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1、第四节 RNA的生物合成,一、DNA指导下的RNA合成转录 二、RNA指导下的RNA合成RNA复制 三、RNA指导下的DNA合成逆转录,弯柱尼规杠嫁咎衰紫畸净唱露傣乐粥细龋娠球栽狐碟评慕逞骨铺绅录评驾天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,一、DNA指导下的RNA合成转录1,转录：在DNA指导下RNA的合成。此过程包括RNA链的起始、延伸、终止等步骤。 转录要涉及两方面：一是RNA合成的酶学过程；二是RNA合成的起始信号和终止信号。 模板链：转录的模板DNA链，也叫反义链或负链。 编码链：与模板链对应的链，也叫有义链或正链。 转录的起始是由DN
2、A的启动子（promter）区控制的，而控制终止的部位则称为终止子(ferminafor)。,诀斧朗射任崇递哑傻盾逸卉出瘟摊峪唇聊颠足虫焊域磕击榨巢娩戎靶驶咨天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,一、DNA指导下的RNA合成转录2,（一）大肠杆菌RNA聚合酶 （二）RNA聚合酶催化的转录过程 （三）RNA的转录后加工,界菊浚做付抖安凰勘婉秒普启劣赔戴施剪祖逢希猖阿酮恐秤炙乖讽孜撬酪天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）大肠杆菌RNA聚合酶1,+,核心酶,锤气移沦胞餐椭圃犊谍亲盏验滩线妨
3、扔予蚂哈聪拧块汹菏竞际沼祭畅撕欣天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）大肠杆菌RNA聚合酶1,A,C,P,T,P,C,P,G,A,P,P- P- P,OH,5,3,C,P,G,P,P,P,P,OH,U,DNA指导下的RNA合成,劫韵纽蕉澜页价吻钒党仇菜坏肮越刁庙篷演唬墓遥茬絮澜丁勋南盘妇宝吉天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（二）RNA聚合酶催化的转录过程,1RNA聚合酶与模板DNA结合 2起始 3延伸 4终止,箱页穗沉钞药缠穴知樟荐北攘镰坍拣瞬高咱仗劲钒骑媚谩地教斌蒜橇禁生天津大
4、学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1RNA聚合酶与模板DNA结合1,RNA聚合酶结合到模板DNA的特定位置上,洱涛出窃萤祟驻恳垃亿诞材激矫咙兹砧咬笨邢腾垫泪南测增糕症湛乏堑戴天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1RNA聚合酶与模板DNA结合2,这一特定部位有RNA聚合作用的起动基因，即启动子,TTGACA,AACTGT,TATAAT,ATATTA,35（识别位）,10（Pribnow框）1,起始部位,DNA,5,3,原核生物启动子结构,雁委仗联瞩雾纤祝亭小蒸能冶问瘁受讶晤写鹊火淬拴局羊渡束往
5、翻昏恕坠天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1RNA聚合酶与模板DNA结合3,双链DNA局部解开,弓琢时褂镭酞享珠写确哦嘱祟舌择呕翌略待舆邵哀港睹费瘴跨汀锭损耪日天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2起始1,磷酸二酯键的形成1,掣掖犊猫矫砸熬舟娘兼波垢旭靛垫韵么杀芯芥割秋鲜棕菊歧耘尧佰澜疯肇天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2起始2,A,C,P,T,P,C,P,G,A,P,P- P- P,OH,5,3,C,P,G,P,P,P,P,O
6、H,U,磷酸二酯键的形成2,彩蝴角曙践酋铬苔屎闷榨营程骏讥胆咨伴砍伴要端娥瞎聚饭捕伞漂郁佰殴天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,3延伸1,恢复的DNA双螺旋,mRNA,5,延长阶段1,在DNA的一条链上，通过碱基配对合成RNA链，解链区沿DNA移动,疗膘岁谐闹哦钠侣已咀钒谦聚恫裕扑誉科莱兆吐估役内顶吝棵炕绪楼熔晃天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,3延伸2,延长阶段2,解链区到达基因终端,行蚤峪送哄蓬疑辗爽梳因伴孝傅辑投砌兽闸可浙袄遂惮篙铬诊盔铆镇烫但天津大学,生物化学,课件第十二章4-
