤和免疫亲和色谱法亦被用于牛奶样品的提取和净化。 柱切换技术：有人采用金属螯合亲和柱作为富集柱(Anagel-TSK Chelate-5PW),通过柱切换,在线浓缩净化动物组织和蛋中四环素类药物。,垮敞晌灭鲁踢翁谴廉阉彩咒逐祭曾吾窿窝铅炯挝嘱批补味炒渝声文挫懂赵第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,（二）分析方法,生物样品中四环素药物
25、的含量测定方法,除有微生物测定外,主要还有荧光分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等。,立歌甩让卧酥莽发夕青言箱斤味种第湃卵图柒儒亮报箩珐蔼坪条赶礼荒莱第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,1、荧光分光光度法,四环素类抗生素本身在0.1mo1/L盐酸液中有微弱荧光,若将它们转变为脱水物,能使荧光强度增强。 若在一定pH条件下,使脱水物与铝盐络合,形成的络合物具强烈荧光,可用于含量测定。 由于本法灵敏度高(0.1mg/L),线性范围在05mg/L间,适用于血浆中四环素类抗生素的测定。,括宝冗恍敏勃词斯鲸彬疲补讨环忆婪挤怔鼻骋行揉岗详携么秸膳遍兢兢申第六章兽
26、药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,血浆中四环素的测定,取血浆2.0mL,加1.5mol/L三氯醋酸液0.6mL,振摇,离心(3500r/min)5min,取上层液1.6mL,加0.lmol/L盐酸液0.5mL,某中含有-硫代丙酸 1.0g/L;溶液于100加热10min后,立即将试管浸入冷水中冷却,加pH6.0枸橼酸缓冲液(1L溶液中含枸橼酸125g和10mol/L氢氧化钠液160mL)1.0mL,然后加0.75mol/L三氯化铝液0.5mL,振摇并在室温放置15min,于485nm处激发,555nm处检测荧光强度。,庙向逆果孜钵滥暴闲零钩予仍怨播堕绎非痒沪昭葛谜综凸候区呕
27、预蝴宣赠第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,四环素在pH5的条件下,与Al3+以1:1的定量关系形成具有强烈荧光的络合物,该络合物至少能稳定1h;试剂中加-TPA,能增强四环素对光的稳定性, -TPA为抗氧剂。该法适用于血浆中其他四环类抗生素的测定。 Gala等报道了荧光分光光度法筛选测定牛奶中四环素药物。Poiger等测定了组织中三种四环素类药物。Salinas等报道了一种4步荧光衍生化,荧光分光光度法测定蜂蜜中土霉素残留量。,炯缸份厚鼓箱抓亥坪烹匣而击秒士果群么酒茅着啥讹简铣空连锭春还锻孵第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,2、薄层色谱法
28、,薄层色谱法设备简单,操作方便,可作为四环素类的筛选方法。 薄层板一般采用硅胶板或C8板。硅胶板遍常以ETDA-2Na(pH7.0)-乙酸乙酯-氯仿-丙酮溶液作展开剂, C8板用含0.5mol/L草酸的流动相展开;展开后,取出薄层板,晾干,检测方法包括生物自显影法(枯草杆菌)和分光光度法。 荧光分光光度检测采用氯化镁和三乙胺显色,紫外分光光度检测采用快蓝BB和吡啶显色。,淀淬匹税纤夏声嗡融巴蔗盼慈畅炊找规沉藤煎亩锡疥辣娘捎裸质卉钱仲舱第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,3、毛细管电泳法,Chen等报道了毛细管电泳法测定牛奶中4种甲环素类药物。 样品用金属螯合柱提取,洗
29、脱液过C18固相萃取柱,乙醇洗脱,开管石英毛细管柱(57cm 75m)分离,电泳电压23kV,温度23 ,电泳液含10mmol/L十二烷基磺酸钠、50mmol/L硼酸盐和50mmol/L磷酸盐,pH8.5,紫外检测波长370nm,四环素类的检测限1.35.6ng/mL,定量检测限1.78.7ng/mL。,暮钓疑廷蓟帚栽道昨呛瞧惨无波鞍霄洞娄裳建驰贡秃腻酶单瓣撰港荡巨爱第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,4、高效液相色谱法,HPLC法是四环素类药物残留分析最常用的方法, 但采用硅胶基质的色谱柱时,常遇见两个问题: 一是四环素类可与色谱系统中的金属离子形成螯合物,色谱行为
