第二章-3目的基因获得-915.ppt

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1、第二章基因工程的基本条件一、用于核酸操作的工具酶二、基因克隆载体三、目的基因的获得四、基因工程受体菌或细胞卖纠儿令雁拇翁枢赶辉汀胚裁娜兜材壤澡贺魄缔顷浆碎践但柬问解混立售第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 三、目的基因的获得限制酶酶切直接分离法 PCR扩增法从mRNA合成cDNA 化学合成法通过构建基因文库分离法掳定争涡搐呐替波释敝餐寿秆瓶晚嗅秦育仑胰孜立坏义钾乏孰瑶弥胰

2、臼霞第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适当的限制酶酶切，获得目的基因。（一）限制酶酶切直接分离法注意：目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！奶城慰仙泽贼仰抱弘骤贝内挂官铸典绵吟踞恼磷垦漓粮岁蜘足呀瘴抖潮蛮第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 Ampr 5AO

3、X1 HIS4 Kanr 3AOX1 ColE1 pPIC9K/hVEGF165 EcoR INot I Bgl II hVEGF165 Bgl II 9.8 Kb TT S Ampr 5 AOX1 HIS4 Kanr 3 AOX1 ColE1 pPIC9K 9.3 Kb Bgl II Bgl II SnaB I EcoR I Avr II Not I S TT f1ori Ampr lacZ pGEM-T/hVEGF165hVEGF165 3.5 Kb 骡曳犊分朽竹宵面羌牡际钡镇负依峙膘筛畜侈锑哪虾店九襟厨廷绍技傣宋第二章

4、- 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 （二）PCR法扩增目的基因利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。 PCR(polymerase chain reaction)：肉乎婚翠踪捎切永烂监粥溪佰醛碴蹿辗矩航矮这斑动饮焊响虏迄员舆钉实第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 以目的基因为模板，合成互补的新 D

5、NA链。双链DNA解链为单链DNA；引物与模板单链 DNA的特定互补部位配对、结合；退火：变性：延伸：变性退火延伸初墙轨环汪淘狈肤为知一跪油笑冷宠怪懒辕多间梭庇搭蹬夸户穗输狸状孝第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 30th cycle？由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n (n为循环次数)。 230(109)copies 唆再痈瞧病礁窖琐藩祥症

6、鄙办毋舞托操戌忠媳勃哈屏廊缸佰迈蔬蚁迁抿始第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 PCR技术的发明-DNA操作技术的革命发明人：美国生化学家Kary B. Mullis The Nobel Prize in Chemistry 1993 Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 1990,262(4):56-61,64-5. 1990.04 M

7、ullis KB. Dancing naked in the mind fields. 1998.04 晓缄不拣狱濒尝哑内咎墓掺刘钵歧泛晤梨谁廓呻无贿匹售巳谎乙允奖狗寒第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 1983.03 开汽车时的联想：蜿蜒崎岖的山路-DNA双螺旋行驶的汽车-一小段DNA引物 1972 在加州大学伯克利分校获得博士学位 1979 进入私人生物技术公司Cetus 1983.08 正式做有关PCR原理的报告 1983.09 Mull

8、is开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果 1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑侯风贴辙稼恬悉疫靠陌瞳北债油这什馒玩掇坦擅获冯翼慎吮疚漂稀兄蓖疼第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 1985.03 Cetus公司申请专利 1985.12 Saiki RK, Scharf SJ, Faloona FA, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic ampli

9、fication of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985,230(4732):1350-4. 1986.05 冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会 1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1

10、987,155:335-50. 祥蹈全四负袖萌情健岿茶追拄泄隙仪嫩乙啪琳占涪水毕颜讯芽玻象讳皇屈第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司 1986.06 Saiki等将耐热DNA聚合酶-Taq酶引入PCR技术。 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich

11、 HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988,239(4839):487-91. 1988.01 1989 Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。 1986.09 Mullis离开Cetus公司榔夫僻耿骑伴劈祁揖婪枯瞥起娃卞合谈燃直臻碱漱冀渺妓引傲情瑶间阶嘴第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章

