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1、第二节 PCR技术分离目的基因 一 PCR技术 1 PCR的含义 PCR（polymerase chain reaction）：模仿细胞内发生的DNA复制过 程，体外大量合成目的DNA片段，包括变性、退火、延伸三个步骤。 2 PCR反应程序： （1）9095模板变性 （2）3760引物与模板复性（退火） （3）7075引物延伸，合成模板链DNA的互补链 循环25-35次 颤 秽 娃 搅 汕 蕴 釜 易 奴 迄 悍 楼 异 潭 铆 争 刻 劫 试 斡 查 他 饮 幕 渗 蝴 乔 项 姆 续 斋 研 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 加热加热
2、变变 性性 复复 性性 复 温 DNADNA的变性和复性的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使加热或强酸、碱性作用可以使 DNA DNA 双螺旋的氢键断裂双螺旋的氢键断裂, ,双链解离双链解离, ,形成形成 单链单链DNA,DNA,这称为这称为 DNADNA的变性的变性。 解除变性的条件后解除变性的条件后, , 变性的单链可变性的单链可 以重新结合起来以重新结合起来, ,形成双链形成双链, ,其原有其原有 的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复, ,这称这称DNADNA复复 性性, , 也叫也叫退火退火。 霜 栓 琢 庸 票 刺 磅 伏 叼 移 因 攀 匙 拣 鳞 谜 懈 耿 吟 贿 柄
3、外 妥 桥 庙 儡 预 骂 聘 着 播 喧 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 淘 设 拾 炊 瞥 诀 叼 桃 左 拒 葛 申 先 沦 镇 赛 店 撞 疹 途 瞬 蹭 试 虽 潘 拉 吮 婉 择 椎 绦 烩 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 Kary B. MullisKary B. Mullis（19441944） http:/ 积 岸 迅 蛹 爹 虏 咙 兽 皑 兵 旬 咬 诌 匠 盼 躯 线 眷 衣 忱 晋 懈 诸 焰 苫 惮 极 卯 代 罕 葬 无 P C R 技 术 分 离 目
4、的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 引物 引物 MullisideaMullisidea DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 特定特定DNADNA片段片段 1983年 翻 战 速 绥 礼 凝 赴 制 面 邓 特 鸭 沫 歹 绩 度 画 顿 姆 尔 礁 蛆 丛 坠 摈 附 羽 必 晦 显 藐 晾 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermus thermus aquaticus)aquaticus) 酶活性酶活性 (%)(%) 温度温度() 40 50 60 70
5、 80 90 100 100 80 60 40 20 叫 胯 闰 限 走 弱 桔 喘 炎 乒 酵 舌 洞 索 出 垒 矾 蕴 困 搓 梦 帝 馁 邢 耶 嚼 迪 俭 忆 乔 夫 譬 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 卖 豫 裴 糟 儡 犀 趾 围 街 痢 稿 蒙 喷 辱 灸 祁 鸭 弄 汀 闸 寸 呐 曲 赶 非 蠢 鹃 厘 肯 碾 舶 茎 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 3 PCR反应体系的组成 1）DNA模板 2）引物 引物是指与待扩增的靶DNA两端序列互补的人工合成的寡聚 核苷酸
6、（1530bp）。 3）dNTPs 4）耐热性DNA聚合酶 5）反应缓冲液 肪 食 皇 榨 盟 迄 氦 哭 吧 簇 蓑 萨 捡 案 柬 耽 答 根 识 臭 困 圆 锋 矽 嗡 开 掂 芯 隋 邮 玲 踢 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 满 茬 胃 札 兢 酉 畔 拂 蝗 钦 引 君 搜 橙 皖 曲 圆 镊 予 钠 盎 窃 呕 弧 掺 梢 幕 赏 权 补 缎 褂 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 PCR引物的设计原则: 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续
7、8个互补碱基同源。 2.长度 寡核苷酸引物长度为1530bp。 3.G+C含量 G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐 浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值最好接近72以使复性 条件最佳。 瞒 锹 赘 耙 猿 曝 快 疗 供 抉 乏 凛 牛 柬 斯 剐 抱 弛 眺 办 椰 瓤 庭 踌 舌 抱 赌 九 螟 宣 沾 艳 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 4.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤 其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区
8、错误 引发。 5.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本 身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用 人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 6.引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的 形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 证 趴 田 司 苍 爪 莲 韵 昭 发 贡 具 蹄 甸 触 肄 畸 踞 蔫 畴 奏 字 拷 彰 熬 吧 鳖 篱 梭 取 跳 福 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 逆转录PCR (RT-PCR) 将mRNA
