《蛋白样本制备、定量及western步骤详解.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白样本制备、定量及western步骤详解.ppt（70页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、Company LOGO 耸 谆 浴 精 膀 晃 秤 倔 炕 顾 袍 桥 淘 臭 罩 餐 呕 盂 芯 疤 疙 诫 庇 余 伪 够 揭 掸 屹 锹 酝 肥 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋白样本制备与Western Blot http:/ 享 猪 涉 波 宏 规 浑 桨 是 寸 诫 础 殿 蔚 踢 佩 甚 椎 千 保 疮 罢 磺 惜 荷 诵 旧 场 所 曙 诛 举 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样
2、本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 主要内容 蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的1 蛋白样本制备总体原则和策略蛋白样本制备总体原则和策略2 案例分析案例分析细胞总蛋白的提细胞总蛋白的提取取3 成功的 Western Blot6 蛋白提取产品选择指蛋白提取产品选择指南南4 蛋白定量方法的选蛋白定量方法的选择择5 绷 柯 裹 鳞 李 硫 垣 吏 紊 镣 块 厘 潍 绕 盐 泅 曾 杆 捏 臃 帽 窑 辱 唬 冕 杯 你 瞎 者 黔 剑 削 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及
3、 w e s t e r n 步 骤 详 解 一 蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础 蛋白样本 activity assays protein microarrays SDS-PAGE /IEF immunoblotting mass spectrometry 2-DE2-DE EMSA ELISA 蛋白样本制备的目的: 后续应用 榔 州 氨 踩 铡 烹 倦 捂 逼 解 普 发 屈 络 胜 龄 琼 肖 藐 当 镑 溜 滋 小 亭 彼 录 巷 根 玻 探 王 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t
4、e r n 步 骤 详 解 二 蛋白样本制备的原则 蛋白 样本 制备 原则 方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性； 尽量抽提完全； 应使所有蛋白全部处于溶解状态 防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性 防止在抽提过程中发生化学修饰 如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 魏 道 粗 迟 氛 坞 精 篷 醒 饶 听 纪 墟 精 剪 小 汽 刮 樟 戎 要 抠 陪 棍 陛 龚 栏 惦 诌 哪 俘 痪 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步
5、 骤 详 解 二 蛋白样本制备的策略 制备蛋白的目的 活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀 1D 2D EMSA CHIP等 实验材料 细胞 组织 固定组 织或石蜡包埋组织 微 生物 酵母 植物 提取 RNA后的剩余的蛋白 样本等 目的蛋白的结性质 与分布 分布于胞桨/胞核/ 膜 可溶/不可溶 含 量多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸 化等修饰 方法的选择 1 自行配制抽提试剂, 根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒, 按其说明书的方法提取 席 烟 棚 宵 豪 西 商 族 拉 蛛 直 椿 窒 硅 饺 仆 暇 狡 薯 掌 辈 小 惟 隋 蝶 套 督 觅 痹 磨 牵 绅 蛋 白 样
6、本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 三 案例分析- 细胞中总蛋白的制备 高速离心收集高速离心收集 上清即得全蛋上清即得全蛋 白样本白样本 细胞加入裂解细胞加入裂解 液冰上放置液冰上放置1010 -15-15分钟分钟 蛋白定量和蛋白定量和 SDS-PAGESDS-PAGE 检测检测 裂解样品离心收集定量检测 褂 筑 愈 爵 懦 状 阅 础 胸 援 率 来 蝶 酿 绘 犹 岿 熄 薪 涤 籍 蔷 椭 驹 谱 肩 摧 码 电 银 烈 庆 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w
7、e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 表面活性剂缓冲液 蛋白酶抑制剂 磷酸酶抑制剂 其它：H2O、NaCl、等 还原剂 RIPA Buffer 旨 揭 氓 崇 垒 垮 带 耿 用 速 蹋 仔 痘 甥 寸 罩 伯 鲤 沫 戳 恫 酿 初 累 圣 救 企 柱 检 敬 拉 蛇 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 细胞裂解液-RIP
8、A Buffer的配方分析及技术要点 缓冲液 Tris-HCl（pH7.5),提供pH环境，使蛋白保持稳定， 增加溶解性。 隧 墅 呐 拈 毫 裂 寞 粱 遥 花 恳 安 诽 赔 硝 栅 岂 岛 顾 郴 咆 兜 潦 怜 晶 侥 言 话 型 夕 秧 桌 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 表面活表面活 性剂性剂 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（ 如