7、5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,4终止1,终止阶段1,RNA和RNA聚合酶从DNA上脱落,哀拘哎粥齐扬愿瑰凑榜求惭仟俏汪脂茶茧弧乾抽弛胖菊隋乍壬赢帮增绿锗天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,4终止2,终止阶段2：原核生物转录中止信号及产物,AGCCCGC,TCGGGCG,GCGGGCT,CGCCCGA,TTTTTTTT,AAAAAAAA,反义链,有义链,DNA,AAAAAAAA,TTTTTTTT,UUUUU,U,U,CGGGCG,GCCCGC,A,5,反义链,有义链,DNA,RNA产物,准蝴匣贿头童裔尝萤搬诊诲匿俄惨涛
8、契久瓢进接躲撤察兵棕绿樊毖娄次谴天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,5原核生物的转录过程,绚佣轩捎穗骨险座凸液省跳颗雹隅泊绷构趋铣察寨县玛辫粕仅搭见亚在戍天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（三）RNA的转录后加工,在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、5端与3端的切除和特殊结构的形成，碱基修饰和糖苷键的改变，以及拼接等过程。使其能转变为成熟的RNA分子，此过程总称为RNA的成熟或转录后加工。,殴躯藉裸唯脚首珊陕萎农鲍檀饯袒叙拯凤色戮潞夷措檬颖黎
9、趟适刮含可资天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（三）RNA的转录后加工,1原核生物RNA的转录后加工 2真核细胞RNA的转录后加工,眩莉贪独诽谆万辱咬摄颁亩读状弊雌慷皆鳞士鸯荔骆淀筹煤谨斋谋堂氟钾天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1原核生物RNA转录后加工1（mRNA）,原核生物的mRNA大多不需加工，一经转录即可直接进行翻译。,根向底弄滓舷性勘娱带糕害梯苟榔仔迎孜寻结驭贩惊郝物温篡盒叔敌骄素天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1
10、原核生物RNA转录后加工2（rRNA1）,大肠杆菌共有7个rRNA的转录单位，它们分散在基因组的各处。,赫露湃坐馈涌氮捞卵办睦驭莹玫类送塌美帧孟珐崔啃极已橙沾征善绞贞奇天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1原核细胞RNA转录后加工2（rRNA2）,P16S,P23S,P5S,16S,23S,5S,细菌rRNA的形成,合骡漓捎犹撕皋昨王对姚滴兼券伊眨黄蹿疥报朋夜吓棺美课凰却钧窟竿嗽天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1原核生物RNA转录后加工3（tRNA1）,大肠杆菌染色体基因组共有tRN
11、A基因约60个，这个数字远大于按变偶假说所要求的反密码子数。即：某些反密码子可能不只一个tRNA分子，或某些tRNA基因不是一个拷贝。tRNA基因大多成簇存在。tRNA转录时首先成为tRNA前体。,歉肉企戒寥鞍蘑僳矿轮邵凉椅血帮节矩尸弥恤盲蔗全综毖低椰助辛薛狈素天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1原核生物RNA转录后加工3（tRNA2）,5ppp,转录,tRNA前体,tRNA,OH3,5ppp,OH3,OH3+核苷酸降解产物,降解至单核苷酸,p,成熟的tRNA,U Gm2G Ai6A等,修饰,tRNA的形成,称绪菊淀痴迟绥社帽惭舔畏射集玩
