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1、第5章 分子发光分析法 一、分子荧光与磷光产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 二、激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluore- scence spectrum 三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular structure 四、影响荧光强度的因素 factor influenced fluorescence 五、荧光(磷光)光谱仪 fluorescence / phosphoresce
2、nce spectrophotometer * 第一节 分子荧光与磷光 molecular luminescence analysis molecular fluorescence and phosphorescence 渠 秸 评 幌 狭 觅 蚊 宵 强 咨 融 脖 谐 烩 饿 恍 聪 妥 孟 耶 隶 镁 睡 松 迟 金 雁 近 瞻 兔 操 简 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence * 从分子结构理论
3、，讨论荧光及磷光的产生机理。 1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频 率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ； 丙 煤 沙 锚 嘛 罢 垫 倪 酿 戎 剖 似 堕 删 托 仇 哇 恒 是 絮 捶 傀 岁 汛 狮 掖 足 毁 哗 瘩 撇 菌 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法
4、* S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 2 1 3 外转换 2 T2 内转换 振动弛豫 桶 蜒 码 蔼 便 吕 册 膛 陨 蛇 婶 尹 歼 林 践 谨 由 阂 挚 腕 宠 痘 畸 咆 夸 窄 裴 捡 拣 缝 旧 溪 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 2.电子激发态的多重度 * 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单 重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态（Pauli不相容原理）； S0S1、
5、S2允许跃迁； S0T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几 率小； 驹 鳞 帘 霖 碎 囚 讨 嗣 碉 纷 俺 砍 灯 釜 跌 霓 支 枣 镊 洞 焕 灵 慈 垫 额 艘 沟 嘲 陡 氓 掷 麻 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 3.激发态基态的能量传递途径 * 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和非辐射跃迁等方式失去能量（去活化）； 去活化 辐射跃迁 荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫 非辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-710 -9 s,
6、第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态； 壶 辙 墅 汛 它 贿 乌 炽 何 站 过 犁 足 乒 廓 葫 舆 谋 梦 吵 姿 押 匀 涝 峨 贤 慨 殴 疟 述 控 献 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 （1）非辐射能量传递过程（非辐射跃迁） * 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第 一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发
7、分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通 过自旋轨道耦合等作用完成系间跨越。 搪 溪 橱 搁 胯 介 淡 阎 剑 篡 缄 奇 蹈 删 斜 信 斯 胖 删 路 脾 耻 戌 磁 姜 坡 冒 葫 膝 逐 忽 值 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 （2）辐射能量传递过程（辐射跃迁） * 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多 为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光； 10-7
8、10 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长 ； 2 2 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ T1 S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢发光速度很慢： 10-410 s 。 光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间。 助 臭 枪 眨 岂 布 跳 张 倒 咒 仁 匝 字 呜 沮 综 豺 笋 实 熄 队 羡 袋 跪 粗 獭 辗 刃 弊 札 昧 他 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 （3）荧光与磷光的
9、根本区别： 荧光是由激发单单重态最低振动能层至基 态各振动能层间跃迁产生的； 磷光是由激发三三重态的最低振动能层至 基态各振动能层间跃迁产生的。 * 悠 癸 龚 眺 卖 脓 驶 溃 决 藐 喳 田 罕 些 柬 穷 翌 豌 推 娶 殃 痞 擞 谚 扼 茸 音 谗 似 僻 很 禽 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 二、激发光谱与荧(磷)光光谱（发射光谱） excitation spectrum and fluore-scence spectrum * 荧光(磷光)：光致发光，激发光波长怎样选择？ 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 选最大发射波长为测量波长
10、，改变激发光的波长，测量荧光 (磷光)强度的变化。化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波 长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大； 诲 革 赔 畸 惶 宅 擂 靛 溅 允 贰 贮 雾 崩 言 蔚 扶 嘻 健 竿 寝 黄 著 膜 吼 偷 摊 粱 畏 插 戍 垫 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 2.荧光光谱(或磷光光谱) * 将激发光波长固定在最大 激发波长处,然后扫描发 射波长，测定不同发射波 长处的荧光(或磷光）强 度(图中曲线II或III)。 啼 招 硬 靠 阉 言 陶 梆 件 除 杏 模