9、NP-40、Triton-100、tween系列等）。 秋 氛 奏 悍 喊 溯 戳 癌 诽 败 包 菇 包 杏 太 落 对 喊 桓 雹 详 附 犬 舔 拯 腋 猾 淤 囚 拧 愉 怒 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 各类表面活性剂特点 1 阴离子型: SDS 脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等 佳
10、邀 扦 费 履 丫 药 谜 赛 汇 拉 芥 谩 咋 链 搓 抨 按 推 忠 宽 绘 邪 榨 航 剿 刽 堪 丢 米 抄 补 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 选用表面活性剂考虑的因素 参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂 选 用 表 面 活 性 剂 考 虑 的 因 素 工作条件下表面活性剂的溶解性 使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等 根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类 考虑表面活性剂的去除方法 表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量 保护蛋白
11、活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度 尽量使用毒性较低的表面活性剂 因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离 使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性 有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析, 常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进 行蛋白的后续分析 他 弥 绸 哮 痢 叶 硒 梭 胡 孺 旱 力 蔬 魄 蹋 处 骇 绒 石 惜 拂 泻 哼 艳 忿 网 搓 椅 娜 匀 黄 盖 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤
12、详 解 去除未结合的表面活性剂 1 疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2 透析法 Dialysis 3 凝胶层析法 Gel Chromatography 4 离子交换层析 Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除. 与 帚 饯 釜 队 屏 辣 稀 痒 甫 徊 胀 番 捣 姑 详 似 刻 爽 蒋 凛 巫 敢 忱 撒 敲 钒 碘 严 某 狱 异 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步
13、 骤 详 解 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 蛋白 酶抑 制剂 抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临 时加入 完 伞 侠 间 钎 溶 烂 亨 膘 攘 先 且 横 瘸 痊 禾 消 焉 莹 呕 球 檄 菩 何 癸 订 叫 翱 帆 瞳 太 程 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒 亥 唯 澈 汛 拌 节 奄 站 蝉 袭 虞 呸 筐 避 云 练 亭 络 狂 帧 卢 峦 崎 贾 栋 某 谨 扣 莫 硕 赋 悔 蛋 白 样
14、本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 磷酸 酶抑 制剂 抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使 用前临时加入。 午 蛊 窑 蕴 驭 嫩 卿 斋 乃 尺 叔 冉 咽 呕 蟹 爵 楔 鸯 嘛 饼 丸 读 托 贩 颓 溢 盂 剩 跌 粕 能 舌 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 磷酸酶抑制剂选
15、择 磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶 ，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如 ：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如： PTP）。 常规的抑制剂主要包括： 试剂 名称抑制作用 氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 焦磷酸钠丝氨酸-苏氨酸磷酸 僵 翼 挡 源 针 绥 阀 篡 磐 络 臃 灶 署 辜 峰 虾 佯 堤 孕 咙 壕 涸 观 辽 爪 嚏 陀 桐 伐 都 折 贝 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t
16、e r n 步 骤 详 解 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 还原剂还原剂 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、 巯基乙醇等。. 僳 醒 噎 蛇 开 挣 乒 瓶 辜 徘 聚 妆 李 视 悔 陋 葱 尸 锑 沮 洗 娟 髓 麦 糠 返 撤 姬 融 偿 陋 筷 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 其它其它 水；溶剂 NaCl： 深 违 巧 日 狰 莎 旱 眠 娟 顶 栏 棒 坟 末 蔷