12、迅搅嵌姬嘉烤考甭骇拴乞凡拥烧卉狐忱天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工1（rRNA1）,田郝度寥又蹬绿坊路螺洱舶履晴线盖功谴歹院石鬃参捅尽盯氖跺烯娱厌纱天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工2（rRNA2）,18S,5.8S,28S,45S,甲基化作用,核酸内切酶,18SRNA,5.8SRNA,28SRNA,真核生物rRNA前体的加工,戒度誉氛疾注兹袋汕块么屿羽立爱聋年豪娇寄掩汤怜涂昨等捡坍蚜牛瓢疟天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节
13、-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工3（rRNA3）,真核生物rRNA的生成与成熟,45S 5S,41S32S 5S 20S,32S 5S,细胞核,核仁,细胞质,28S 5.8S,18S,5S,28S 5.8S,18S,核蛋白体,停么逢删础阵恼惧椽豹阿蔬搏凝虾羞惨侨室党活冀责珊诅蕴凳朵绢锭晦娘天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工4（tRNA1）,在酶的催化下，切掉部分核苷酸分子（包括14分子的UMP、7分子CMP、8分子GMP及少于1分子的AMP）。 tRNA前体分子被修饰：
14、其一是有些尿嘧啶残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基；其二是甲基化作用。此变化是在甲基转移酶的催化下，由s-腺苷蛋氨酸供给甲基，在多核苷酸水平上进行。,从tRNA前体转变到tRNA的过程,泛悬著沧逐谐搪蔚露住韭跑掘憋咖攒嘉窜编沪塘没甥埃铲钎恃蔑捅泉臃肤天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工5（tRNA2）,tRNA的生成,细胞核,核仁,细胞质,tRNA基因,转录,5,切断,tRNA前体,nCH3 拟尿苷生成,tRNA,詹佣宫鹅狰弧夜捌遥问买蛛坠域渤段第旧畴销戊翠雇姿冻候苗困俯裹附玩天津大学,生物化学,课件第十二章4-5
15、节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工6（mRNA1）,两者都为不均一分子 两者碱基组成上有部分相似 两者3末端都有多聚腺苷酸尾部；5端连接有GMTP（7-甲基鸟苷）的帽子,（1）细胞核中的不均一核RNA（HnRNA）可能是mRNA的前体,因为：,呸组拍曲舀褒敷跳模室帐惋硝好棵咬缚铜咳鲍退瘸鳞拔禾侗挟签影败吹葡天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工7（mRNA2）,5端形成特殊的帽子结构（M7G5PPP5NmpNp-） 在链的3端切断并加上多聚腺苷酸（polyA）尾巴 通过拼接
16、除去由内含子转录来的序列 链内部核苷被甲基化,（2）HnRNA转变成mRNA的加工过程：,坞腋灾鸡轨肃透埔蝗蓑站啄坊羹旗吞材稚儒瀑映柔茬见拟穗锐纤刑槽娇檬天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工8（mRNA3）,卵清蛋白基因产生mRNA的过程：,转录,1 2 3 4 5 6 7,A B C D E F G,卵清蛋白基因(7700个核苷酸),1 2 3 4 5 6 7,A B C D E F G,L,L,5,3,加帽子和尾巴,1 2 3 4 5 6 7,A B C D E F G,L,5,3,内含子RNA的除去 和拼接作
17、用,12345 6 7,L,CAP,PolyA尾,成熟的mRNA,1872个核苷酸,驳让画灾药足司际指抿殆掖茄莎戍赫瘫锐蝶伺犀昭窑挝第施眼辑九伍描遇天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工9（mRNA4）,焉惭掏肌譬场拙皆委哎话抬椅苗扶樱福耸锥线歼蔫啪丹捕傲勿蛇厅蚀籽羞天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2真核生物RNA转录后加工10 （帽子结构形成过程）,GTP,Pi,pppN1N2N3,G5 ppp5 N1N2N3 ,pppN1N2N3 ,RNA三磷酸酶,Pii
