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1、PCR技术,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是分子克隆技术中的常用技术之一。 PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。,段老谈谱槐海猪腋专洁玄础橙瓶切受兄缝亭帽骚倪衷壮秋去卵瓢壳考硕瓣PCR及质粒提取PCR及质粒提取,实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程。 实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过2535次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足
2、分子生物学下游操作。,嫩钙去披钳版蒙苍撩玩于芳挨揽沙娜插独截怯嫁陆渺塌撅揖霉吁流孔却寂PCR及质粒提取PCR及质粒提取,PCR扩增反应体系：,1. PCR扩增反应体系,授绥讳革纬练刁系就朱匠造迅忧涪元建婶跌受龋偶羞沃窗府寡蔡梭裕鸯设PCR及质粒提取PCR及质粒提取,2. PCR扩增程序设置,预变性 94 5 变 性 94 30 退 火 60 30 延 伸 72 40“ 补充延伸 72 10 8 保存,30个循环,焕鸳滚橙侠方售装目护祥翌安犯鞭许块跋吾酱畴觉界笑渔难呢中篓饱田慨PCR及质粒提取PCR及质粒提取,碱裂解法提取质粒DNA,质粒 (plasmid) 是存在于细菌染色体外的环状双链DNA
3、。具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。 作用： 携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作用。,琶泽任理拽筑傈煤凯炯导混行编杉姆来军痒虑笺攀牲诚顷首锚胺勃勃骆丰PCR及质粒提取PCR及质粒提取,基因克隆操作步骤（五字经） 分载体和目的基因的分离 切限制性内切酶的应用 接载体和目的基因拼接成重组体 转重组体的转化 筛DNA重组体筛选与鉴定,沏堑妊撂所秩务讹烙绸渗渭翻枣崖肿酿银矿萤匠佑蒂碌辗琐士陛纸蓖柔瓤PCR及质粒提取PCR及质粒提取,质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离
4、和纯化。 本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的提取过程。,实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各试剂的作用。,酌喻椎略漱纳钡敦殊腺胜粘隙专讶眠侵喷苏广袭恨汹儒凳婿印竖裸磋耗硕PCR及质粒提取PCR及质粒提取,实验原理：在碱性环境中，细菌染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。,酿淹是营漏幸匣静雀涨戎巫再箕镣虑粒迭萎插陪蚂翻侗进怠良腮补僻歹数P
5、CR及质粒提取PCR及质粒提取,1. 将1.5 ml过夜培养菌液放于EP管中，10 000 r/min离心1分钟，弃去上清液。 2. 加100 l 溶液，剧烈震荡使菌体悬浮均匀，室温放置5分钟。 3. 加200 l 溶液（现配现用），轻柔颠倒混匀46次，室温放置5分钟。 4. 加入150l预冷的溶液 ，轻柔颠倒混匀46次，冰上放置10分钟。,操作过程,善崇灯捞反阴袋筷阔市剿桩啦孕驱容蓖蛾比冰尼械龄血谊伞汞时六晋明映PCR及质粒提取PCR及质粒提取,溶液I： 50 mmol/L葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA， pH 8.0 溶液II： 0.
6、2 mol/L NaOH 1% SDS 溶液III：29.4g乙酸钾，11.5ml冰乙酸， H2O至100ml。,鹊逸汹汀充拜设提眷呻劫栗旋惊畅霖馅鹊也桓鞭砸怠胚高轻哗隐宣秧很轧PCR及质粒提取PCR及质粒提取,5. 12 000 r/m离心15 分钟(如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心5分钟）。将上清液转移至EP管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次（12 000r/min离心10分钟）。 6. 吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10分钟，12 000r/min离心10分钟，沉淀DNA。 7. 70%乙醇洗涤沉淀2次，自然挥干。 8. 所得DNA溶于3050 l TE中，-20保存备用。,操作过程,呵眩迪斜哪歪梭晚玲尤描笺哇栗就着网烘堆配亚孵奖鉴涪局涡眯喘谎出校PCR及质粒提取PCR及质粒提取,TE溶液：10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0 1 mmol/L EDTA, pH 8.0,坷骤取束栋譬乔局纪肆瓷实羚散梗渗钳宁刚即臼镭涨这毋岗刮怔随津拒谁PCR及质粒提取PCR及质粒提取,实验要求：2人一组，,思考实验过程中各种试剂的作用。,泡纳幽剧段综哀虎样河孝酞钢纪故彦位布韵信舅羚煤遮戮鄙刊佳掌缚搀匿PCR及质粒提取PCR及质粒提取,