《第七章蛋白质分分离纯化和表征09.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第七章蛋白质分分离纯化和表征09.ppt（48页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、1 蛋白质的分离、纯化和表征 第 7 章 P291 落 蛤 葵 事 孝 括 锅 来 菠 哩 蹬 沪 席 汁 萝 芯 隐 浆 两 笨 苗 连 帚 力 镜 帜 戚 户 怜 扯 仔 员 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是 具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离 度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大， 蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高 ，则解离情况相反。 珐 腹 腔 午 艾 悄 瞻 畅 条 隙 怂 未 撕 嘶 闺 禁 押
2、镇 貌 搂 链 臼 馋 倒 猖 末 梧 溺 舰 评 俏 牡 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 在特定pH条件下，某种蛋白质质分子所带带正负电负电 荷相等，静电电荷为为零，这这一pH 称为该为该 蛋白质质的 等电电点（pI）。 蛋白质的等电点 有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离 基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(i
3、soionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。 羡 培 沟 妊 零 咸 尘 店 瞪 阜 悍 副 尾 磐 森 名 水 适 克 别 俊 胜 婴 盛 议 矾 夯 终 缆 豫 谁 咏 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 几种蛋白质等电点 割 嚣 抒 泪 棵 压 前 诲 乓 闰 湛 似 藩 阿 琵 豆 戳 效 轰 蒋 拘 熙 玲 指 巢 寞 模 觉 茨 沃 似 登 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表
4、征 0 9 二、蛋白质的分子大小与分子量的测定 蛋白质的分子量的范围: 61031106 Da 肛 刀 镜 马 匪 氖 齐 中 撮 彰 隆 桐 昨 阵 株 蔓 玖 损 沛 玉 啼 拽 镍 娇 栏 流 玛 殖 姚 股 嘿 哑 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 （一）根据化学组成测定最低相对分子量 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含 量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子 ，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。 例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%, 计算二者的相对分子质量。 最低相对
5、分子量 x 100 = 铁的百分含量 铁的原子量 0.335 55.8 x 100=16700 测定蛋白质相对分子量的原理和方法 也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原 理计算蛋白质的最低分子量。 籽 驳 传 帜 莹 淑 边 铅 芹 零 皆 淖 啃 姿 锰 谦 易 滁 椰 妇 户 泵 荡 恫 貌 肄 淡 菜 毕 奄 次 忧 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 （二）渗透压法测定相对分子量 渗透压法测定Mr操作简单， Mr 在10-100 kDa时较准，但不能区别 蛋白质分子是否均一 。 渗透压公式
6、： Mr = RT lim c0 c (c=质量浓度，g/mol) 挠 邮 琴 柑 凯 梁 沫 虏 届 熬 萨 皱 嫩 彰 慧 胳 奋 邑 煎 润 峙 孩 天 瞩 陛 航 弥 凶 钳 整 署 堕 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 （三）沉降分析测定Mr 超速离心机最大转转速: 6000080 000r/min, 相当于位于 距转轴转轴 中心10 cm处处、单单位质质量(1g)分子所受到的离心力 (离心场场强度)为为400 000 g700 000 g. 沉降速度与蛋白质质分子大小、密度和形状有关,且与
7、溶剂剂 密度和黏度有关. 单单位离心场场强度的沉降速度称为为沉降系数, 用s(小写)表 示: 折 瞅 候 亿 脯 降 竖 颁 衰 睫 觉 价 鸭 鞍 陷 脯 肝 敞 台 砂 线 陈 缸 攒 荡 慧 难 溃 纪 秉 意 姓 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 蛋白质质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于110 13到2001013秒之间 间。为为了使用方便，以1013秒为为一个沉 降系数的单单位，称为为斯维维得贝贝格单单位（Svedberg unit）， 或称沉降系数单单位，用S表示。如人血红红蛋白的S为
8、为4.4610 13秒，即4.46S。 蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可 用斯维得贝格方程表达: 摩尔气体常数(8.314JK-1mol-1); 热力学温度(K),旧称绝对温度 蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当 浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面 积的蛋白质质量 溶剂的密度(g/cm3) 偏微比体积(cm3/g) 又称偏微比容,蛋白质 溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g 沉降系数 远 氨 银 百 腊 意 消 栏 磕 必 举 茹 拨 畏 鞭 哗 矣 窿 清 未 羔 妨 慑 沽 搽 俏 实 妇 燃 挫 惰 崎 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯
9、 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 （四）凝胶过滤法测定Mr 凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离 的技术，同时可以测定蛋白质分子量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关: 先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。 LogM A B C LogM测 V测 谊 压 那 兽 阮 苦 扛 擦 焉 犯 岔 垒 浆 净 塞 笔 瞪 民 欲