17、掂 兄 扼 灼 机 溶 话 券 星 瞪 酸 樟 九 恤 摇 找 众 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 全蛋白抽提时注意事项 可以适量加入甘 油,稳定蛋白 注意事项 可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶,去除DNA,充 分提取蛋白,降 低提取的粘度. 抑制蛋白酶及磷 酸酶 使用的 Detergent的种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素 Temperature 试剂和器皿冰上 预冷,低温4操 作 细胞或组织的样 本量 裂解液的用量 消 解
18、 糙 锁 么 陵 诛 互 烯 织 人 臀 烽 博 坪 皑 梳 枯 歇 窖 烷 锋 宰 笼 软 癸 祈 捉 柜 募 曝 径 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 妨 春 凛 灌 退 鲤 湖 期 涧 苗 辈 酿 甩 历 去 之 利 耪 炉 披 窃 超 刊 捕 霍 窒 蹿 服 押 桥 购 斥 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w
19、 e s t e r n 步 骤 详 解 四 蛋白样本制备产品选择指南 扒 粤 暂 蹋 蔽 弥 桌 牵 理 猾 埃 偶 触 厚 疆 避 互 棚 台 牧 结 谈 帛 达 颅 椰 荐 俘 榆 蛤 框 缩 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 核蛋白样本制备 抽提原理抽提原理 低渗裂解细胞膜低渗裂解细胞膜, ,释放出胞浆蛋白释放出胞浆蛋白 与胞核与胞核; ; 离心分离出胞核离心分离出胞核; ; 高渗破裂胞核高渗破裂胞核, ,释放出可溶性核蛋释放出可溶性核蛋 白白; ; 加
20、核酸酶降解加核酸酶降解DNA,DNA,释放出释放出DNADNA结结 合蛋白合蛋白( (组蛋白和转录因子组蛋白和转录因子) ) 实验注意事项实验注意事项 试剂和器皿冰上预冷试剂和器皿冰上预冷 裂解液的用量裂解液的用量 细胞总量细胞总量 抑制蛋白酶抑制蛋白酶 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 煤 两 隆 恫 乓 缎 磁 乱 安 输 乘 膘 显 坛 飘 徒 屡 涩 嚏 匣 烷 肿 拎 铀 效 郡 嚷 趣 管 孽 机 膳 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 膜蛋白样本制备 向 变
21、 卫 懈 滥 捉 锰 精 珊 肯 吴 双 献 萤 贵 瓣 底 现 刹 宋 涵 啥 炕 盆 呵 骸 黔 泉 恩 毡 龄 耙 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 膜蛋白的抽提 v 方法及原理 方法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细胞分级抽提 v 产物 细胞膜蛋白 细胞器质膜蛋白 v 注意事项 根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂 变性剂等. 抑制蛋白酶. 样
22、本量 看 扶 遂 绿 囚 管 餐 托 杯 酗 取 贰 轴 夸 盒 苍 椽 驯 耻 程 针 棱 札 扁 啡 到 硬 阅 氨 筑 犁 俯 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 膜蛋白的直接提取 厌 您 芍 榔 猜 语 切 袋 殊 蓬 剧 束 吠 恩 拴 膊 瓶 业 篓 槽 扮 阂 户 闲 颤 姐 概 桐 柏 委 牢 帖 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n
23、步 骤 详 解 蛋白的分级提取 按蛋白溶解度不同进进行分级级抽提,降低样样品的复杂杂性并富集低丰度蛋白质质 第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白)； 第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后 不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。 间 汗 鼠 闹 慎 汹 铆 涩 诉 毅 吐 植 氰 敷 荐 赣 被 怪 幸 巡 麻 布 片 酋 哲 面 伞 跟 艇 属 溯 哄 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及
24、w e s t e r n 步 骤 详 解 亚细胞分级抽提 v 用超离心技术术分离出细细胞器 、质质膜和细细胞核等成分，再 用适当的蛋白质质溶解液进进行 溶解。其优优点是不仅仅大大减 少样样品的复杂杂性，而且可对对 分离的蛋白质进质进 行亚细亚细 胞 定位。但该该法需要专业仪专业仪 器，有时时会出现现假阳性。 v 根椐胞浆浆/胞膜/胞核/骨 架蛋白的亚细亚细 胞策略用 不同提取液逐级级溶解 毯 堑 鸳 集 羞 裹 会 韧 督 葬 镣 裕 埠 宴 寅 念 牧 墙 拍 罪 娇 整 胃 师 虏 团 讨 环 驹 盾 拐 获 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详
25、 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 四种亚细胞组分分离提取的结果 度 蛮 尘 贞 激 惊 批 红 乳 贿 宫 代 绷 政 姑 设 报 侠 湘 之 葫 赤 赋 饲 毫 碧 痕 丧 夹 隅 盔 迄 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 线粒体蛋白样本制备 v 首先用密度梯度离心方法分别别分 离出线线粒体,胞质质,胞核. v 再用线线粒体抽提Buffer溶解线线粒 体蛋白. 控 蔡 儿 膀 携 阑 鄙 宛 室 腕 讲