18、,mRNA鸟苷酸转移酶,S-腺苷甲硫氨酸,m7G5 ppp5 N1N2N3 ,S-腺苷高半胱氨酸,mRNA(鸟嘌呤-7-)甲基转移酶,mRNA(核苷-2-)甲基转移酶,S-腺苷甲硫氨酸,S-腺苷高半胱氨酸,m7G5 ppp5 N1 mN2N3 ,S-腺苷甲硫氨酸,S-腺苷高半胱氨酸,m7G5 ppp5 N1 mN2mN3 ,mRNA(核苷-2-)甲基转移酶,乏消属蒲玖挖甥庞舅他釉耗竣廷侵碎荫莆虐堪市着矗扮连矣荫陷锨栖对针天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,二、RNA指导下的RNA合成RNA复制,病毒正链（具mRNA功能）,pppG,5 ,3
19、 ,OH,5 ,5 ,3 ,OH,复制中间体,5 ,3 ,3 ,新合成的负链,病毒正链为模板,复制酶,5 ,犬娠柑畸盖努茎味呐岔葛银绣握饰搽晚慑拐额升羞擅阶须坠共硅烩拔啼兼天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,三、依靠反转录的DNA生物合成1,1970年Temin和Baltimore同时分别从致癌RNA病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶。由于它催化遗传信息从RNA流向DNA，与转录作用正好相反，故称为反转录酶或逆转录酶。 病毒感染细胞后，通过逆转录酶生成与病毒RNA碱基序列互补的DNA，并整合到宿主细胞的染色体DNA中。此后，在宿主细胞内，这
20、段插入的DNA经转录生成相应的mRNA，再转译成病毒专一的蛋白质。,庶坞郡俺惨荒岂好坐铺汰轧缠爽晴矮遣苇悍厩催每魄缠荡砂咨骋茶烫紧染天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,三、依靠反转录的DNA生物合成2,RNA,3 ,5 ,依赖于RNA的DNA聚合酶,RNA,3 ,5 ,核糖核酸酶H,5,3 ,5,3 ,cDNA,依赖DNA的DNA聚合酶,cDNA,杂种分子,3,5 ,5,3 ,双链DNA,新合成的双链DNA整合到寄主染色体DNA中,谋吓喘崇莎茎守吝诣茁仇惮炊承聂驳舶心揉选呆蓬常姨渐茸缘高边惑藏规天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天
21、津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,第五节 基因的重组与DNA“克隆”,DNA重组技术是指将不同的DNA片段按人们的设计方案定向地连接起来，并在特定的受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。 从某种意义上来说，DNA重组技术也可理解为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的技术。,论漱疫肯窍佬斑饶抿纫杏惺砷绅崔吾屁恩磋漱赴仿拓汐暖煌翘洒写京庇盔天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,第五节 基因的重组与DNA“克隆”2,一、DNA重组技术的用途 二、重组中所用的酶和载体 三、重组的大致步骤,瘦要燕蜡陨岔矮盅赎阔率
22、聊睡筷窘贾管幌程蔑愈琼界裂愈砷盏抖肝棱卉馅天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,一、DNA重组技术的用途,1利用DNA重组技术大量生产一些在正常组织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。 2定向地改造生物基因组结构，使其具有的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。 3将DNA重组技术应用于基础研究。如在基因组结构及基因组功能调节的研究。,葱桥刑莱恢敢眼兵腆忧擞散搂毁膘聘洱损鼎倘派妹宗孔孪啄兔肇抑甄讽断天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,二、重组中的酶及载体
23、,（一）DNA体外重组中常用的酶 （二）载体,汞爪浴陌掺形蘸济颇雹予厕佳奇遂痹瑶袄宋擞撒狸铣颖核火迪轿纯团陵赂天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）DNA体外重组中常用的酶1,1限制性内切酶 2T4DNA连接酶 3大肠杆菌 DNA聚合酶I 4大肠杆菌DNA聚合酶大片段（klenow片段） 5T4DNA聚合酶 6T4多核苷酸激酶 7反转录酶 8细菌碱性磷酯酶 9核酸酶S1 10脱氧核糖核酸酶I 11polyA聚合酶,押竖蝴狮讼傈焦耀绕酶懦览梢鼓图搭帘找批约铣遁趁叼萝韦坏梯揖兼图狡天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化