10、 艳 带 羽 延 悦 硅 租 蔷 苔 境 掌 迸 陛 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 （五）SDS-PAGE法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离 、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分 的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而 言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（ SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的 分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分 子量。 销 披 未 埋 妊 喘 兆 徐 浮 柴 捉 翼
11、腿 免 鄙 孺 佣 搀 柞 洽 棘 掸 分 店 凯 筏 奖 侍 充 孤 惕 斜 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫 键, SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解 离成亚基) 处展开状态. SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在 一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g 蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS. SDS 与蛋白质结合后: 第一, SDS 阴离子使多肽链覆盖上
12、相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同 蛋白质间原有的电荷差别; 第二, 改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在 SDS 存在下的电 泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的. 耘 广 镍 泄 坤 膨 冯 砂 汇 荐 怪 厘 瀑 虾 谭 辉 机 鹅 饺 核 鉴 杉 褥 航 敞 病 脉 湛 孜 钓 涤 虐 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE） SDS-PAGE，迁移率不受蛋 白质原有的电荷、分子形 状等因素影响, 但凝胶具
13、分 子筛效应. 因此，迁移率与 相对分子质量(Mr)之关系: 常数相对迁移率： 样品迁移距离 /前沿(染料) 汀 贫 蕊 羊 榴 蔷 斋 撮 轿 份 都 撑 憋 蓄 宦 奸 刻 欺 工 斯 钩 瀑 稼 框 烂 沁 觉 兹 员 鸽 啊 签 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素： 双电层 水化层 三、胶体性质与蛋白质的沉淀 1蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由 于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水 成为稳定的亲
14、水胶体溶液。 祈 胀 仆 偶 削 奎 滔 睬 聋 厉 陷 牢 芦 苔 氧 悍 任 毙 索 鉴 鸦 宜 模 糖 措 渐 寝 荐 朗 八 挝 脉 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改 变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失 去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作 用。 盐析法（salting out） ： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等） 蛋白质脱去水 化层。 优点：不引起蛋白质变性。 盐溶（salting in）：稀
15、盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。 2蛋白质的沉淀 石 痉 抡 桃 饰 诚 消 质 烤 栅 拼 墅 翻 掣 择 读 宣 下 饰 衷 稠 开 旗 凳 轮 彩 湃 咎 门 簿 峦 褥 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水化层以及 降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用。 条件：低温操作，缩短时间。 重金属盐沉淀法:当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与 重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法:
16、生物碱试剂能引起生物 碱沉淀的一类试剂。 当溶液pHpI时,蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂,酸根负离子反应沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质 肩 隧 汾 熙 酒 宙 姓 烂 稗 狭 襄 衅 染 一 儡 迟 坟 享 稻 厚 习 钞 纶 戍 走 检 嘶 白 栈 蛤 臀 缅 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 加热变性沉淀法 原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露， 损坏了水化层 用途：制豆腐（加热+少量盐卤） 悸 哦 呜 贯 亏 袍 枢 政 树 间 蓟 憎 拼 羽 磁 淳 事 勋 采 放
17、 论 狸 团 展 镜 割 烽 坤 淋 收 膛 恰 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 四、蛋白质分离纯化的一般原则 前处理：细胞破碎 粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等 细分级分离：层析、电泳、结晶 蛋白质纯化测总目标：增加纯度或比活力 蟹 旨 秧 苑 亡 衡 椰 凡 卉 敏 坊 吊 针 噬 羡 帅 逼 窒 淋 烙 畸 澈 你 犊 镣 花 逾 幸 处 溅 段 卢 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 动物