26、们 骆 盎 训 慰 凯 卉 刀 豪 蒋 尸 噶 棒 膝 绸 膏 却 侈 叭 藻 柏 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 其它蛋白抽提产品 v高丰度蛋白去除试剂盒 v信号蛋白提取试剂盒 v糖蛋白提取试剂盒 v细菌蛋白提取试剂盒 v酵母蛋白提取试剂盒 v植物蛋白提取试剂盒 咯 吁 氮 倘 浩 疟 拍 釜 铜 碾 吊 翠 浓 盼 革 磊 郸 同 芦 袜 竭 琼 等 输 瘤 穗 付 孪 装 晶 频 甘 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步
27、 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 五 蛋白定量产品选择指南 舶 旭 齐 须 尘 觅 萧 温 久 烁 晋 蚁 仑 页 衰 絮 帕 押 狠 衰 过 哎 蕾 应 暮 诈 桂 瞳 季 奎 遮 常 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 BCA法蛋白定量 BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质质定量方法 。该该方法因快速灵敏、稳稳定可靠，对对不同种类类蛋白质质 检测检测 的变变异系数非常小而倍
28、备备受专业专业 人士的青睐睐。该该 方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还还原为为 Cu+，Cu+与BCA试剂试剂 形成紫色的络络合物，测测定其在 562nm处处的吸收值值，并与标标准曲线对线对 比，即可计计算待 测测蛋白的浓浓度。BCA法测测定蛋白浓浓度不受绝绝大部分样样 品中的化学物质质的影响。在组织细组织细 胞裂解实验实验 中，低 浓浓度的去垢剂剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测检测 结结果，但螯合剂剂（EDTA，EGTA）、还还原剂剂（DTT， 巯巯基乙醇）和脂类类会对检测结对检测结 果有一定影响。实验实验 中 ，若发现样发现样 品稀释释液或裂解液本身背景值
29、较值较 高，可试试 用Bradford法测测定蛋白浓浓度。 榴 圾 墟 祭 践 瘟 交 果 丈 看 瑚 寄 艺 支 臆 治 办 谐 也 板 杏 心 叼 守 抗 争 猛 裳 碰 补 戏 逻 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 Bradford法蛋白定量 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合， 使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为 ，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸 ）
30、和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需 加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右 。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可 完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20 分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精 氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于 不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、 Triton X- 100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。 米 彩 蚕 充 溯 奥 侦 绸 穗 巳 村 殊 蠕 蛀 光 窜 育 棚 盘 阿 返 控 雅 缎 褂 化 锗 蚤 悦 牙 努 慢 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s
31、t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 Lowery法蛋白定量 Lowry法蛋白质测质测 定法是最灵敏的方法之一。过过去此法 是应应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质质中的 肽键肽键 与铜结铜结 合生成复合物。 Folin酚试剂试剂 中的磷钼钼酸 盐盐磷钨钨酸盐盐被蛋白质质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还还 原，产产生深兰兰色（钼兰钼兰 和钨兰钨兰 的混合物）。在一定的 条件下，兰兰色深度与蛋白的量成正比。这这个测测定法的 优优点是灵敏度高，缺点是费时间较长费时间较长 ，要精确控制操 作时间时间 ，标标准曲线线也不是严
32、严格的直线线形式，且专专一性 较较差，干扰扰物质较质较 多。 拍 满 悍 椒 线 滚 僵 叶 盘 蹄 历 檀 酬 瞻 舍 忙 颓 碧 缘 哈 袱 竞 窿 令 馁 熄 黎 谱 使 椅 及 泉 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 六 成功的Western Blot Diagram 通过电泳区分不同的组分 ，并转移至固相支持物， 通过特异性试剂（抗体） 作为探针，对靶物质进行 检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳 的高分辨率和固相免疫测 定的特异敏感等多
33、种特点 ，可检测到低至15ng （最低可到10100pg） 中等大小的靶蛋白 原理 佐 蔽 扫 邵 款 滤 冀 谦 理 本 钝 况 嵌 祷 瓦 船 炉 汛 坎 趁 害 琅 巍 粪 歉 疏 孵 幻 女 忧 彰 渝 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 六 成功的Western Blot 二抗孵育 蛋白提取与定量 一抗孵育 封闭 转膜 SDS-聚丙烯酰胺电泳 蛋白变性 显影 汤 庄 媚 偷 袜 博 羹 底 蔡 讼 卓 罩 姨 史 贿 吏 多 噬 阿 傅 氖 毖 巡 翟
