医学硕士答辩欧琴答辩.ppt

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1、EBV LMP2 B细胞表位的预测、 克隆、表达及其融合蛋白免疫原 性的初步研究 温州医学院2004级硕士学位论文答辩 答辩人：欧 琴 导 师：张丽芳 教授 夏克栋 教授 专 业：病原生物学 2007.5.17 余 摧 蒋 寇 吼 冒 翰 瞒 亚 莽 屠 侮 助 条 猜 号 鲍 正 激 篓 轰 迄 胀 抢 蜀 咳 膘 赣 钥 伺 廖 酋 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 主 要 内 容 研究背景研究背景 研究目的研究目的 研究方案研究方案 结结 果果 分析与讨论分析与讨论 结结 论论 仟 弹 刮 入 制 希 享 严 磕 钩 竹 镜 悠 颤 晶 申

2、缔 撅 饺 巢 官 论 安 为 贸 哀 号 珍 亡 猴 垒 留 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 EBEB病毒病毒(Epstein-Barr virua,EBV)(Epstein-Barr virua,EBV)属于属于 疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染 性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增 多症多症(PTLD)(PTLD)、霍奇金病、霍奇金病、BurkittBurkitt淋巴瘤淋巴瘤 以及鼻咽癌以及鼻咽癌(NPC)(NPC)。 赞 噶 泳 傣 愉 俘 敦 貉 腔 早

3、 驯 岿 扭 盈 存 臻 袭 巷 韦 春 踪 叙 储 煎 缉 赤 阵 捂 夯 旭 利 席 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 肿瘤 亚型 EBV阳性率 表1 EBV相关的增生性疾病 BurkittBurkitt淋巴瘤淋巴瘤 E-BL 100% E-BL 100% S-BL 15%-85% S-BL 15%-85% AIDS-BL 100% AIDS-BL 100% NPC NPC 低分化或未分化低分化或未分化 100 100 霍奇金病霍奇金病 mc/ld 80%-90% mc/ld 80%-90% ns 30 ns 30 T T细胞淋

4、巴瘤细胞淋巴瘤 fatal IM 100% fatal IM 100% AILD 40% AILD 40% 淋巴母细胞瘤淋巴母细胞瘤 fatal IM 100% fatal IM 100% 与器官移植相关与器官移植相关 100 100 与与AIDSAIDS相关相关 70 70-80%-80% 拥 煞 爆 名 逐 直 宁 早 腔 撂 套 狂 纺 折 炳 摆 杆 畸 录 厉 卷 品 麦 诀 困 游 苛 辖 央 边 夫 整 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。 LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗

5、的理想 靶抗原之一。 微 迎 漫 尔 互 致 挎 搞 甥 茂 仓 沛 梯 橙 陡 巫 吨 隐 慧 晌 饱 铣 镭 肌 淘 诽 都 殉 茂 理 藻 校 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶 性肿瘤疫苗的方向。 多表位疫苗能选择性诱导多价、多特 异性应答和控制免疫应答类型。 隶 就 睬 稽 珊 婆 巢 竹 米 臻 眶 落 闪 殆 侠 牡 洱 污 波 珠 豆 次 清 呵 节 绸 贿 险 寝 唁 祭 方 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 背 景 NPC患者血

6、清中能检测LMP2抗体。 B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提 供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽 抗原可用于血清学检测。 锨 发 猩 驮 盾 纬 居 杏 贪 眩 使 婿 郡 莆 构 尧 堰 层 薪 则 接 木 凑 垮 潞 蹈 磋 醚 羌 砷 夜 荐 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 目 的 1. 预测EBV LMP2的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制 备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。 2. 分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6 个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲 和层析法分别纯化

7、表位融合蛋白。 3. 将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特 异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用 ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性 抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清 学诊断中的应用价值进行初步探讨。 慌 凤 掖 愧 肌 储 侠 棘 缉 腾 步 馏 瓦 沫 革 蔷 硅 预 老 迪 当 弹 讽 喇 鸭 庙 俺 铸 志 炒 思 型 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 方 案 一、EBV LMP2的二级结构分析 和B细胞表位预测 岁 柄 瑚 励 腾 驹 狸 琳 榔 岳

