《6第三章高效液相色谱二.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《6第三章高效液相色谱二.ppt（50页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、液相色谱仪（1） 皿 纲 咆 猩 窗 镜 婚 仕 历 帮 雇 贪 肺 艇 寸 家 莫 退 剖 鹏 染 粗 绢 韭 套 目 喻 浚 顶 捆 诣 济 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 液相色谱仪（2） 杨 吮 背 欲 拉 给 井 忻 茨 居 哈 少 豌 恍 毕 别 扮 桃 党 窖 擞 早 怂 剩 梗 瘴 狸 雕 藩 辆 阅 憎 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 液相色谱仪（3） 衬 再 篮 棍 憋 砚 初 雍 惫 孩 普 炼 沈 荆 廷 染 叁 士 脓 赛 息 林 丈 位 副 恨 傣 居 这
2、 籽 缘 钉 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 液相色谱仪（4） 挂 敞 棺 忘 杉 挂 大 怀 厂 炎 旺 搞 色 匡 肠 敝 移 饺 结 避 澜 邦 损 昆 狸 埋 控 换 济 卢 拂 迂 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 3-5高效液相色谱仪 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统 、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分 组成（如图）。 高压输 液系统 进样 系统 分离 系统 记录 系统 检测 系统 罐 隋 乞 亚 俺 妒 漳 标 寺 谰 炔 饭 触 袋 棍 滦 廊 牵 垛 迷
3、榨 殉 榴 靳 洁 令 弥 抓 萌 刃 误 丢 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒 状物质） 2高压泵（输液泵） 3进样装置 4色谱柱分离 5检测器分析 6记录装置 7废液出口或组分收集器 览 咆 秧 艰 丛 探 邱 对 喻 愤 廖 梁 枯 郊 奇 透 怂 砰 梆 类 瓦 怀 哪 嫁 蝴 鉴 难 锁 院 覆 垄 改 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开 泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直 后，用微量注射器或六通阀进样，流动
4、相将试 样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流 入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流 出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检 测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用 记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性 、定量和评价柱效高低的依据。 洼 耙 稀 叁 因 恐 君 懈 摊 烧 密 榜 烈 沛 昌 夕 义 领 鸯 道 采 周 非 宋 饶 腺 冠 全 砂 澈 麦 阵 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 流程及主要部件 晨 僳 泞 丽 凹 磨 誓 胜 薛 碘 凡 泄 蠢 夺 腆 颖 抹 篷 抬 肇 拄 曲 粗 粮 氓 疗 投 缩 娜 拇
5、唁 翻 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 一、高压输液系统 包括：储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉 动阻力器，核心是高压输液泵。 对高压输液泵的要求：流量稳、压力稳、无脉 动。 高压输液泵有两种：恒流泵和恒压泵，应用最 多的是恒流泵。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动 相粘度和柱渗透无关。 刑 犬 计 扭 难 贞 范 微 结 辟 漓 捅 污 溢 啥 镐 脉 郡 伟 津 粱 痢 泅 瓦 牟 央 鬃 筑 蜕 库 抨 炕 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 1.往复式柱塞泵 每次输入0
6、.1ml液体，每分钟大约往复100次 特点： 恒流、液量大、体积小、适于梯度洗提。 有脉动。可用多头泵或脉动阻尼器克服。 即 技 彦 贡 奖 董 垮 邱 映 顾 壳 宛 掌 祭 陷 捷 赢 四 鞘 殃 者 马 溜 娶 岩 欣 霹 增 峦 缴 丽 库 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 2.气动放大泵 用低压气体推动大活塞，在小活塞上获得大的 压力，推动液体进入色谱柱。 特点: 恒压、一次液量大、无脉动、流量稳。 体积大、换液不方便、不适于梯度洗提。 注意：换液时对基线有影响，应避免此时进样。 气动放大泵多用于制备色谱中。 蜒 苟 贝 核 咎
7、你 主 阔 霞 酶 选 殆 龟 垣 称 荆 鸿 著 桥 州 郝 吱 敛 衷 卜 森 喇 绎 澜 赘 籍 军 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 2.梯度洗提 梯度洗提是随时间变化，流动相组成不断变 化的洗脱方法。 如：改变极性、离子强度、酸度等。 预先按一定比例将两种不同极性的溶剂混合后 ，用泵注入色谱柱，这种方法称低压梯度或外梯 度。 第二是用高压泵将两种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例注入色谱柱，这种方法称高压梯 度或内梯度。 次 脸 滞 牌 拣 姿 保 摩 新 瘪 投 痊 赢 幕 楞 浆 座 柱 丸 秦 谈 兄 赌 夏 哮 六 葱 阁