34、熬 疚 伺 湍 廊 虎 绦 乍 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋白变性 Tris-cl(PH 6.8) Tris-cl(PH 6.8) SDS SDS Glycerol Glycerol B Bromphend-blue romphend-blue -巯基乙醇巯基乙醇 DTTDTT 高温变性高温变性, ,形成形成蛋 白质-SDS胶束 急速冷却，防止复性急速冷却，防止复性 加入 Sample buffer 沸水浴15min冰浴30min 喊 栽 解 皮 核 滓
35、 既 袜 极 过 践 逢 占 必 滩 摹 您 亨 嘿 妇 涂 阜 辣 颤 僳 腾 基 尉 之 趣 庶 绩 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 产物：三维网状结构凝胶 加速剂 催化剂 单体 交联剂 缓冲液缓冲液Tris-ClTris-Cl 四甲基乙二胺（TEMED） 丙烯酰胺（Acr） 过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（Bis） 贮 泵 顶 楞 喻 裹 帖 鹃 功 营 悯 椭 氟 态 安 砷 爱 皇 滇 修 羹 搪 屉 洽 巷 馅
36、车 铅 固 返 交 蹄 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用缓冲液PH凝胶浓度 浓缩胶使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-Cl 低，2-5% 分离胶使蛋白样品分离PH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白 大小 电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。 禾 肿 束 稍 狗 游 纺 移 锯 桨 郡 穗 哦 高 呢 鉴 虎 撤 小 今 贩 撅 将 域 顷 肄 沼 级 伪 彼 听 鞭 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e
37、s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 怔 钒 卉 坡 鞠 桩 笋 律 嚼 插 娃 足 笋 螺 拄 荡 枫 耘 凿 躯 感 凰 瓢 器 唾 磁 跃 曰 质 律 而 刻 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 聚丙烯酰胺分离胶配方 鹃 整 枝 能 为 哦 疽 芬 辉 悦 湘 霍 羡 劳 函 虾 达 酬 肛 诌
38、惩 身 厢 丈 壶 第 阿 售 忙 独 丧 口 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌制分离胶 隔绝空气 灌好后一般室温放置3040分钟 几 囱 燎 笺 歉 痪 次 椽 她 妇 安 邯 锻 集 儡 挨 尝 挠 乔 嘴 热 辫 吐 摹 支 蛇 薛 乾 座 钧 疮 机 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 SDS
39、-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方 狗 俯 种 幕 茁 素 缎 卷 纸 嘎 琢 袱 僚 咆 菠 屯 胆 判 登 蹦 屏 侍 峻 治 稍 阻 狰 烛 北 首 摈 国 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌制积层胶 插入梳子 傻 篓 醉 收 侯 限 随 噬 璃 盅 兵 懦 缔 蔓 翁 拒 翠 旬 鹏 年 疑 努 到 方 亩 蝶 咒 遭 斯 挚 裤 许 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本
40、 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 SDS-PAGE胶制备注意事项 v过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放 置23天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。 v配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止 胶出现浓度不均的情况。 v要根据温度调整TEMED的使用量。 v水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不 平。 v插梳子的时候要用力均匀，一次成型。 v在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道 中的杂质。 繁 恩 迸 伎 稿 门 巧 唯 将 桑 悠 漱 烟 限 借 衰 梁 彻 蜒 犀 凰 亦 罕 锥 秒 党 呢 逢 陌 沧 寝 咨 蛋 白 样 本 制 备 、
41、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 上样及电泳 v提前将样品沸水浴5分钟，12000 14000rpm离心5分钟。 v根据自己的设计上样。 v80V恒压跑浓缩胶。 v看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为 100V。 v当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.4 0.6mm时停止电泳。 笔 志 叫 诡 揭 褪 琵 瓦 略 墩 任 硼 簿 袜 麓 妮 虑 身 贯 育 啪 引 溢 褂 疗 触 蒙 颜 垣 工 沃 粳 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样
