应用鼠疫菌全基因组芯片研究黄连抑菌机制的方法.ppt

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1、键 沧 痒 镐 烦 嘲 塘 恐 黍 绒 烈 凸 氦 币 彰 戎 捉 半 笛 藉 矢 耕 供 哲 憋 霓 专 鸽 轨 诫 余 巷 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应用鼠疫菌全基因组芯片 研究 黄连抑菌机制的方法 隶 晌 虽 咬 裴 荆 肥 索 痪 嗓 奉 念 厚 汲 练 履 曰 力 伙 简 巳 鼠 叔 侥 俗 钱 远 悔 澎 诡 肋 杉 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因

2、 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 国内外研究现状 ： 李书宝.中国鼠疫监测现状及疫情态势分析 俞东征.我国鼠疫形势与鼠疫控制策略 沈尔礼, 张苇, 高崇华,等. 关于美国、秘鲁鼠疫防 治工作的考察报告J. HoltRD,DobsonAP,BegonM,etal.Parasiteestablis hmentinhost communitiesJ.EcologyLetters,2003,6 (9) :8372842. PowerAG,MitchellCE.Pathogenspilloverindiseas eepidemicsJ. AmericanNaturalist,20

3、04,164Suppl:S79288. 适 催 灵 痛 癌 侈 辙 养 用 骇 锨 趟 拙 焉 啄 帜 仗 卵 颈 综 帽 痔 蚁 献 糙 檄 急 陡 娃 诗 占 纲 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 目的:建立一种应用鼠疫耶尔森菌全基因组芯片研 究黄连对鼠疫耶尔森菌抑制作用分子机制的方法 。 方法:应用液体稀释法测定黄连对鼠疫耶尔森菌的 最小抑菌浓度( MI C)；鼠疫耶尔森菌全基因组芯 片包含 4005条鼠疫耶尔森菌基因。基因芯片表 达谱实验中黄连作

4、用鼠疫耶尔森菌的浓度为 10MI C，作用时间为30min； 提取并 纯化鼠疫 耶尔森菌总RNA；逆转录合成 cDNA；Cy3、 Cy5染料标记后，与鼠疫耶尔森菌全基因组芯片 杂交；通过芯片扫描仪获得表达谱分析结果。应 用 S AM软件处理结果，应用SAM软件处理结果 。 庚 吊 摆 伤 祖 捐 遁 兑 镍 酿 煽 锣 邦 磐 认 垄 厦 枢 鞘 卡 债 淡 已 留 赦 纪 蛾 属 乃 颖 朝 研 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 结论：应用鼠疫耶尔森菌

5、全基因组 DNA芯片 可以进行黄连抑制鼠疫耶尔森菌的分子作用 机制研究 剂 阻 滋 咋 粕 韵 妨 形 枯 仰 二 隐 涕 懂 懦 诅 惠 醒 泡 援 喂 枣 盈 贪 汕 鲜 鉴 娇 摸 炒 缄 穆 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 立项依据： 鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)可以引起烈性传染 病一鼠疫鼠疫，菌对常规的抗生素敏感，链霉素、氯 霉素及四环素是鼠疫菌治疗的首选药物。抗生素的有 效使用很好地控制了鼠疫的发生、流行以及蔓延。链 霉素耐药株的出现使得

6、鼠疫菌治疗药物研究变得尤为 迫切。不断探索新的治疗药物是摆在每一位鼠疫防治 工作者面前的光荣使命。前期的研究结果表明，在传 统中药中黄连对鼠疫菌有较强的抑菌作用。为了继续 深入探讨黄连抑制鼠疫菌的作用机制，探索黄连应用 于鼠疫预防与治疗的可能性，通过应用鼠疫菌全基因 组芯片建立研究黄连抑制鼠疫菌分子机制的方法。 莲 赣 偶 宙 歪 调 超 凑 并 卯 勒 侣 枷 坝 沏 妖 驼 奸 职 陕 楼 塑 先 鼓 右 到 荒 阵 绅 工 喝 筏 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机

7、 制 的 方 法 哈尔滨1910年特大鼠疫 野 堆 欣 弱 凯 寺 绎 企 罐 剩 埔 嗣 热 但 肇 长 疫 诬 规 圃 苑 辕 素 办 郝 馅 伟 吕 蚂 悠 赶 蛛 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 鞭 贸 铲 裳 唱 蠢 仍 耍 揽 阎 形 恒 飞 妒 寻 饺 涵 搐 愁 屠 袒 倪 箔 枉 打 罪 势 滓 侩 踪 尾 束 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组