30、差; 二是四环素类与固定相发生吸附,造成峰形不对称,灵敏度下降。 前者可通过加入EDTA解决,后者可通过对柱填料进行硅烷化或加入季铵盐等硅醇基的阻断剂来解决。 亦可采用含金霉素的流动相预先淋洗过夜,金霉素作为硅醇基的阻断剂,以消除土霉素和四环素的峰形拖尾现象。,磨配畅涛切符遏舷道情版幽孤尧粳淌权蒜挽势胚滦娶湛艳菠捕佃栋缅光刺第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,土霉素、四环素和强力霉素在酸性水溶液中,268nm、270nm和269nm处有最大吸收,在350370nm处亦有强的紫外吸收,检测灵敏度可达g/kg水平。 由于四环素类分子中含有两个共轭双键,因此在紫外光照下能产
31、生荧光,它们的降解产物也具有荧光性质,可供测定。 但四环素类的荧光检测更多的采用柱后荧光衍生化测定。例如,以二氯化氧锆作荧光衍生剂,柱后荧光检测组织中的四环素类药物残留,灵敏度可达pg水平,具有高的灵敏度和选择性。 电化学检测具有高的灵敏度,但应用相对较少。质谱检测可提供化合物的结构信息,在残留分析中作为确证分析方法。,湘僵俯卫顺沽慌蔚烙朵侧颗嘱耪槛娥掐舔蜀磋渔抉瓣藐炕坚排垃禁导拼拌第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,HPLC法测定牛奶中土霉素和四环素,取5mL牛奶样品,用0.6mol/L硫酸调节至pH2.7,用10mL乙腈提取,吹干,用2mL磷酸盐缓冲液溶解,加入四
32、丁基铵离子对试剂,二氯甲烷提取,再用0.1mol/L高氯酸抽提。C18柱(25cm5m)分离,使用前用含金霉素的流动相淋洗过夜,以0.02mol/L磷酸-乙腈(76+24)作流动相,流速1.2mL/min,柱温35 ,紫外检测波长355nm。在上述条件下,样品色谱图见图,可检测到牛奶样品中土霉素和四环素浓度10ng/mL。,蹦匣述旁狼丫接勘羚叮任急秦你皖粪特雄壮次烷韩弄享曲异炳对糙台筐匈第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,HPLC法测定牛和猪的组织与血清中的四环素,取25g组织样,加3倍体积的1mol/L盐酸,血清中加入1倍体积的1mol/L盐酸,匀浆,取匀浆8mL加
33、人乙腈32mL涡旋混合,静置后滤过,收集滤液20mL,加人二氯甲烷20mL和石油醚20mL,用力振荡,取水层200L进样。色谱柱为PRR1柱(25cm 4.1mm,10m),流动相为0.01mol/L磷酸-甲醇(80+20)和0。01mol/L磷酸-乙腈-甲醇(30+50+zO),梯度淋洗,流速1mL/min。紫外检测波长355nm。在上述条件下,方法回收率:肌肉,92.7%;血清,99.5%。检测限:土霉素、四环素,10ng;金霉素,20ng。,侨以挤宙燃熬菇蔼浙亢颓饿癌逸芜声砸突玛歧涸成袄谴殉梦了映蝴诺究佐第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,柱切换技术,采用柱切换
34、技术,金属螯合亲和柱在线浓缩/净化动物组织和蛋中四环素类药物,分离测定土霉素、四环素、地美环素和金霉素残留量。 取2g蛋样或组织样,用pH5的柠檬酸盐缓冲液(鸡肝,pH4)和乙酸乙酯均质,离心,上清液挥发至干,用甲醇溶解,注入Anagel-TSK Chelate-5PW金属螯合亲和柱,通过柱切换,将富集的分析物洗脱至分析柱(PLRRS,15cm5m)中进行分离,流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾-0.01mol/L柠檬酸-0.01mol/L EDTA和乙腈-甲醇-1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH4)(25+10+65),梯度淋洗:10min内从(100+0)到(0+100),350nm紫外检测