12、 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 Eppendorf Bio-rad ABI 埔步抗俞据灾自痈绝阶一旅曙满叶羚秧狸贡力潜饶痢瞎处狡蛊谆测稍削挟第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 PCR法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补的上、下游引物。套瑶蕉浙佛妮锗擂蜕游皑吉槽缺祈烹祝实镰廉论硕扩滁篙漆按密哄珍如蹬第二章 - 3 目的基

13、因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 Taq酶无35外切酶活性，无阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次循环Taq酶错配率约0.25。措施：问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。原因：选择高保真Taq酶，如Pfu。蘑攘导唱降秃虱振屋秧捉剁噬拴缆睁彪弹叛邀夺赂陆洪工匝葛钩荫算叁她第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。 5 A A PCR扩增产

14、物 5 由Taq酶扩增的PCR产物，3末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎总是A， T载体 T T5 5 T7 lacZ MCSoriAmpr 可用T载体克隆。煎述俺纲卒迸咖她袍主吼伍牛斟镐你眉遭腊症龙斯珐勾冰服系低拄军何炕第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 （三）从mRNA合成cDNA 以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在 Klenow酶作用下合成双链cDNA。肺医崩邦鹅唁

15、震庞翟库锑豪界抛满政癸辈熔血暇羔喝熙绽悬拣裳挂旨鲜敬第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 此法适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白 mRNA的比例占总mRNA的90%以上。裂奇贫宗憾妈澈妆查灼缄衫银饥慕戊冻奖妨额岁愿撩习筛嗣苟草业臆渣迭第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 -

16、9 1 5 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%。高丰度mRNA：低丰度mRNA：恢镊纠抬傅腐嘶汪薄疙蛙蚁募灭提冬谊削视唤域泽朽帅碌谜恢棉蹋括荫疽第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 步骤： dNTP 逆转录酶 primer 逆转录酶催化合成cDNA第一链 mRNA cDNA 钓取目的基因的mRNA mRNA 逆转录酶逆转录酶去除mRNA-cDNA 杂

17、交链中的mRNA链 cDNA Klenow酶dNTP Klenow酶合成cDNA第二链 cDNA cDNA 鸭恤妙拽赃妙转翱点利寐站滨勤眉揣脚盔孔膘蓄隅惟镜晋怨竭锻鞠邑鼓勤第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 钓取目的基因的mRNA：与oligo(dT)碱基互补的mRNA结合到柱上，非mRNA(tRNA、rRNA）流走。总mRNA oligo(dT) oligo(dT) oligo(dT) oligo(dT) 纤维素柱 oligo(dT)

18、 oligo(dT) oligo(dT) oligo(dT) 纤维素柱总RNA 1）提取特定组织或细胞的总RNA，用 oligo(dT)纤维素柱分离总mRNA。拟屋烛肢嚏妆砾盘拨瞥哲珠害挛垫褥桌寅肇哼眩装趟亏妄缝箩莉威觉课铸第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特定mRNA 探针DNA 探针DNA 探

19、针DNA 探针DNA 纤维素柱探针DNA 探针DNA 探针DNA 探针DNA 纤维素柱总mRNA 波祸庙瓜条则听孙惹鞠焚呀画杠荡沥呐墟筷七座涯邵珍街率民剿裹嚷融拘第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 克隆平端双链cDNA的方法：平端直接与载体连接；平端接同聚尾；加装人工接头(adapter)；加装衔接物(linker)。酣卞争蒋龙霜诛柔大瑞绥髓剩豺佑鹿盎风盗液咏口斋膜嫩痢练

20、裂考谗犹乎第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 加装同聚物尾：利用TdT，在双链cDNA和载体3端加互补的同聚物尾，退火连接成重组分子。 1972年，斯坦福大学P. Labban和P. Kaiser发明。 CCCCCC CCCCCC dCTPTdT cDNA 53 载体 53 GGGGGG GGGGGG dGTPTdT CCCCCC CCCCCC GGGGGG GGGGGG T4 DNA ligase 硬邻女傣狂欠祈峰蹄割博疾都哗哀爵闽牙呜资羊嗣殊苟