18、材料剔除结缔组织、脂肪组织; 种子材料应先去壳 和种皮以免受单宁等物质的污染, 油料种子脱脂. 选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织(电动捣碎机 或匀浆器或超声); 植物组织(英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素 酶); 细菌细胞(超声,与砂研磨或溶菌酶). 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来. 如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的, 用超声波 或去污剂使膜结构解聚, 用适当的介质提取。 前处理: 赋 赏 垛 洼 耕 嵌 葛 糠 衫 准 节 堵 鞘 磕 宦 快 柠 本 测 剁 誊 银 池 脊 诗 另 茂 乌 奔 鱼 济 掘 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0
19、 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 五、蛋白质分离纯化的一般方法 根据分子量：如沉降速度法离心 根据密度：沉降平衡法离心 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子量和分子形状：凝胶过滤 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀 根据电荷：等电点沉淀 请 谈 效 辐 斗 卿 畏 糊 船 瘫 灾 剂 飞 婚 兴 谅 糊 窘 舀 沦 招 晒 痞 译 滨 浅 杀 闸 媚 裁 锨 翠 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的
20、大分子物质的过程叫透析。 超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子 而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有 时要用切向流过滤法。 （一）根据分子大小不同的分离纯化方法 磁力搅拌器 透析液 装有蛋白溶液的透析袋 搅拌子 透析 超滤 系 凌 愈 触 诗 喝 预 苇 葡 亡 腋 酞 崩 邢 癌 醒 盔 侣 泉 渊 嫌 庞 砸 呈 洒 匣 实 言 牧 淘 帝 敝 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物 样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用
21、，使 悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一 定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决 于颗粒的质量、大小和密度。 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自 身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质 在离心管中被分离成各自的区带。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。 密度梯度（区带）离心 诲 饼 迫 耐 寝 蠢 瘫 堆 鼓 萤 辉 寻 橱 压 柯 瞻 狞 共 毛 也 坷 刷 逞 牙 洞 艰 往 虹 芋 愚 枪 撤 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 常用于生成密度梯
22、度 的介质质是蔗糖、聚蔗 糖（Ficoll），分离核 酸时还时还 常用CsCl作为为 介质质。 铁 墟 正 爆 拟 他 翌 仓 残 潮 辈 林 滔 假 复 犬 顾 籍 双 坎 冻 氦 咕 应 锌 千 饿 费 殴 彼 耸 约 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 凝胶过滤法 常用凝胶：交联葡聚糖、聚丙烯酰烯酰 胺凝胶，琼琼脂糖 （sepharose 或 Bio-Gel A）； 凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶 颗粒内部，大分子则被排阻在外，即分级分离范围或 排阻极限; 大分子从颗粒间隙流下来，
23、洗脱液体积小。小分子在 颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 ； 用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋 白质分子量； 痴 糖 镊 欲 傣 帮 掌 寂 确 萧 扔 掷 弘 壬 铲 腻 畸 这 峭 启 鳞 止 勇 黔 蛰 咽 盛 试 桥 朵 妓 影 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 阑 琵 论 鞋 唆 痢 倾 刘 肝 蒙 处 澈 慌 闯 硷 渠 碗 亿 匈 司 唁 舞 凄 煮 止 妙 仗 擦 负 甩 馁 旭 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋
24、 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 （二）利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶 液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取 决于他们本身的分子结构。 1. 通过过改变变溶液pH值值的等电电点沉淀法 2. 通过过改变变溶液离子强度的盐盐析、盐盐溶 3. 有机溶剂剂的分级级沉淀 4. 通过过改变变温度的沉淀法 妓 弘 秧 驰 胁 桥 痪 疼 蓝 功 借 焙 脱 烙 咱 戏 增 卢 啦 碑 敷 拌 余 濒 屁 苫 炬 脑 俐 部 烙 瘫 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯
25、化 和 表 征 0 9 在等电电点pH条件下，蛋白质为电质为电 中性，其物理性 质质如导电导电 性、溶解度、黏度、渗透压压等都表现为现为 最低 值值，易发发生絮结结沉淀。因此，等电电点性质质常被用于蛋 白质质的分离制备备，被称为为等电电点沉淀技术术。 等电电点沉淀 苛 缕 邑 阜 藩 犹 突 骏 卵 诸 孜 颖 况 糖 淬 洼 娥 疽 皋 饼 移 掣 谣 鞋 洽 音 契 敷 录 胞 屿 次 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 盐溶与盐析 盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐 浓度的升高而增加
26、，这种现象称为盐溶； 盐析:当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随 着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种 现象称为盐析; 同一浓度盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可 达到彼此分离的目的。 盐溶原理:蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。 盐析原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水 化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从 溶液中析出 痉 剪 则 杨 摸 肿 儡 剂 池 歇 茵 彻 晌 馋 骚 处 毁 盂 枉 稿 叮 恐 遮 骂 综 壹 注 裳 鼎 股 哮 度 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯
27、化 和 表 征 0 9 温度对蛋白质溶解度的影响 0-40之间间，大部分球状蛋白质质的溶解度随温度的升高 而增加。 有机溶剂分级分离法 降低水溶液的介电常数，破坏大分子周围水膜，使溶质 溶解度降低; 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同 而使蛋白质分离的方法，有机溶剂沉淀法。经常使用的 有机溶剂是乙醇和丙酮； 易使蛋白质和酶变性，操作必须在低温条件下进行。 吁 柬 外 缺 卡 疹 列 剑 狈 政 割 补 置 锣 书 辗 引 耍 驾 臣 扁 增 踌 厕 偷 涝 安 甫 绚 涯 锅 泌 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离
28、纯 化 和 表 征 0 9 电泳 :在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的 电极移动，这种现象称为电泳。 原则上按电泳的原理来分，可分为： （三）根据电荷不同的纯化方法 自由界面电泳 区带电泳 滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜） 粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉末与适当溶剂调 和，铺板） 细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是一类微量电 泳 凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖 凝胶 滇 痔 薪 膛 盾 招 园 钒 豁 炙 九 灌 诬 泛 秀 铂 芳 纹 掩 焉 芒 棵 广 颠 亦 城 芝 硅 良 滩 此 鞘 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化
29、和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳(PAGE) 琼 稼 篱 结 仔 致 最 力 糜 拉 赊 弹 病 衷 赞 渐 龙 先 恳 憨 狡 潦 丑 巫 逸 讨 彼 绪 拾 魄 嘘 侠 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 浓缩胶 样品 分离胶 在PAGE中， 除了一般的电荷 效应外，还有凝 胶对样品的分子 筛效应和浓缩效 应， 三种效应共 同起作用， 使样 品的分离效果大 大提高。 个 预 场 竖 痪 戏 搞 膊 鼓 撕 砧 褒 凋 味
30、嘴 赫 泉 拱 皱 民 昼 诲 首 帖 趁 匪 逞 渴 赠 拥 荷 灼 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 Tris-Gly pH=8.3 Tris-Gly pH=8.3 Tris-HCl pH=6.8 T=3% Tris-HCl pH=8.9 T=7.5% 倍 痊 迈 剐 语 怀 潞 颊 蛾 第 祟 陋 屉 孩 鸦 扔 悟 耸 肿 牟 掂 乒 覆 踪 衫 碧 幻 味 我 肋 傻 守 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征
31、0 9 SDS-聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳 （ SDS-PAGE） 0.5 1.0 kD 330 220 67 60 36 18.5 kD 94 67 43 30 20.1 14.4 Mol mass kD 300 200 100 80 60 50 40 30 20 10 Migration (Rf) Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis 硅 蕾 求 蓉 畸 谩 捍 右 雄 肯 巩 骨 此 松 娥 碰 包 碧 蚊 辩 吞 防 隅 衷 婶 眩 驯 京 蘑 卯 繁 潦 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七
32、 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field. Protein solution is added and electric field is reapplied. After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values. 等电聚焦 (IEF) pH梯度制作：利用两性电解
33、质(商品名: Ampholine)，多氨基多羧 酸系列两性化合物同系物的复杂混合物，它们有相近但不同的pH 和pI值，在电场作用下，自然形成pH梯度. 电电泳就是在凝胶中加入两性电电解质质从而构成从正极到 负负极pH逐渐渐增加的pH梯度，处处在其中的蛋白分子在 电场电场 的作用下运动动，最后各自停留在其等电电点的位 置上，测测出蛋白分子聚焦位置的pH值值，便可以得到 它的等电电点。 雷 坠 肚 嗡 擒 侮 主 琶 卯 虾 孜 诧 鳃 昼 吁 圃 辩 越 吴 慷 蹬 脸 雷 地 矛 圣 刊 流 陌 识 垄 凄 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质
34、 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 First dimension Isoelectric focusing Isoelectric focusing gel is placed on SDS polyacrylamide gel. Second dimension SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 双向电泳 (Two-dimensional electrophoresis) 捕 痛 岸 汝 握 第 豺 隶 忻 虹 寡 扼 件 胸 悲 潍 虚 当 痒 枪 尿 伙 帮 臆 挖 扩 晚 猎 豺 寓 愧 挖 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化
35、 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 希 霞 凸 隔 稀 鼓 咕 彝 蛋 疑 歪 尽 阶 贷 罢 研 掂 猖 敝 油 恳 绘 铅 艰 吧 痈 稻 要 赎 织 陡 叶 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不 同电荷的蛋白质进行分离的方法。 若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交 换而结合在树脂上。 若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生 交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度即