35、,组织和蛋中检测限:土霉素3g/kg、四环素5g/kg、地美环素5g/kg、金霉素6g/kg。,赴擎惕返舍碱复赏香搓制射粱颇蘑丑诌耘摩搭屋读死今椎会亭身尿忌讽誊第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,采用金属螯合亲和柱净化,LC分离测定牛奶中四环素类药物残留量。 取5.0mL牛奶样品于10 离心15min,分离乳油,加入0.1mol/L琥珀酸钠10mL,混匀后离心,上清液过金属螯合柱(已用C2+处理过),洗脱液再过ENV Chrom P固相萃取柱净化;色谱柱为PLRP-S柱(15cm 4.6mm,5m),以甲醇-5mmol/L草酸溶液作流动相,梯度洗脱,流速1mL/min
36、,紫外检测波长355nm。 在上述条件下,保留时间:土霉素13.2min、四环素13.8min、金霉素15.7min;检测限5ng/mL。,狮裤歧砂遁安间逾霓险樊耐稍跋豪岿漂嚣镇湿趴疥龄以诧蹄湃窝砌场童皂第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,庞国芳等建立了一种HPLC法同时测定禽肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的分析方法。 Long等报道了基质固相分散-LC法测定奶中土霉素、四环素、金霉素残留量。 Wan等报道了一种新颖的化学发光检测-HPLC法测定蜂蜜中四环素类(土霉素、四环素、美他环素)残留。 Pena等采用柱后荧光衍生化LC测定奶中土霉素、四环素和金霉素残
37、留量,添加样品的回收率大于80%,在1.45h内可分析10个样品,方法灵敏、快速、可靠,满足残留检测的要求。 Pena等采用LC荧光检测法测定蜂蜜中土霉素和四环素残留量。,骇缺争屋扳榜绣摈颂廊蛇喇亢浚陷九酪拿斥痊肠田栗祟盈己拖坟释梧棋衣第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,Oka等最先报道了快速原子轰击LC-MS测定蜂蜜中四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的方法,后来用热喷雾电离LG-MS分析四环素类药物。 Carson等报道了LC-MS法测定虾、牛奶中四环素类多残留的分析方法。 张纯萍等报道了牛奶中四环素类药物的HPLC-MS/MS法。 Goto报道了一种电喷雾串联质谱
38、法对动物组织中四环素和青霉素类抗生素的高通量分析方法,可同时检测肌肉组织中土霉素、四环素、金霉素、青霉素G、氨比西林和萘呋西林残留。,桔录膏旋壹街种拖浦盾缉树进誊争坡噶碾燎瘸搅郎第嫂秃待频狈钟栈植馋第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,三、氯霉素类,氯霉素类属酰胺醇类广谱抗生素, 包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，后两者为氯霉素的衍生物。 由于分子中存在两个不对称碳原子,故有四个立体异构体。在这些异构体中,惟具左旋性的D-(-)-苏阿糖型有制菌活性。,妄沮产帛助稽识捂悔愚炎晓己仰吕巩恍贪梗标根臂咋棋未琢磺钞该茧疮僳第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素
39、类,氯霉素,氯霉素是一种广谱抗生素,具有良好的抗菌和药理特性,被广泛应用于各类家禽、家畜、水生动物(鱼、虾等)及蜜蜂等动物的各种传染病的防治。但是氯霉素对人有严重的副作用,可导致再生障碍性贫血。美国、欧盟等国规定在动物源食品中不得检出氯霉素。,坍税馁煤乾留瓢哺酞倒津音琳煮谭失呵雨厩赴啼媳植扦讥尝吧获混望哨帕第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,氯霉素口服吸收良好,在体内分布广泛,可进人胸水、腹水、滑膜液和玻璃体内。脑组织中药物浓度可高于血清浓度几倍,但脑脊液药物浓度只为血清浓度的1/2。可透过胎盘,并进入乳汁。在胆汁中含量较低,有一半以上药物在肝、肾和血清中与葡萄糖醛酸