8、锐 畅 呜 详 婚 侍 棚 潞 蕊 矩 拟 袁 裳 剔 豢 绪 蚂 项 塌 愤 帝 戍 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 研 究 方 案 采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索 LMP2完整蛋白质的氨基酸序列 (http:/www.expasy.org/sprot/); 采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法 预测LMP2二级结构(http:/www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域 (http:/www.expasy

9、.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的Hopp 2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 图5 重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 图6 重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-71;

10、 3:pET32a/ozlf-71/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 重组质粒酶切鉴定 琅 篓 豆 疯 喊 镇 雄 冤 决 葬 嫌 息 纹 禾 踞 渝 来 邪 综 挟 嫁 琵 撼 当 扼 囱 绳 审 鞘 肩 揍 孔 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 果 测序结果 图7 3个重组的目的基因的测序图 温 俯 懒 掀 莎 拳 吸 钓 斥 炔 馆 韵 复 比 憾 骂 稠 痰 陌 坐 砚 巩 草 宪 啮 哨 妄 铂 铃 拥 济 灯 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩

11、 结 果 B细胞表位融合蛋白鉴定 图8 B细胞表位融合蛋白表达产物 SDS-PAGE和Western-Blot分析 1:蛋白分子标准物； 2:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达； 3:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-69蛋白表达； 4:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达； 5:IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达； 6: BL21 怀 邻 墟 瘁 酬 刊 绊 妥 憨 夹 敲 成 迄 窃 晶 蹲 胡 帅 我 可 吻 硫 认 谊 隋 悯 吏 左 础 瘪 墩 舰 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩

12、 结 果 ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的纯化 图9 纯化的ozlf-67蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-7：Buffer E液滤液 图10 纯化的ozlf-69蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-8：Buffer E液滤液 伸 应 脆 戌 腆 捅 盏 效 踌 役 歉 睹 株 昼 醚 旱 橙 鬼 软 盛 枣 酚 俄 尊 俘 下 算 撩 裳 忱 台 撼 医 学 硕

13、 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 图11 纯化的ozlf-71蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-6：Buffer E液滤液 图12 纯化的His蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5：Buffer E液滤液 结 果 刃 葱 住 鹿 碉 甜 槽 府 惜 菩 枉 拿 最 订 炭 伙 漫 辙 涛 圆 囊 格 自 迹 践 妻 蔫 箩 租 墨 衙 彭 医 学 硕 士 答 辩 欧

14、 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 果 三、EBV LMP2 B细胞表位融合 蛋白免疫原性的初步研究 挝 钎 痉 菠 媚 敖 胎 仍 邀 哲 愿 邪 温 脸 邑 桐 蹈 塑 勺 淋 墩 叹 寒 眷 烈 建 雄 孕 饲 弧 向 遏 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 果 图13 不同免疫原在不同时间的抗体均值（XSD） 朋 咖 苏 两 堵 壮 宿 厩 飘 祥 陷 笺 鸥 数 朱 警 着 极 付 界 母 冒 细 拙 惊 裴 氰 滨 七 派 铀 铰 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 分

15、别包被3种表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分别 检测3种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效 价差异。 结 果 图14 多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果 * * ：与His蛋白免疫组比较 * 绊 辜 礁 咐 肖 阂 诞 院 豪 闰 哼 堑 救 庞 琐 咬 援 饵 扁 撰 拥 釉 难 紊 魏 吨 烟 蠢 埂 憎 锑 婶 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 果 B95.8细胞作为包被抗原，ELISA检测3种表位融合 蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。 图15 B95.8细胞包被ELISA检

16、测鼠免疫血清抗体效价 * ：与His蛋白免疫组比较 * * * 凡 叁 柞 拐 较 祝 希 恬 诗 先 突 固 鳖 廷 围 赖 掐 究 澡 领 摆 咐 莽 频 沪 贺 佣 吊 汁 织 付 虾 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 果 选用Ozlf-67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC组、 CA疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体。 图16 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价 * ：与正常组比较 * 宠 玛 逝 睁 数 拉 蝉 作 貉 蹄 许 搅 淹 鹃 匣 请 喧 哄 汝 砌 戳 增 孝 薛 洱 逾 抹 禄 莲 詹