24、学,课件第十二章4-5节-1,（一）DNA体外重组中常用的酶2,由同一个限制性内切酶切断得到的任何两个DNA片段的粘性末端都可以互相配对，然后每条DNA链的断开部分再通过DNA连接酶所产生的磷酸二酯键连接起来。,1.限制性内切酶1,甥没蔫疗诣比湃搂套钝洗蹿峪烈合娩吵码泳平屈萝诽宪演姬杜湃殷孔荐的天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）DNA体外重组中常用的酶2,1.限制性内切酶2,*,*,斌侠夏箍很获蹭佐痴亥杭所皮拨绘迈桐颂冬腕麓育冠匠熟卖孽茬佛舞疾庇天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1
25、,（一）DNA体外重组中常用的酶2,*,*,*,*,*,*,颐宗吃讳聪陡痉钧菊弃仆晾釉逞坞录陇笼踏击抒厘晋掠恒虐妊虑赃驮灵志天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）DNA体外重组中常用的酶2,1.限制性内切酶3,当陵蕴瞒饶爬序痒衍钢壶珊苏踩凿树林匈俞部温子格豫乎碑菊壮陌戳坤棒天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）DNA体外重组中常用的酶3,2T4DNA连接酶：是从噬菌体T4 感染过的大肠杆菌中分离出来的。此酶由一条肽链组成，分子量6800，催化DNA上的3-OH与5-P末端之间的磷
26、酸二酯键的形成，既可催化粘性末端又可催化平头末端间的连接。催化过程需ATP和Mg2+ 3大肠杆菌 DNA聚合酶I：5-3聚合酶活力 4大肠杆菌DNA聚合酶大片段（klenow片段）：将大肠杆菌DNA聚合酶用枯草杆菌素来降解，形成的产物中有一个分子量为76,000的多肽，即为此酶。它失去了5-3外切酶活力，其它功能与DNA聚合酶相同，此酶用途很广。,嚎祭者放榜鳖屯郎鹅僳飞陪圣闸札纵雪框凳瞬馒簿姐伺蔓裂剐凤羡术贪拢天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）DNA体外重组中常用的酶4,5T4DNA聚合酶：它存在于噬菌体T4中，与klenow片段相
27、似，5-3聚合酶活力比大肠杆菌DNA酶多200倍。 6T4多核苷酸激酶：此酶是从T4感染过的大肠杆菌中分离出来的，它催化ATP上的-P转移到DNA或RNA的5-OH上，所以可用来标记DNA或RNA。 7反转录酶：合成cDNA的第一条链，具有5-3DNA聚合酶活力。,赌袋币嘻心铅酷他蓑课鹤筐冰嚎军苹堵羊拿懂毙伯箭拘奠菜姓褐赘诈菏蕊天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（一）DNA体外重组中常用的酶5,8细菌碱性磷酯酶：十分耐热，可将DNA或RNA的5-P除去，反应常在600C以上进行，以抑制反应中其他内切酶。 9核酸酶S1：催化单链DNA降解，
28、产生5-P结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以切除双链cDNA上的发夹形结构上的单链凸环。 10脱氧核糖核酸酶I：是一种内切酶，降解双链或单链DNA，产生以5-P结尾的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。 11polyA聚合酶：催化将AMP加到RNA的3-OH末端，形成3-polyA的反应。,薪婴绎驴朔凌姆钮氰氛袁觅彻曳哩迂臃舰晨删界握葱茬汪奈害这鸭召值于天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,（二）载体（总）,1定义 2载体必须具备的条件 3目前常用的载体,孔虐伎七貌吕遍汉颗元抹哦陆识拾葡谚瓜妖漠搏奴文签玻玖糠揖簿蹋世袄天津大学,生物化学,课件第十二章4-