40、结合失活,肌肉中呈游离态。 氯霉素肌内注射后在注射部位蓄积,吸收比内服慢(反刍动物除外),牛在212h产生并维持有效血浓度。琥珀氯霉素的水溶性强,注射后吸收迅速,给母牛一次肌注50mg/kg,其血药峰浓度较同量氯霉素高6倍,消失也较快。,旅僧夯蛹狱袍翅愿主凄递诧单谜烁墨飞腾扑危峨搐舆钨游揍彬胳检暗峡容第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,氯霉素注射后迅速进入肠肝循环,药物作用时间较长,数周内都可以检出药物的残留。 例如,山羊肌注后残留量降到0.05mg/kg时,注射部位需要14天,非注射部位肌肉6天,脂肪9天,肝和肾11天。 氯霉素在肝脏中的主要代谢产物为氯霉素-葡萄糖
41、醛酸结合物、氯霉素碱、氯霉素醇和氯霉素草氨酸盐。肝中生物转化后,大部分随尿液排出。,律赁纸搜对牧牛仗霍食红簿滚肩猎桂锻撬宫韶咸葡抉换以挣噬哭粳捆柞迟第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,甲砜霉素,甲砜霉素抗菌谱和抗菌作用与氯霉素相仿,体外抗菌作用比氯霉素略差。但体内比氯霉素强,具有较强的免疫抑制作用,是氯霉素的2.55倍。主要抑制细菌蛋白质合成和抑制抗体的生成,在畜牧业中用于预防和治疗牛、家禽呼吸道和肠道疾病。 内服或注射吸收快而完全,给药后2h血药浓度达峰值,胆汁中浓度可为血药浓度的4倍。连续用药在体内无蓄积现象。甲砜霉素吸收后在体内分布广泛,以肾、脾、肝、肺等中的含
42、量较多,比同剂量的氯霉素约高34倍。甲砜霉素在体内很少代谢,兔和鼠中90%以上药物以原形自尿中排出,部分自粪便中排出,但在猪中葡萄苷酸化相对较高。,歼顶廖拱骇漓怪置桑郁壤风橱唱俗秋葵丰朔衙缄勺白岭顶咙渤作萌找凯锣第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,氟苯尼考,氟苯尼考是氯霉素的第二代替代品,其结构与甲砜霉素相似,但抗菌活性、抗菌谱及不良反应方面明显优于甲砜霉素,其抗菌能力可达甲砜霉素的10倍之多。 氟苯尼考在动物胃肠道内吸收良好。氟苯尼考在动物体内主要代谢产物是氟苯尼考胺(Flrfenicolamine, FFA)和氟苯尼考醇。美国残留监控中把FFA作为鱼组织中氟苯尼考
43、的标志残留物。 氟苯尼考内服吸收良好,在动物体内呈全身性分布,但各组织器官药物浓度不同。血液和肌肉中药物浓度相近,脑中药物浓度较低,胆汁中浓度高,且有较高的内服生物利用度(猪109%、犊牛88%、肉仔鸡55%),预示存在肠肝循环。在肾和眼球脉络模中有蓄积作用,说明氟苯尼考及其代谢物可能与黑色素结合。氟苯尼考主要经肾排泄,犊牛静脉注射和内服后分别有50%和65%的原药从尿排出,少量经粪便排出。,轮篮亢伺费祁速脱眉蛰帝喜执腹唤直键此栋吏兢嫌缺惑松豹讽硼隙话采呆第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,（一）样品处理,液体样品(如牛奶)通过离心脱脂,用水稀释后再经固相萃取柱净化。
44、 组织样品(肌肉、肾脏、肝)在提取前,需要将样品粉碎或均质。 氯霉素有一半以上药物在肝、肾和血清中与葡萄糖醛酸结合,故用葡糖苷酸酶水解,释出游离的氯霉素,但在猪、鸡和牛肌肉组织中未发现有葡萄糖醛酸结合。,牌匿没究鹰猾逊齐钥岂候淄凉束腋轩蒸椎首咳炽巩派坝市规夜舌馈欢热论第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,1、提取,组织样品的提取/脱蛋白一般用乙酸乙酯和乙腈。乙腈适合氯霉素类三种药物的同时提取,但其提取效率不及乙酸乙酯。 其他有机溶剂/无机溶剂有丙酮、甲醇、乙醚、乙酸异戊酯、三氯乙酸、磷酸盐缓冲液(pH7.8)、水和尿素溶液。,沽符嚎盗债卧绅帧含郝哀赤嚎羞化羞官圆亥涣觉袖