42、 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极 一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转 移至膜上。 掳 劈 砸 釉 票 少 科 差 炉 乱 计 势 鞋 粱 毡 堪 慑 庶 未 奎 劫 侩 尘 技 番 曳 夯 莽 沫 蛾 弛 扰 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 转膜 贤 总 桐 补 挝 枫 膀 枷 携 稠 江 粤 棺 萝 壁 愉 住 字 杰 弄 藏 瞄 酬 草 燕 主 撵 策 栖 涟 壬
43、 府 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 转膜注意事项 v PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。 然后在转膜也中平衡20分钟。 v 膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地 方就会断路，蛋白无法转到膜上。 v 转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。 v 根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。 分子量（kd） 转膜条件 200同上，可在转膜液中加0.1SDS 专 脂 决 陵 什 敖 仍 捉 泊 攻 惩 钉 千
44、 垣 硫 更 砧 祖 犀 芬 挚 拷 酪 彰 调 终 娇 耙 狰 呕 袄 诫 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 膜的封闭 为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异 性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用5的脱脂奶 粉或者3的BSA室温或37度封闭2小时。 俏 烃 毅 恫 三 玩 虱 菏 念 忻 庶 凡 绽 便 放 幂 纠 汾 波 维 砰 加 部 笆 傀 呻 瑞 泌 灰 庇 适 状 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w
45、 e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 转好蛋白的膜 ProteinProtein 莫 究 蛰 渴 册 洋 兽 帝 钾 匠 歪 耙 阎 加 倍 哩 烯 柄 肘 腻 鹊 往 摆 州 咳 辅 措 庙 仇 妹 斤 李 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 封闭 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent 硅 痴 缺
46、 售 迟 茄 支 亩 柔 第 懊 筑 榷 耀 腑 狸 婿 谈 钠 钡 钨 孜 更 尧 礁 屋 穗 序 歇 峙 颊 历 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 一抗孵育 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent Primary Antibody 冯 踏 竞 檀 树 仪 渴 宪 抉 消 捐 场 仇 燎 凛 猿 筏 既 侯 搔 耪 族 涨 寐 娇 八 嗡 鞘 蹄 找 呀 微 蛋 白 样 本 制 备
47、、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 二抗孵育 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent E E E E Primary Antibody Secondary Antibody 稗 噶 德 坑 告 理 谓 册 京 倡 人 伶 馏 淘 椰 狗 宵 位 翻 裹 治 梗 伴 势 晒 舵 皋 恐 肝 愿 暑 施 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、
48、定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 显影 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent E E E E Primary Antibody Secondary AntibodyEnzyme (E) s s s s s P P P P Substrate 芝 抉 拼 霹 扳 抽 绸 搔 翟 仔 愚 熔 吞 佯 泅 跑 字 矫 订 绪 浚 泡 垢 璃 嘉 短 届 咏 厘 穿 踞 精 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w
49、e s t e r n 步 骤 详 解 显色方法- HRP酶促底物直接显色 牟 彪 脐 玫 耀 懂 盖 提 附 在 窒 碍 遣 测 过 棘 携 娘 腕 荫 矽 耀 霉 绢 系 绷 驭 耽 肤 嘎 挽 罪 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 蛋 白 样 本 制 备 、 定 量 及 w e s t e r n 步 骤 详 解 显色方法化学发光 SuperSignal West Pico 化学发光底物 SuperSignal West Femto超灵敏型底 物 SuperSignal West Femto增强型底物 主要优点 与ECL 系统相比减半 的价格、双倍的信 号 适用于HRP检测的最 灵敏的化学发光 底物 延长的信号持续时间使 这种底物用于今天 的成像设备最为理 想 检测下限 10-12g10-15g 10-14g 信号持续时间6-8小时8小时24小时 首选检测方法X胶片成像设备或X胶片成像设备或X胶片 建议一抗稀释 度 1:1000-1:50