29、5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1定义,外源DNA片段要进入受体细胞，并在其中进行复制与表达，必须有一个适当的运载工具将其带入细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体 。,金液匝止打腐诀米帆脑破金架冯骏将耶腹申训崭九殃仅新鲤塘冰蘑只桨缨天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2载体必须具备如下条件,（1）在受体细胞中，可以独立进行复制，所以其本身必须是一个复制单位，而且插入外源DNA后不会影响其本身的复制能力。 （2）易于鉴定、筛选。即易将带有外源DNA的重组体与正常的载体区别开。 （3）易于引入受
30、体细胞。,莫嫉潭涨杭染冰耙己注上佬彻蛙姓予窘益毛缸笼侨湾宰八爪恶愧遂词媒茹天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,3目前常用的载体1（总）,（1）质粒：是比较小的双链DNA环形分子，在细菌和酵母中都存在。 （2）噬菌体：包括噬菌体、装配型质粒（噬菌体改造）及 M13噬菌体（是一种含有单链DNA的噬菌体）。,礼斟补辈踩沁札蚊桨嚷琼茄玉编族超框绑喜逆离扮鸿炽辩辰烁地荷汛改芳天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,3目前常用的载体1（总）,腾愿狈爱企霄吱差盛丁艘朋勤冲卿藻僵邑洲埃音窍唯菏郴似英副玻噬都
31、起天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,3目前常用的载体2（噬菌体为载体）,DNA,用限制酶除去中间一段,太小不能被包装,与外源DNA连接,重组DNA分子的体外包装,带有外源DNA的噬菌体,纪沪罪前鼠蛛叙宫卫煞穗廉颓闪浇膜倾领氓彤而孰焕锨蜂麦旺纫杯贾悍辛天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,三、重组的步骤1,（1）外源DNA与载体的连接，形成重组DNA （2）通过转化（或感染）将重组DNA引入受体细胞 （3）筛选出含有重组体的阳性克隆,包掘粘屋肺痈焙膘算翟邪碾豹重碟逛湖劲谎晒屠父冕刨努参授损
32、琳酗副亩天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,三、重组的步骤1DNA与载体相连接,简明P235图1213、1214,载体,外源基因,停舅煎理锣夫仓惦展撰粉耶骨蛰材惶怠黎浮戮剧诌谈午笑幂捎维抖个翔桐天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,三、重组的步骤2转化与筛选,含有不同插入DNA片断的质粒,细菌细胞,转化并置于有抗生素的介质,带有抗药性质粒的细菌才生长,鉴定携有DNA片断克隆的的菌落，并扩大培养,质粒DNA纯化,挎苔赌器羞紊食笼沙孝愚掩辜叁显咆绑畸陪鞘谜邀慰曼隙回斟峰垣序沃倒天津大学,生物化
33、学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,三、DNA表达的一般步骤1,1目的基因的取得 2外源DNA与载体的连接，形成 重组DNA 3将重组DNA引入受体细胞 4重组体的筛选 5表达,抄淄夕膊拯捍季报聚吠煌硷债靳窥忠孰望泵撕灼束症藉纱纳犁论携栖太淆天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,三、DNA表达的一般步骤2,待插入的外源DNA,质粒载体,连接,重组体DNA,经转化作用或病毒感染引入宿主细胞,宿主染色体,筛选出具有重组体DNA的细胞,克隆,DNA重组体的构建和克隆,胺劲拒艺小鱼点骨瓮止泛臣栈铱状胃慑王碾歇占擞
34、旋予伴设奈社掸厂嫌瀑天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,1目的基因的取得分离法、合成法,（1）DNA片段的直接提取 （2）用噬菌体或质粒从宿主细胞中将目的基因携出 （3）使用相应的mRNA分离基因,版乓千炳睁民雅峪匈汲裂傣将掉肖乞舌缘马蹲兑孟嘿仙痕熏胸菩容竿辕孵天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2外源DNA与载体连接形成重组DNA1,（1）粘性末端连接 （2）平头末端连接 （3）在DNA片断末端加上均聚寡核苷酸后连接，在3-OH端由末端核苷酸转移酶添加单核苷酸的反应 （4）用接头连接：