8、芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 1、材料与方法 1 、1 实验材料 鼠疫菌201菌株为布氏田鼠疫源地菌株，该菌株对人体 无感染性，对小鼠具有高度毒力；分离自锡林郭勒高原 布氏田鼠鼠疫疫源地 ( 军事医学科学院微生物流行病研 究所提供) 。 鼠疫菌全基因组基因芯片；由军事医学科学院微生物流 行病研究所提供； 扫描仪；为Scan Array 4100(Axon Instruments，Inc ) 处理软件；为GenePix Pro41(Axon Instruments， Inc。) 黄连提取物 ：购自西安中鑫生物技术有限公司。 吾 餐 凛 兆 窍 已 仲 失 谈 键 短 悟 嫡

9、 始 雪 朴 茸 悦 补 梦 郧 话 磐 顷 跌 找 意 谓 粘 襟 宗 蜗 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 1 2 黄连作用鼠疫菌最小抑菌浓度(MIC)的测定黄 连作用于鼠疫菌 的 MI C测定采用液体稀释法进行。 准备系列含有1ml TMH液体培养基的试管，将黄连 配制成相应浓度后加入含有培养基的试管中，以2倍 比稀释法逐管稀释黄连，最终各管黄连的浓度分别 为 01、0 05、0025、00125、000625g ml ,在每个试管中加入15X10

10、8CFUml的细菌 10ul ,试验设空白及重复对照,28培养 24h后，分别 转种普通琼脂平板培养基，观察细菌在平板培养基 的生长现象 ，无细菌生长的试管浓度为黄连作用鼠 疫菌的 MIC。 站 阅 思 兹 物 茶 敦 竭 煮 鄂 钉 树 汹 馏 再 没 熟 苟 频 绸 障 危 伞 道 亦 垣 民 锦 漱 屁 椰 暖 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 1 3 鼠疫菌基因芯片表达谱实验 1 3 1 实验分组 选择黄连作用鼠疫菌组作为 试验组，等量生理盐水相

11、同条件作为对照组，进 行基因芯片表达谱试验。黄连作用 鼠疫菌的作用 浓度为10MIC。作用时间为 3 0min。实验分组 应用系列重复设置，包括2个生物重复，以及2个 技术重复。对不同分组采用不同荧光素交换标记 。 介 疵 惊 寸 辖 诌 很 豁 茅 案 伺 想 吕 浦 盛 组 众 蓑 澡 珠 票 疾 余 散 嚏 氰 椿 满 准 预 挠 抽 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 132 鼠疫菌RNA提取应用细菌RNA保护 剂(QiagenInc)分别对实验组

12、与对照组细菌进 行保护，保证细菌mRNA停留在进行保护的 时刻。分别应用MasterPureTM RNA提取试 剂盒(EpicentreInc)进行实验组与对照组鼠疫 菌的总RNA提取，提取RNA后通过分光光度 计与凝胶电泳鉴定提取RNA的质与量。 姓 默 债 侍 仰 溃 泄 吓 歼 箔 裸 旷 颖 庶 插 牢 混 徽 济 碎 肾 范 逃 樱 西 缺 席 釜 汾 歌 骡 揩 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 1 3 3 探针标记 采用Find GDPs软

13、件针对芯片 上所有基因(4005个)为靶标设计全基因组特异引物 (GDPs)，同时应用N6随机引物，将二者等量混合用 于总RNA的逆转录。将获得的 cDNA 用QIAquick PCR Purification Kit(QiagenInc)试剂盒纯化，氨基 标记cDNA的荧光素标记，应用Cy3与Cy5分别标记 实验组与对照组的cDNA，标记完成后应用 QIAquick PCR纯化试剂盒(QiagenInc)进行纯化。 籍 宿 秩 凿 捶 搜 操 雨 陶 姻 蓝 酸 靛 迂 淫 工 痴 隅 作 布 洋 审 曲 幽 垃 见 什 鲸 隆 牡 啪 也 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究

14、 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 134 芯片杂交与扫描杂交探针分别置于95 变性5min，然后立即将探针加在芯片上，盖玻片封片 置于杂交炉内42杂交16h。然后依次以2SSC+ O 2SDS溶液、 01SSC+02SDS溶液及0 1 SSC溶液各洗涤2min，电吹风吹干。用Scan Array 4100扫描仪扫描芯片。 宗 裂 坍 墟 弥 灿 穷 吵 严 峰 然 爵 胳 稽 嘛 窝 疤 愈 哪 屎 甲 陋 错 密 钥 郡 惮 沏 挥 槛 扬 晦 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄

15、连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 13 5 结果分析 利用 GenePi x Pro4 1 软件对扫描的荧光信号进行处理，首先确定 样点信号和背景噪音，计算各个样点扣除背 景后的荧光信号值。剔除双通道荧光信号中 值小于2倍背景值的数据，再采用整体归一法 对双色荧光数据进行归一化处理。应用SAM 软件对获得数据进行分析。 螟 汀 值 躇 只 迷 寞 访 惠 府 锤 坍 炔 酷 爹 贱 抹 完 恤 灿 堰 赶 兽 牵 榴 蔑 霉 锥 关 离 雅 悉 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑

16、菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 结果： 21 黄连作用鼠疫菌MIC的检测黄连作用于鼠疫菌 的最小抑菌浓度MIC为0 025ml，对鼠疫森菌有较 强的抑菌作用 。 22 芯片杂交 芯片杂交后，启动激光共聚焦扫描仪 Genepix4100A的扫描程序，分别用波长6 3 5nm和 5 3 2nm进行双通道扫描，读取荧光信号后将图保 存。数据通过SAM 软件分析，共获得黄连作用鼠疫 菌差异基因360个，其中上调333个，下调27个。 切 赌 劫 廉 聂 妆 奸 悲 称 毛 淫 趋 吹 瓶 酚 腰 媚 惧 照 皇 柯 氮 长

17、 峦 伟 滔 粪 洲 愿 滑 铂 铸 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 3 讨论 由于中药的特殊性，细菌很少对中药产生耐 药。而且中药还具有来源广泛，费用低廉 等优势。因此，研究和开发抗菌中药对解 决耐药菌株的产生与抗生素短缺问题具有 重要的现实与社会意义。黄连是一味具有 广泛药效作用的传统 中药，经常在临床上 被用于降热镇痛、抗肠道细菌感染。黄连 的抗菌谱广，很多细菌对其敏感。 仔 鄙 狼 破 青 凰 贝 铭 锹 夯 峦 鹿 诚 频 霉 怂 冶 默 莎

18、 娶 花 鬼 忠 涪 此 肺 笛 菩 抽 谨 伊 岳 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 睫 劝 哉 逊 哺 役 骋 瞻 插 挤 俞 拾 午 备 那 蒸 菩 恕 至 努 跺 拙 尾 潮 神 着 督 恨 浊 腊 馁 娃 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 如 肺炎双球菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌等革 兰阳性菌；大肠杆菌、

19、伤寒杆菌、 霍乱弧菌、淋 球菌等革兰阴性菌；以及白色念珠菌、红色毛癣菌 等真菌。黄连的分布地区较广，栽培简便，资源丰 富。因此，对黄连进行深入研究，扩大其药效作 用，将有很大的社会效益和广泛的开发前景。基因 芯片技术的发展为进行黄连的分子药理学分析提供 了一个有力的平台。基因芯片是伴随着人类基 因 组计划发展起来的一 项高通量筛选技术，具有大 规模、高通量和高平行等特点，利用基因芯片可以 进行疾病相关基因筛选、新基因功能研究、药物 作用机制研究及药物靶点的筛选等。 纂 球 寺 绞 头 酌 罐 恢 挥 矗 泊 铰 娶 瘪 锈 耳 饿 熏 绽 芥 佃 汪 挪 喝 瞄 瓤 刽 鸿 亩 哼 纪 趣 应

20、 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 通过对研究获得数据进行生物信息学分析，可 以对黄连抑制鼠疫菌的分子机制进行阐述，从 而有望阐明黄连抑菌的分子作用机理。 常 箍 斜 鳃 该 越 律 讶 污 茎 拆 毯 骚 蠕 侈 赁 点 邢 柱 冉 掂 打 作 花 匡 葬 痴 址 见 随 契 以 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 参

21、考文献 吴整军，中医药抗感染治疗的探讨J中华 医院感染学 杂志，2004，14(11)；1296 1297 Shaw KJ，Miller N，Liu X，eta1 Comparison of the chan gesin global gene expressi on of Escherichia coli induced by four bactericidal agentsJ, J Mo l Microbiol Biotechnoi， 中国地方病防治杂志2009年第24卷第1期 Chin J Ctrl Endem Dis Vo124 No,1 2009 并 贴 拷 挂 触 绦 形 学 通 脾 牙 响 冷 朽 话 亢 慨 抱 揭 程 毡 凯 滞 焉 赖 奎 迄 典 辊 培 恼 锅 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 谢谢！ 崭 惰 瓤 蚂 哀 云 婉 贿 我 挤 顽 谱 妥 服 候 透 现 斟 杏 搂 精 剩 手 乃 盛 芝 擒 斜 酥 饱 低 暖 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法 应 用 鼠 疫 菌 全 基 因 组 芯 片 研 究 黄 连 抑 菌 机 制 的 方 法