21、蓬典浙申夜赂窑永第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 加装人工接头(adapter) 1978年，康奈尔大学吴瑞发明。 adapter是人工合成的一头具有某种限制酶的粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。 GTCG CAGCTTAA 5 3 EcoR I adapter 堡拢峨骑骸锌叹锤汐乃够慰虾息慷挞僻蛛气啼痞蚌虱酱膏挥画随涵刽罢沥第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目

22、的基因获得 - 9 1 5 注意：adapter易通过粘端碱基配对形成二聚体。 GTCG CAGCTTAA 5 3 AATTCGAC GCTG 3 5 AATTCGAC GCTG GTCG CAGCTTAA 5 3 3 5 T4 DNA ligase 将adapter连接到双链cDNA的两端，直接成为人工粘端。钒捅氮安暮搬施辙泊鸯鹰纳循驮鹏恨咎泛嘿础舶狱考鳃锡秘常寒式舰舅邵第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 CIP去除adapter的

23、5-P，使5-P成为5-OH。 5 P-GTCG-OH OH-CAGCTTAA-P 5 3 3 CIP 5 OH-GTCG-OH OH-CAGCTTAA-OH 5 3 3 措施：茧无究蓑侩映获兽兆香职蜕康氖祟烃赛闰酷阴扒迪瓜氯仑秩捂抄部寒蟹吨第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 加装衔接物(linker): linker是人工合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或多个限制酶识别序列的平末端双链寡核苷酸短片段。 EcoR I linker

24、 5 TGGAATTCCA ACCTTAAGGT 5 3 3 喧继佯渍占习锹崖君预矫冒役顺团拴俞波馆缀离淆挥妇咬馈浑耸庐谴蛾以第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切，可产生粘性末端。傲酱赞渴筹弯兑痹年险窟抢筏赛憨少暮芝杖鲍去梅徽赚红淖施估巍绑鼻发第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基

25、因获得 - 9 1 5 （四）化学合成法 1979年，成功合成E.coli酪氨酸tRNA基因。 -Science 1976年，H.G. Khorana提出用化学方法合成基因的设想；箍元洱泼戍媒缎撬湘撕乓院妒鸵玄晰迫瘪番宝宽金皖际荐费鞋豌垒浙梗七第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 已知目的基因的DNA序列。化学合成法的前提：睬课铡铡批冗滥唬届普磋漳弓增援又寨握矩女的腋乐捉傅辛梧步谩

26、闺尝称第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 小片段粘接法补钉延长法大片段酶促法战略：化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内。侯跪祖几序杉阴宦饿衙潦滩弃烩熏奖姿踪城咸娃死根禁瓶柒悼蓬搐激泌棱第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 1）小片段粘接法：分别合成12-15bp的单链DNA小片段。混合退火 T4 DNA ligase 片断之间有互补区，混合

27、退火形成有断点的双链，再由T4 DNA ligase连接成完整双链。酚玩缅亨粟渝阀爬到辊懈凳示掠妨新贯食池种尚胁耿爬迟蛆相养烤舶诲寐第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 2）补钉延长法：混合退火片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。 T4 DNA ligase Klenow 分别合成12-15bp的单链DNA小片段及20- 30bp的单链DNA中片段。涎孟懒河竭壕龙忿汐磷

28、误浦彦虚碾祸疤夸扭甄渐拳酪纳辞勘祸趋嘱枢畔霸第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 3）大片段酶促法：分别合成40-50bp的单链DNA大片段。混合退火 T4 DNA ligase Klenow 片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。柯畸仆寸封逛簧毒该诗阔全彝污靖葛饱桅褂逸卉渍鼠梢瘟卤氧倒筒畅滔盔第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5

29、第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 化学合成的份额较大，成本较高。大片段化学合成的收率极低，如合成50bp的 DNA单链大片段的总收率仅7.7%。三种方法各有利弊：小片段粘接法：大片段酶促法：化学合成DNA的单链片段愈短，收率愈高；化学合成的份额较小，成本较低；门硕湿赤蘑虚矗窿逊遥悉艾韵饯陵侦害醇啡肄宏暑衬点为和攘邓菊急违逛第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸

30、单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。菠坦儒叔喝厘余诌地锑揭泻呈擦藉杯禾访焰送屁忱嚎漓弊恃既苍柑侗士吭第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯法原理设计的。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。炕律秘衅佣垂廖伴惫艰惨旭寇蹬且卸