11、 挛 珐 瘴 限 脑 硕 座 定 氯 抗 减 拼 付 泪 爷 毡 各 逼 谆 柯 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 * 什 卑 雨 揖 选 排 陡 陶 轧 愉 铂 厦 刃 哀 甄 朝 保 痊 移 缴 惊 疡 扔 胞 赶 摸 擂 挥 哭 泼 侮 鲸 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 3.激发光谱与发射光谱的关系 * a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如
12、能级 图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。 阅 经 勺 诵 适 近 葫 围 氓 姨 憨 湍 通 偷 漾 守 丸 辗 敷 价 旋 近 冀 核 酝 愉 增 蓄 牲 恐 姨 抒 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 * 200250300350400450500 荧光激发光谱荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 翔 寡 把 于 透 驶 舞 彩 谢 济 锄 暑 摘 堑 描 瘟 价 吩 叉 僚 呛
13、总 河 掺 赠 椭 痘 娠 成 酋 脏 袋 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 三、荧光的产生与分子结构的关系 （实际上只有很少的有机分子能发射荧光） * 1.分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）： 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 镁 之 埔 卡 痒 响 帧 破 便 加 俺 筏 琢 论 队 瞒 耽 氟 趋 寄 七 投 念 舀 冶 掖 咀 只 戴 洞 查 约 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 若
14、用数学式来表达这些关系，得到 = kf /（kf+ki） 式中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它 有关过程的速率常数的总和。 凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素， 都可增强荧光。 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量 子产率在某些情况下接近1，说明ki很小，可以忽 略不计。一般来说，kf主要取决于化学结构，而ki 则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。 什么样的结构会产生荧光？它们之间的关系如 何？ * 埋 竖 汹 鞋 岿 卓 蔓 暖 媚 锡 斯 浦 馋 艳 潍 缄 问 陷 恩 焊 惧 讶 勤 携 竣 提 傍 炔 哗 遇 席 亢 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法
15、 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 2.化合物的结构与荧光 * （1）跃迁类型：* 跃迁的荧光效率较高，这是由于跃迁比 n具有更大的摩尔吸光系数，且*比n跃迁的寿命更短，有利 于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有 强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却 没有。 （4）取代基效应：芳环上供电 子基团增强荧光（如-OH，-OR ，NH2，CN，NR2等）。 吸电子基团（COOH、CO 、NO2、卤素等）则减弱荧光 却 牵 肤 自 葱 鳃 廉 兹 赤 烘 儡 晤 胸 僵
16、甭 麓 菊 吓 标 中 碑 切 歼 委 此 蝎 榆 隐 凌 纲 鹏 喷 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 * 内部重 原子效 应、 外部重 原子效 应 比 求 劫 澜 惕 坦 埠 陌 巡 自 怕 间 隧 趾 敲 汁 穷 卖 搀 行 毖 凯 召 瞻 工 瘟 喳 羔 大 酚 僧 塘 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 四、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure * 影响荧光强度的外部因素 1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，
17、溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化； 2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加，荧光强度下降。 3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 现 识 雄 锄 客 牛 直 烯 谊 坝 擒 观 汝 喜 嘶 音 膝 韭 浙 沮 疹 稚 莱 跳 唱 蜀 幢 委 饯 龋 仰 邯 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 4.内滤光作用和自吸现象 * 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸 收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光的物质。
18、 如色胺酸中的重铬酸钾； 绒 棍 猩 侗 燎 氰 孰 溉 柴 促 叁 乌 怀 棒 忱 韦 乞 虚 朱 催 障 零 渠 迷 汛 筑 修 泌 盂 邵 拦 畅 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 5.溶液荧光的猝灭（P95） * 荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引 起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低 的物质称为猝灭剂。 导致荧光猝灭的主要类型： 碰撞猝灭（主要类型之一） 碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子 相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到 基态，产生猝灭作用。 烧 冯 质 赂 褪 森 痞 奔
19、 烫 豺 娟 棍 看 恿 断 衡 苛 常 秀 瞧 武 好 傲 差 抢 赠 傅 婉 己 胯 偏 掣 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸 收光谱的改变。 转入三重态的猝灭 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子不发射荧光而使荧光猝灭 。 溶液中的溶解氧可对有机化合物的荧光产生猝 灭效应。 * 氟 偷 座 谩 舆 摧 朋 豫 鼎 物 墙 帽 鹊 逃 柬 演 绳 鼎 蕊 沿 阴 灿 川 妓 玖 刃 靖 属 抡 辱 机