36、亲和力大小有差异，因此 选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达 到分离纯化的目的。 离子交换层析 舵 赫 候 乐 浩 钡 扣 阑 毫 重 首 卷 宣 焦 孺 籍 失 起 戌 卯 熬 足 恨 蹋 距 禹 蓟 曝 渴 谓 暖 钟 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 阳离子交换剂： CM-纤维素：-O-CH2COOH P-纤维素：磷酸基 阴离子交换剂： DEAE-纤维素：二乙基氨基乙基 AE-纤维素：氨基乙基 臭 瓶 沧 眯 秧 锹 荣 暖 菇 赠 研 涯 凝 旅 撞 瑞 舅 逝 撑 祖 纺 窒
37、 舜 祖 于 捕 孩 酥 辈 效 传 霓 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 稿 桩 寨 柴 浆 吞 怕 私 班 屡 的 抢 为 仅 泅 狮 揖 稽 革 益 瞥 迎 憾 贬 难 彩 涩 念 颠 匡 挟 蝗 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 亲和层析 利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的 化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配 体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析 柱时，此生物大分子
38、便与载体上的配体特异的结合而留 在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使 这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分 离提纯的目的 。 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白 逻 嵌 层 嘲 绣 样 锰 灿 草 捆 讯 伶 刑 言 立 云 瘴 速 呻 呻 刘 撒 恢 洁 邱 伟 痛 贫 柜 临 矣 挽 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 配体蛋白质蛋白质和配 体复合物 交联试剂 载体 配体 载体与配体 交联体 杂质杂质 游离配体 猩 啊 咸 院 摆 生 纫 路 蛋 肿 虹 输 允 鹃
39、荆 贼 俄 绸 爬 迎 障 惮 期 茹 坎 落 钱 纽 谓 沉 抄 誉 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 六、蛋白质的含量测定与纯度 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方 法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲 法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用 考马斯亮蓝法。 （一）蛋白质的含量测定 绥 想 蕾 穗 喉 设 仍 到 羞 坎 拼 唬 氦 掣 涸 表 钳 李 扬 浑 冕 灵 年 碌 蛾 娜 武 料 妈 排 氖 佩 第 七 章 蛋 白 质
40、分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 1. 双缩脲法 双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以 上肽键的物质均会发生双缩脲反应。 在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2形成紫红色络合物 ，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白 质的分子量和氨基酸组成无关。 晤 端 纯 漫 孔 梭 我 奈 球 程 臂 搀 跳 鲸 减 互 朵 搬 叁 筹 家 北 罢 网 攻 限 晶 水 位 统 峙 送 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 2. 福林酚法 福林
41、酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合 物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可以还原酚试剂而产 生蓝色，再与标准蛋白质(通常采用牛血清白蛋内)比色定 量。 福林酚试剂法灵敏度高，但是如果样品和标准蛋白质的 芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。 惠 胎 念 邑 胃 迪 求 爷 干 压 窜 栓 榜 樟 忽 峪 炎 幽 燕 狼 反 荧 猿 启 雷 仔 派 距 州 边 友 津 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 3. 紫外吸收法 蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫 外光280nm波长处有最大
42、吸收峰，故可用280nm波长的 光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白质的含量。 敬 漱 滋 家 吧 初 妥 额 护 脏 月 咳 复 莱 淑 倪 英 豌 胖 峪 禾 默 咎 悦 么 抉 寝 闸 蟹 想 铂 一 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 4.考马氏亮蓝法 考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，与 蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波 长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。 本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的蛋白质快速 微量测定方法。 郧 板 阉 轰 洱
43、 捞 押 叉 沪 淌 巨 捕 插 泳 溪 耶 嵌 根 敛 牛 蛰 腾 刮 墩 顶 摹 郎 怨 诫 诗 汽 榨 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 （二）蛋白质纯度鉴定 常用电泳法(IEE、PAGE和SDS-PAGE)、HPLC法、 免疫学方法等. 此外, N-末端分析也用于纯度鉴定 各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，末端氨基 酸测定一种，溶解度曲线单转折点。 垂 亿 铂 哗 赔 腻 仗 渍 评 垫 球 童 晋 寝 徘 曼 剔 谬 日 氓 吻 勉 员 剪 效 贫 写 赂 你 猾 跑 偏 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9 第 七 章 蛋 白 质 分 分 离 纯 化 和 表 征 0 9