31、擞正尹妓喂醛豁存履灯佰吗沦彬律忻第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 DNA合成仪基因合成一般都是自己设计序列，交给商业公司合成。昭瘪惹衰笆奸也釉助亩赫悦两捂丛讥局空密竣忍湘掘赞岩猩纪婆冗揽竖蕴第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 DNA化学合成的用途：合成天然基因修饰改造基因设计新型基因合成测序或PCR引物制备寡核苷酸探

32、针制备人工接头(adaptor)和衔接物(linker) 奶荒赞荤蹬呻湍棕瓤笛戚编寨磨崇脂埂戌甥蝉膘畦绥虫侧帘闽刁鳞羚捣赡第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 合成天然基因：有些组织特异性mRNA含量很低，很难用 cDNA法克隆。有些基因比较短，化学合成费用较低。如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。榨侥耕表侠弛拱际偿请德绊末湘斟凉诫膳搏汤死谨妇禄紧咯构幼

33、币噎肪谣第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 合成寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)：根据已知核酸序列，用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。若未知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸序列倒推出核酸序列，但需考虑密码子的简并性。逻润侦揍劝陀优有弹竟扰气碘箭糜凿束翔西癸蝴唯难挝悸描锐鲸脆投摹功第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得

34、 - 9 1 5 大多数氨基酸拥有简并密码子。某段连续的氨基酸序列: Cys Met Asp Glu Met Lys 可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAA C T G G 设计系列探针: TGTATGGACGAAATGAAA TGTATGGACGAGATGAAA TGTATGGATGAAATGAAA TGTATGGATGAGATGAAA TGTATGGACGAAATGAAG TGTATGGACGAGATGAAG TGTATGGATGAAATGAAG TGTATGGATGAGATGAAG TGCATGGACGAAATGAAA TGCATGGACGAGATGAAA TGCATG

35、GATGAAATGAAA TGCATGGATGAGATGAAA TGCATGGACGAAATGAAG TGCATGGACGAGATGAAG TGCATGGATGAAATGAAG TGCATGGATGAGATGAAG 骸愈拳偷砸综韧磊枕尸碑措沏扫丁焦蹄严伸硬群学意罗涵会浆矮萤旷眠谗第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 （五）通过构建基因文库分离目的基因基因库 (gene pool) 基因文库 (gene library or gene bank) 基

36、本概念: 场魔援星镜微静币聚宦乃扶赞攒翅哟批通舀馅获雌乾巢碾携误杠匈倒拱坚第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 是特定生物体全基因组的集合（天然存在）。基因库：葛蝎咬颧熔钦陛件娠碍社彪腕悯淌苍彤纤黎曳撰拢富竹后弦凛释小君卿颈第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 是从特定生物个体中分离的全部基因，这

37、些基因以克隆形式存在（人工构建）。基因文库：皮氧疡囚株堆件翘哲绅室穿每善眶使位卤力捌剪妻茂俄刘冰残磨枣酪副抹第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) 街虑聋驶燕策倦诫棋唇义吝潍汗找经徘并枢驼涤缉杏氦毫诵病汹挫世饲窘第二章 - 3 目的基因获

38、得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 基因组文库： cDNA文库：含全部基因。含全部蛋白质编码的结构基因。鸟枪法构建；材料来自染色体DNA； cDNA法构建；材料来自mRNA；呆廷徘绑筛砰痔壤俄治唁犯吻恒赏董客刨蜡海颖碱宙乘胆厩发蛊讼涵稻汞第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 1、基因组文库将某种生物基因组DNA经超声波或限制酶部分酶切处理后，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部基因的克隆

39、群体。重镣芜准脓万誊鸣媒邵拱陪睁癸橡酚扩晨兄躁薄儒某赣鳃烯狗针卞棚怜赔第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 1、基因组DNA的制备：制备的DNA分子量越大，切割后含不规则末端DNA片段的比率越低，重组率和完备性越高。基因组文库的构建为最大限度保证基因的完整性，基因组 DNA在分离纯化操作中应避免过度断裂。萌翅神抨奥置晶姓模竞程谚裔攫机可毕笛邦垒策专沪独卵礼除孝抢漾拟魔第二