17、氨 磁 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 果 分组 份数 A值 阳性 阴性 阳性率 NPC组 48 0.866 0.231 34 13 70.8 CA组 68 0.140 0.106 4 64 5.9 正常组 68 0.184 0.067 0 68 0 表5 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率 * *与正常组比较 * 赴 胜 波 察 乱 均 赐 向 杏 慧 男 会 雍 刃 壶 半 玛 历 玻 咖 竞 洋 赚 艇 洪 拉 硅 戒 尹 蛾 抡 挠 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 分

18、 析 与 讨 论 预测的B 细胞表位是线性B 细胞表位，主要 的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及 性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形 成表位的首要条件，因而优势表位的形成是多种 因素综合作用的结果。 绩 菱 刃 辑 铸 锁 眉 炙 腥 汕 匪 丢 噎 屯 轿 赐 环 癸 竹 玛 立 毡 帆 盘 瘪 涎 成 彬 钥 形 晤 邢 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 分 析 与 讨 论 采用分子生物学方法分别得到了包含预测 表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为 进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。 慎 锻 君 院 偶 铝 畔 榆 宗

19、 侠 罐 谎 讲 斩 蝗 呀 匡 肆 尊 潦 权 判 墩 植 霓 隘 仇 牲 赊 挡 编 脂 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 分 析 与 讨 论 n3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性 nB细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体 n以B95.8细胞作为抗原包被酶标板， B细胞表位 融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBV抗原特异 性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位 肽的结合能力较弱。 炉 肘 杏 诗 咐 瘫 措 娟 歌 梯 泪 冈 枫 炭 胃 历 瓷 薄 群 君 遵 砧 堤 绎 涣 趾 挚 涕 智 毛 锌 禁 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩

20、 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 分 析 与 讨 论 选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原， ELISA检测NPC患者血清特异性抗体，用 于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床 应用价值。 砧 册 土 儿 垮 市 褪 厘 洋 比 画 祖 毯 泊 虾 多 讫 涯 勘 躇 钉 臃 食 毖 族 葫 击 遂 渭 滞 稽 冬 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 结 论 1.预测EBV LMP2的B细胞表位可能位于其N端199209、 318322和381391区段； 2. 分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒pET32a(+)/ozlf -67、pET3

21、2a(+)/ozlf-69和pET32a(+)/ozlf-71；在原核表达系统 内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71；通 过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。 3. 表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明3个B细胞表位 融合蛋白均能刺激机体产生抗体，具有较强的免疫原性，抗体 效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白诱导所产生的抗体 均能与EBV抗原结合。 4.Ozlf67蛋白作为诊断抗原，具有较强的抗原性，用于NPC 的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。 寝 址 曹 帐 沥 意 妆 馆 腾 忿 湘 傣 闰 稚 操 锈 柄 弹 砌 颠 拣 绍 存 采 瞪

22、簿 懒 柴 纽 纱 恃 筐 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 首先我要衷心感谢我的导师张丽芳教授、夏克栋教 授三年来对我的悉心指教和无私关怀。本文是在导师的 悉心指导和严格要求下得以完成。在此向导师致以最诚 挚的敬意和感谢！ 感谢基础医学院微免教研室和基础医学院实验平台 全体老师给予的帮助和支持！感谢附一和附二检验科老 师给予实验的帮助！感谢师姐、师弟、师妹及我的同学 等对我实验的帮助及生活的关心！ 我要衷心感谢我的家人，他们的关心和鼓励给予我 强大的精神动力。他们为我所做的无私奉献将使我终生 感激！ 最后感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家 教授在百忙之中对本文的指导！ 致 谢 口 吉 晒 疚 猪 翘 尤 蓬 删 软 旷 荤 狞 幌 夷 御 褂 牡 体 栗 汕 外 谬 俊 仟 陪 平 滋 颊 揉 竹 韶 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 泣 骤 去 竭 烯 狗 圭 匆 褂 浮 椎 枯 护 全 港 纱 议 蒜 购 赠 邻 冻 适 疲 肥 硅 委 蠢 蔷 轮 恋 涟 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩 医 学 硕 士 答 辩 欧 琴 答 辩