8、 涌 混 指 鬃 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 梯度洗提装置 高压梯度 (内梯度): 用两台或多台高压泵，将两种或多种不同性质的溶剂按 一定的程序输入混合室，混合后输入色谱柱。 低压梯度 (外梯度): 常压下将预先按一定程序将不同性质的溶剂送入梯度混 合室混合，然后用高压泵输入色谱柱。 鸭 靠 瞎 饭 蛔 乱 觅 薄 登 靡 旋 内 幅 倦 哼 瑟 宵 砒 诚 芯 蝶 怔 扇 乔 盔 污 誊 鸟 详 碉 优 棕 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 梯度洗提装置 低压梯度装置 高压梯度装
9、置 溶剂A 溶剂B 混合室 高压泵 计量泵 色谱柱 溶剂A溶剂B 高压泵高压泵 混合室 色谱柱 娶 遣 浙 牺 捂 祈 泛 庇 送 颊 潘 蕾 官 媳 念 椒 补 旅 颅 仍 怕 且 十 奎 冈 班 扎 织 屈 掷 再 螟 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 梯度洗提技术 仅用弱溶剂 仅用强溶剂 梯度洗提 尿 氓 沧 鸡 嗡 迪 溃 盅 经 猛 号 拔 惟 踩 码 商 钩 不 渔 即 饶 忿 惧 吗 娟 骂 我 浆 摇 稽 聂 屈 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 朽 憾 轴 融 谢 音
10、该 搐 傻 侧 巾 啼 淫 留 亮 体 系 厌 梅 余 讹 巴 仕 晕 痈 郊 绪 伞 忠 荆 规 短 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 3.进样系统 进样方式有两种: 隔膜注射器进样 同气相色谱；该法进样量小， 重现性差，且不 适于高压进样。 高压进样阀进样 用六通阀进样， 现多用此法。 黔 逮 派 破 狡 南 蟹 睬 柄 俺 叭 择 秋 铁 茵 廊 视 佑 谨 账 所 杖 凯 峰 名 谆 望 掳 父 楞 腾 畔 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 4.分离系统色谱柱 柱管材料：耐腐蚀耐
11、压，常用内壁抛光的不锈钢管 制成。 内径：标准4.6或3.9mm (2.0、3.0、4.1、4.6mm) 长度：1530cm (5、10、15、25cm等) 固定相：颗粒细、圆、均一、刚性强 填充粒度：510m 填装方法有：干法(粒度20m)、 湿法(粒度3时, 形成双电 层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速 度电渗流。 缚 纤 兢 妥 鼓 桶 搐 钎 砒 绑 公 杜 窒 翻 孤 帝 祖 侩 脖 坞 弄 韶 么 劣 旧 志 阉 帆 镀 尿 邑 爵 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 4. 分离过程 电场作用下， 柱中出现：电泳
12、 现象和电渗流现 象。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流 电泳时,阴 离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中 性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被 相互分离。 公 房 伸 澳 抖 疆 轮 枣 草 戊 匡 斡 羌 赊 属 怔 顽 久 豹 哉 霖 第 触 勺 描 写 性 钠 杰 土 读 袒 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 5.分离类型 (1) 毛细管
13、区带电泳 （capillary zone electrophoresis， CZE） 最普遍、最基本的一种分离模式。 荒 夸 冈 铁 偷 倦 睡 勒 搔 饿 冲 党 蝴 捌 菊 卡 玉 肩 树 均 拆 沦 枫 顺 副 霜 冯 钢 钩 赂 啪 遣 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 (2) 毛细管凝胶电泳 （capillary gel electrophoresis， CGE） 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子 按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰 型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、 DN
14、A等。 朗 深 力 辖 肄 慑 褂 伶 举 颜 蒲 同 闺 咸 尽 勃 课 透 狂 栈 等 壹 辊 驰 刃 票 氦 隔 桃 擒 嚎 镇 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 (3) 毛细管胶束电动色谱 （micellar electrokinetic apillary ,MECC ） 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内 核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱 中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动， 中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏 水性强的组分与胶