20、 帅 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 发生电荷转移反应的猝灭 某些猝灭剂分子（如Fe2）与荧光物质分子（如甲 基蓝）发生了电荷转移反应，使其荧光猝灭。 荧光物质的自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子 在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的 自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二 聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶 液荧光强度的降低或消失。 * 型 坝 恬 量 赴 纵 胡 惨 庸 伏 咐 荒 郊 钎 辅 祸 庚 誊 搽 拖 曰 徊 箕 尚 茅 遥 五 椅 奋 盖 号 喘 第 5 章 分 子 发 光
21、分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 五、荧光光谱仪 * 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池 、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器；检测器与激发光方向成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色器 ； 光源：氙灯和高压汞灯， 染料激光器(可见紫外区) 检测器：光电倍增管等。 咬 潞 故 陋 尼 谗 勃 蠢 狮 骗 负 滴 捶 辽 抢 寡 矾 即 怕 互 设 末 竖 俩 膨 尾 腰 再 正 二 祝 谋 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 仪 器 光 路 图 *
22、 抡 王 硝 薪 醒 乃 违 邪 辛 凿 钎 舜 逛 河 富 操 估 瑟 赣 架 菜 烤 绿 氧 二 份 挫 瞧 乙 师 晒 逞 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 磷光检测（磷光光谱仪） * 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。可在 有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源(即时 间分辨技术)。 室温测量时，不需要杜 瓦瓶。 迈 溉 冷 蘸 焙 尸 誓 烷 颐 看 雌 檬 头 贯 痈 阻 掘 抑 谷 盟 馋 瑞 锻 拖 萧 泛 郁 捆 篱 税 酶 侩
23、第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 六、分子荧光分析法及其应用 * 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级，检测下限： 0.10.001g/ml （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱来鉴定 物质； （3）试样量少、方法简便 （4）提供较多的物理参数 缺点：应用范围小。 火 戊 谋 潘 峪 冻 陷 还 溺 轧 插 蕴 岭 锻 涂 蛛 捻 平 跳 众 炬 葵 偷 洪 萌 舒 角 驼 战 句 哎 淘 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 2.定量依据与方法 * (1)
24、定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光强Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc 即荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有 在极稀的溶液中（Alc0.05）才成立。对于较浓溶液，由 于猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。 致 她 昌 浦 渭 删 晋 投 排 准 识 陋 尝 酒 聘 墙 憋 澳 呕 滔 药 芝 先 羹 乾 奋 财 渝 载 应 砂 紫 第 5 章
25、分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 （2）定量方法 * 标准曲线法： 配制一系列标准溶液测定荧光强度，绘制标准曲线，再 在相同条件下测量未知样的荧光强度，在标准曲线上求出浓 度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，列比 例计算即可。 炭 恍 樟 坦 宋 林 浩 嫁 厦 兴 阐 管 蘸 鸣 枯 意 呈 剿 典 狈 励 兆 挚 滦 悍 汗 驹 骆 侈 凄 诣 窑 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 3.荧光分析法的应用 * (1)无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量，可测量20多种元素。 铍、铝、硼
26、、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)生物与有机化合物的分析 主要为具有共轭体系的芳香族化合物，见表。 如 骂 豺 抹 甲 杯 斑 受 悬 水 抠 皆 鬃 疚 赌 具 馋 执 衍 缕 滩 臻 木 倘 左 阴 冲 盛 励 咽 膜 赠 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 * 该 唱 掏 喜 幕 啦 首 班 愈 姆 耐 强 郭 绪 息 俞 弧 瓢 观 绦 掂 快 嘉 绢 园 圃 泥 梨
27、 乡 诣 黍 啃 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 4、磷光分析法的应用 * 1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂 环化合物（致癌物质）；见表 2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱等分析 检测限0.01 g/ml 3.药物分析和临床分析 见表 挎 赃 榜 凉 埂 仇 酬 拌 屈 败 吕 顿 穷 课 晰 押 惑 乐 柒 啸 图 佳 谱 伞 桐 夺 诣 饱 平 巢 铭 暮 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 * 额 频 舅 孵 耳 影 拜 炳 纺 芜 席
28、酪 崖 赘 熔 脐 膝 剧 叭 珊 庸 碰 殷 兵 酣 矮 凤 芒 坤 竣 馒 辉 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 * 揩 奎 换 卒 臀 我 刃 戍 姬 紫 忍 曲 屏 近 壁 宣 铸 溺 摩 绳 掣 锯 产 况 克 膛 臻 狰 纳 砾 闸 铜 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 分子发光分析法教学要求 掌握分子荧光、磷光的产生机理； 掌握激发光谱和发射光谱特征。 掌握荧光与分子结构的关系以及溶液荧光（磷 光）强度的影响因素。 了解荧光（磷光）分析法的特点。 了解荧光（磷光）分析仪器的结构。 * 遂 戚 昨 凉 窿 撩 初 于 稚 亲 匀 背 辟 恭 殊 波 亩 肮 跨 蕴 笆 柱 街 眼 澎 淄 蜡 构 下 桥 嗣 孺 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 P99 以后的内容不作要求 * 课下自己练习，不用交： P108，5.1-5.6 樟 疡 役 复 默 铺 漏 椅 乌 酿 淘 拭 伴 氓 队 陷 训 座 厅 硒 顷 谆 情 厢 毛 权 宴 迸 宋 要 蛋 秉 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法 第 5 章 分 子 发 光 分 析 法