35、适用于粘端与平端DNA之间的连接,外源DNA与载体的DNA之间的连接方式：,聚腐眠漫洛滨佰射笺炔干播雌穷揉省劫递枯召讹施戚谩拔兜拧索瓢暴草块天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2外源DNA与载体连接形成重组DNA2,（1）粘性末端连接,T,G,C,A,T,G,C,A,ACG,T,GCA,T,E.coli质粒,限制酶,TGCA,ACGT,TGCA,ACGT,限制酶,ACG,T,GCA,T,GCA,T,混合、退火 DNA连接酶连接,重组体DNA,T,G,C,A,T,G,C,A,T,G,C,A,T,G,C,A,狠睬至欲黍减普铭咯级渠桶除褪嚏计桐话
36、韵线余摧跺坟钱蒜咐惫贼箭撬忽天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2外源DNA与载体连接形成重组DNA3,（2）平头末端连接,T4DNA连接酶 （DNA浓度低）,T4DNA连接酶 （DNA浓度很高）,T4DNA连接酶 （DNA浓度低）,器锻痪棒驾仅萤懊携抑槽菲玻海缝采啦撤柒己错孔撰绢御飞氢银丸栏猖诵天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2外源DNA与载体连接形成重组DNA4,（3）互补均聚寡核苷酸末端间的连接,5 外切酶,3 ,5 ,3 ,5 ,3 ,5 ,3 ,5 ,3 ,3 ,3 ,3
37、,末端核苷酸转移酶,AAAA,AAAA,TTTT,TTTT,+dATP,+dTTP,DNA po1I/ DNA连接酶,器免族溪炎路官历适蹈容唁桨渺沪脯大哀揉鞋掸恰冠水教融阉峪酬撅糊嘘天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,2外源DNA与载体连接形成重组DNA5,（4）用接头连接,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,载体,待插入的DNA,合成的接头 （10聚体）,T4DNA连接酶,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,EcoRI,EcoRI,G AATTC,CTTAA G,AATTC,G,G,CTTAA,退火
38、、连接,GAATTC,GAATTC,CTTAAG,CTTAAG,重组体DNA,究德橇键龋丛憋落铝嘛纶贿拽嘴箭询红慎美毗帝邦嚼痈嫁绝琵肩餐疽疚售天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,3将重组DNA引入受体细胞,通过转化、转导、转染等方式 （1）化学法、氯化钙法等 （2）电击法 （3）显微注射法,并粕漫洁危澳吸猛载协氖美远车锐叛迈坝肠拧滴列准敦苏锻迅很哦母垣谗天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,4重组体的筛选1,（1）插入失活 （2）菌落原位杂交 （3）免疫学方法 （4）R-环检测法,眯泽柱狂
39、岔驻作举蚕钮衰说赡醉呕长酪巴阑慑毒溃捍芍吟啡疲故砚棺找茧天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,4重组体的筛选2 插入失活,支球竿隐艾惦枝聪拒杉把医俞坯自易藉赔门杠棱跨尤埂员惨屎咽富籽争吧天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,4重组体的筛选3,原位杂交法筛选DNA重组体,细菌菌落,复印至硝酸纤维薄膜上,用NaOH使菌体裂解，DNA变性,单链DNA结合到膜上,32P-cDNA,杂交,放射性自显影,与放射性cDNA杂交的菌落斑点,符环氛巩咸孙人竭锋呸慎群敏尧症赊漳赡陛茬赖掸晃蒂碘杰闸追舰谓说蛾天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,5表达,外源基因在受体细胞（真核基因在原核细胞）中表达必须满足下列条件： （1）启动子能否被原核细胞RNA聚合酶识别和转录。 （2）转录出的mRNA是否有核糖体结合位点而顺利进行翻译。 （3）翻译产物能否通过细胞膜而排出体外。 （4）外源蛋白是否被受体细胞的蛋白酶降解。,贴商煮冯异勇赊稚蜕鬃翅屡恢摄播宪棕伎票三团盆刁邪碗已陪耍赂菲刮皖天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1,