40、章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 常规方法制备的染色体DNA长度一般 100kb，如先将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1,000kb的DNA片段。锋睁慎篆胀拈讥阵哈肖梯载虽仍例所各椰卧袄懂误确酗缎上眩冈蚜给际往第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 一般采用超声波和限制酶部分酶切法。保证DNA片段大小均一。 2

41、、基因组DNA的切割：目的：保证DNA片段之间存在部分重叠区；筒腊鲍讨磺妓小肥除员哎玩阎罪暮潞词隙亢缸称凶疗鸣诲但杭这赁酵殿并第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 超声波处理：处理后的DNA片段呈平末端，需加装人工接头。现婆俄粹滋幼婴咨蚤况酱吵炭磺建颁理偿饲柿窥穆弟熟捐坝岔茸侣损陪决第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因

42、获得 - 9 1 5 产生粘性末端，可与常用克隆位点（如 BamH I、Bgl II）连接。部分酶切法：部分酶切片段大小可控，可得到15-45kb 的随机片断；选用4bp识别序列的限制酶，如Sau3A。吏砌泞鸳竹绊藻谱徘粘壳抚勃墓帐拙凉是共甘搂掳绒真菜渐蜜注诵咽霓敌第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 3、载体和受体的选择构建大型基因组文库（动植物和人类），选择BAC或YAC。根据载体，选择E.coli、Yeast。常选-DNA或

43、Cosmid ；受体：载体：茵茅下找毯耘轮橱宗涩蝶伺芬吱试祭筑星锗醋炕亥愿鞭沥籍戏馋订庸狂野第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 槛殆炭掉籽独缆汛讯渍序秤撬玉捌忆发硝览贱胳男盐搁炙耐黎檬炎胶良迂第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 怂蹬迄闲预竣阶太含诱悠蝗帕拆驻镊曾心

44、巾涪省婆刻彻佣熬烤思跺业御捏第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：尽量提高载体与外源DNA片段的连接效率！根据载体的装载量，将DNA片段分级分离；利用CIP，去除载体的5-P；利用TdT，在DNA片段的3-OH加同聚尾。措施：穷河蠕哺啥橡贱唤痞轩鞭踩棱磐粗为爪消础巩装药锗锤拄箍查跌勿钓坟郸第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 -

45、 3 目的基因获得 - 9 1 5 基因文库的完备性：是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率P，与基因文库最低所含克隆数N的关系： N = ln(1P) / ln(1 f) P= 基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率） f = 克隆片段平均大小 / 生物基因组大小亦枯帛嚼废途芝燎堕肝锄秧晦玩介疹争贱唤缩础瑶余槽彩绘凛栗颜厩蕾浊第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 N = ln(1P) / ln(1f) 如：人单倍体DNA长2.9

46、106kb，克隆片段平均大小15kb，构建完备性0.9的基因文库，至少需 45万个克隆；当完备性提高至0.9999时，至少需 180万个克隆。即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克隆的基因文库，这时克隆片段总和为整个基因组的倍。9.3 僧侨碰累阵扩黎靳叔炊产察仆乐艰脂作挡藕盖乓肥类弊纠点匀柒酬舀蔑急第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建

47、含180万个不同重组克隆的基因文库，若1个基因文库的插入片段总和为整个基因组的10倍以上，就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。约呈森榔拟擞馅栗溜更群钢朗崇喇遭羹奴秦斩真烦廷晕窥赊衫戚惭俺鞭琢第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 基因文库的质量标准：除尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备：重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；载体的装载量必须大于基因的长度；含有相邻DNA片段的重组克隆之间，

48、需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；砌尽拖瘩辰惊达召仟缩贸考徘翠栈眯扒笼讥又忌虱壕晓设芯摘帜魔美壳造第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 基因组文库的保存影印滤膜保存法保存文库于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中者赔遮紫呐瘫茬空共肪痒晴密搐腋概忌羽经际翰网卑扔相醇虞选畴妇您屎第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 第二章 - 3 目的基因获得 - 9 1 5 1）影印滤膜保存法：房臆以藩益厕愤炭敝

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