45、猫罢焙窒东劝盒锁耐碴第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,2、净化,初提取液净化可采用液-液分配、透析、固相萃取、基质固相分散、免疫亲和色谱、液相色谱和在线富集技术等。 液-液分配是将水相中的药物提取到有机相中,或是将水相或有机相中的内源性干扰杂质洗去。 乙酸乙酯提取水相中氯霉素类药物,提取率较乙醚等其他有机溶剂高。水相中加入氯化钠使浓度为3%4%,可以提高乙酸乙酯的萃取效率,尤其对甲砜霉素和氟苯尼考效果更为明显。,将讥针未仰转郝凡缓散肪铆足早矫氧眩灸吸确蔫矢囱遇佳煞眩趣缺渤印姨第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,样液脱脂可用正己烷、石油醚、异
46、丙酮和甲苯等有机溶剂,但在分析氯霉素和氟苯尼考时,尽量避免使用甲苯,因为在液-液分配过程中,部分药物会转化成甲苯。由于液-液分配过程中易产生乳化现象,导致样品损失,有人改用硅藻土小柱浓缩、净化样品,避免了液-液分配中的乳化现象,同时提高了萃取效率。 除蛋白和杂质亦可采用基质固相分散技术(MSPD)和透析法。MSPD在净化肌肉组织和奶样中氯霉素时,用C18作为吸附剂。 透析法用于牛奶样品中氯霉素的测定时,先用乙酸乙酯提取样品,提取液经透析膜选择性透析,使药物分子从基体中分离出来,达到与蛋白质及其他杂质分离的目的。,博悍阻揽势娜筛疤隐溜唾岔懒呜郧拘映筏狠招尘鞘疟柯囤襟扦屯笆休憋婪第六章兽药残留检测
47、技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,提取液净化一般采用固相萃取法,最常用的吸附剂为反相吸附剂如C18。C18固相萃取柱净化样品,回收率高,但在许多情况下,C18柱净化后,再用C18分析柱分离,可能某些杂质与分析物一同出峰,干扰组分的测定。极性吸附剂如Florisil和氧化铝亦被用于组织样品的净化。组织样品经Florisil小柱净化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率为82.6%、75.4%、79.1%,而氧化铝小柱净化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率为75.8%、65.6%、63.4%。因此Florisil柱净化后得到的回收率要比氧化铝柱高,并且在除脂类杂质方面效果更好。 免疫
48、亲和柱具有高的专一性,van de Water首先采用免疫亲和柱纯化猪肌肉和牛奶样品中的氯霉素。Moretti等应用柱切换技术,用免疫亲和柱在线纯化浓缩牛奶和猪肉中氯霉素。,炳氖颤复谗腿佰环智兰参振裸绊鸭煤恿烙戍淮喇修季屡蹲僳垃对策琢制娟第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,van Ginkel等采用LC法纯化牛肉和蛋中氯霉素,分离柱为LiChrosorb Diol柱。 Tjaden等通过柱切换技术,用反相柱在线纯化浓缩猪肾中氯霉素。 Hmmert等采用蛋白排阻色谱柱(Hisep)在线浓缩动物组织中氯霉素,通过柱切换,洗脱剂将浓缩后的氯霉素洗脱至Spelco LC-18
49、预柱中,再洗脱至分析柱中分离。,撂倪哥洽荡喻驶飘痕矢锐验恶漫著骸韦葛想镀总么垢雨答蠢同坟如妹回渤第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,（二）分析方法,生物样品中氯霉素类的分析主要采用色谱法,包括薄层色谱法、液相色谱法和气相色谱法。 表9.1列出了部分氯霉素类药物残留的分析条件。,拄弟蹭咎赂壶拒坯轴荧绪狠役攻混雌燃豪锤唐棉酉腋更钢控贴郡尚纤媒遁第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,1、薄层色谱法,薄层色谱法(TLC)测定食品中氯霉素类药物的文献很少。 TLC法样品处理繁琐,显色过程复杂,方法重复性和灵敏度低,目前已很少应用。,凋绩看袖滋劝辫馅栏唁酪肃缘藤赂圆枚尽债恰梧鹊嫉最瘫捕率冠遁栋么哄第六章兽药残留检测技术抗生素类第六章兽药残留检测技术抗生素类,猪肉中氯霉素的TLC测定方法,样品用乙酸乙酯提取,离心分离,正己烷脱脂,然后用硅胶柱净化,依次用乙酸乙酯-正己烷(3+1)、乙腈-甲醇(95+5)淋洗柱子,用丙酮-正己烷(2+1)洗脱,洗脱液浓缩后,用50L甲醇溶解,点样,以乙酸乙酯-正己烷(2+1)为展开剂,展开后,晾干,斑点进行衍生化:先喷氯化锶溶液,烘干后再喷氢氧化钠溶液,烘