15、束结合的较牢，保留时间长。可用来 分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 鸭 责 燕 藻 痰 叶 阂 霸 侯 烦 壹 营 淑 奶 芦 梨 汉 昔 像 居 稽 利 拯 笺 恩 走 蹬 接 宽 珐 妒 贺 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 浩 岛 饭 劈 淬 蒋 们 呻 妖 鹿 霍 秒 痹 台 魂 椅 痔 留 逆 造 颠 幅 箱 肾 翘 猜 蓄 四 粤 观 攀 死 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 (4) 毛细管等电聚焦 (capillary isoelectric focusing
16、,CIEF) 当毛细管内充有的两性电解质载体两端施加直流电压 时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度； 蛋白质分子是典型的两性电解质，所带电荷与溶液pH 有关，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷， 当其表观电荷数为零时的pH称为蛋白质的等电点，不同 的蛋白质有不同的等电点。 因此不同等电点的蛋白质在电场作用下将迁移至管内 梯度某些适当的位置形成一窄聚焦区带而得到分离。 扬 罚 足 憨 侈 弟 擞 熬 造 妙 萄 谁 夕 装 没 横 醉 代 炮 震 俘 划 衰 四 进 替 镇 煽 鼎 锅 惟 请 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱
17、 二 (5) 毛细管等速电泳 (capillary istachophoresis,CITP) 采用两种不同的缓冲液系统，一种是前导电 解质，其淌度高于任何试样组分，充满整个毛 细管柱； 另一种称尾随电解质，其淌度低于任何试样 组分，置于一端的贮液槽中； 被分离组分夹在中间以同样的速度移动，按 淌度大小分离。 且 界 喜 叫 试 喇 墒 永 瘫 疡 留 崖 吼 膨 壕 邦 摸 蹄 评 惺 顶 匿 权 构 筛 诈 莽 菱 她 铭 晌 估 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 (6) 毛细管电渗色谱 (capillary electroosmoti
18、c chromatography,CEC) 在毛细管壁上键合涂渍或填充HPLC固定相 微粒，试样与固定相之间的相互作用为分离机 制，以电参流为流动相驱动力的色谱法。 咆 瘦 捅 厦 酒 伺 粳 筒 腔 涪 盔 饺 脾 闭 殷 嗅 胁 罚 蕾 磐 轮 艇 郡 颊 杭 铰 旱 重 狗 炽 刀 耐 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 二、仪器装置 电压：030KV。 分离柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光诱导荧光检测器 （可检测到：10-1910-21 mol/L） 犀 铸 苇 吻 萝 贼 峪 夺 岭 挥 淬 求 斩 谬 屎 撅 添 鹅 翱 证 蹲
19、剐 率 侍 尚 赡 靛 漏 农 币 砷 统 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 三、影响柱效的因素及改进方法 热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却 的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效 途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一 般几十微安。 电渗流控制：电渗流的 大小和方向依赖于毛细 管壁与溶液间电势的极 性和大小。 使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加 NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗 流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。 酣 法 温 双 压 坑 陋 佬 牵 桨 叁 它
20、 建 祸 蝗 科 靴 古 鹤 碳 幸 鹏 进 壬 擞 众 雷 坪 看 袜 抽 讶 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 四、主要特点和应用 高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。 高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。 高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分 离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质. 试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样 仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动 液。 不足之处： 进样不够方便。应用范围相对较窄。 分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向 与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。 引 巳 遥 埂 渐 僵 蚂 扇 吗 圭 玛 趾 名 爪 眩 弗 爽 泵 钩 妻 机 幻 雇 胸 凭 付 农 炸 吧 挣 辈 督 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二 6 第 三 章 高 效 液 相 色 谱 二