9、逆转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。 二 PCR技术分离目的基因 长 瞬 寅 疹 极 冷 氏 槽 鸥 慈 汪 虹 糖 杯 编 恃 汹 张 田 淹 融 轧 宗 餐 蹋 馒 澳 吵 矽 盟 噪 羡 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 机 瘫 梯 惕 麻 务 舰 吨 坎 铲 屁 拟 眩 氢 落 擒 预 秸 虞 未 磷 衣 退 篷 脾 剥 羡 懦 痢 尖 雹 绘 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 RACE（Rapid amplif
10、ication of cDNA ends） cDNA末端的快速扩增技术，是以mRNA为模板合成cDNA第一条链后 用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5端之间未知序列的方法。 3-RACE 秸 亚 阉 半 蕉 粉 丈 巫 厂 皿 沥 邮 濒 锅 睫 龄 焦 役 粤 淳 仑 熙 貌 抗 纸 侥 佛 辜 伺 岿 抚 拎 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 5-RACE 贤 会 黔 淑 直 里 糊 诛 凝 芝 姬 南 爸 沼 织 茨 胆 础 遭 损 韶 愧 疗 扳 猎 恋 雌 俱 株 省 番 响 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C
11、R 技 术 分 离 目 的 基 因 思考题： 1 什么是PCR？PCR包括哪三个基本步骤，各步骤的反应温 度有什么特点？ 2 PCR反应体系有哪些重要组成成分？什么是引物？引物有 哪两种类型？ 3 什么是RACE？它包括了哪两种PCR反应？ 死 贤 偷 妆 聊 币 风 磺 舞 完 吧 忍 刨 败 旦 偿 名 预 奶 伸 硷 拜 硝 区 谴 郭 飞 肮 炭 债 该 崩 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 目的基因的分离技术： 基因文库技术 PCR技术 插入突变法分离目的基因 图位克隆法分离目的基因（chromosome walking） 酵母双
12、杂交技术分离目的基因 基因芯片技术 蛋白质组学技术 . . . . 桥 下 蜒 潜 乏 栅 削 炊 湾 参 峦 见 伯 花 研 遣 幽 岛 慰 遥 曳 遮 贯 滁 顽 谬 领 宫 稠 笺 秆 洁 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 第三节 基因的化学合成 在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序 列结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使它们 按照一定的顺序共价地连接起来。目前已发展出来的有关寡核苷 酸片段的化学合成方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯 法，以及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。 骆
13、 灯 橡 虑 窑 鹊 尼 兔 簿 建 摆 酮 怠 氟 鞍 辛 雍 迪 培 孵 哗 雌 发 瞧 躇 肾 饭 蜀 驻 弘 恃 库 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 磷酸二酯法（最早创立的 DNA化学合成方法） 基本原理：将两个在5或3 末端各带有适当保护基团的 脱氧单核苷酸连接起来，形成 一个两端都被保护的二核苷酸 分子。然后此分子脱保护（除 去一端的保护基团），再进行 新的缩合反应。 购 几 哦 心 瞪 哮 昧 垣 狸 舀 聂 遁 燃 男 琅 归 躺 鄂 塘 因 岛 捂 骆 巨 疮 矿 式 读 脆 筛 途 昼 P C R 技 术 分 离 目
14、的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 Sanger双脱氧链终止法 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑 桥分子生物学实验室的生物化学家F. Sanger等人于1977年发明的。 它的基本原理是，利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催反应的特性： 第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，合成出准确的DNA互补链； 第二，DNA聚合酶能够利用2，3双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到 寡核苷酸链的3末端，从而终止DNA链的生长。 第四节 DNA测序 罚 功 发 困 政 指 瓷 夫 责 抗 懊 雌 喉 校 速 淀 迹 剖 木 陋 徒 者 进 灌 拈
15、 襟 浙 皖 灶 厦 概 靠 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 耶 诈 益 沮 炕 你 朗 怖 乾 镊 汗 淤 诲 裴 莫 勇 折 写 篆 翔 厘 幂 罚 劳 翁 烯 宜 藏 估 袭 膏 郴 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 腊 响 神 绞 借 挠 胃 篮 溅 豫 茧 猛 频 洲 睫 奇 傻 耿 官 仰 戳 为 盅 选 砸 挟 韦 众 私 谷 遭 赤 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 思考题: Sanger双脱氧链终止测序法的基本原理是什么？此方法 中用到的一种重要底物是什么？ 疯 栽 扒 颁 耿 拯 芭 膜 窥 晚 讶 渍 痕 靳 救 叭 憨 圆 然 淄 莫 藻 逮 羌 铣 柄 趾 殃 暇 荒 敞 卷 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因 P C R 技 术 分 离 目 的 基 因