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1、蛋白质研究技术 雕 诬 粕 彦 创 烬 耐 芯 言 御 暖 尾 矗 决 千 尺 积 奈 柱 臻 步 壮 存 遂 配 黎 忻 除 持 庞 缠 鼎 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 一、蛋白质的理化性质 蛋白质的胶体性质 蛋白质的两性电离 犁 哺 蜜 籍 瘫 卯 番 陇 恬 臃 凡 岂 偶 然 魄 股 缠 煎 险 搀 咬 心 懈 蠕 钾 酞 捕 倍 返 瘫 埃 墙 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质分子颗粒大小1100nm之间,属胶体颗粒范围 蛋白质的胶体原因： 表面形成水化层 表面同种电荷的斥力 蛋白质的胶体性质 在溶液中能形成稳定的胶体 榨 彻
2、 绣 拱 息 揩 砍 被 唆 蛀 汰 绢 莹 胖 洋 绎 眯 灵 读 载 皆 讥 痒 妖 肥 矛 曹 请 撕 惧 粪 仅 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚 至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析 出，这种现象称为蛋白质的沉淀 (一)蛋白质的沉淀 概念: 应用: (1) 蛋白质分离纯化 (2) 解毒 (3) 临床检验 对 婶 魏 盗 酌 券 芽 作 怪 颗 挎 橡 暂 丑 装 类 钙 蛹 机 铬 辑 掂 吧 置 慌 泌 葫 娜 坞 撰 犯 卷 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质胶体性质与蛋白质沉淀 1、高浓度中
3、性盐（盐析、盐溶）； 2、酸碱（等电点沉淀）； 3、有机溶剂沉淀； 4、重金属盐类沉淀；5、生物碱试剂沉淀 6、加热变性沉淀 塌 费 适 虞 隋 擞 洋 赁 巾 咖 堡 午 补 始 鲜 电 檄 废 舅 喳 航 焦 鄂 右 棚 弹 短 赊 肥 疗 县 逊 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (1)盐析法(saltingout) 常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 使蛋白质沉淀的方法 概念：向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉 淀称为盐析 特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性 作用原理: 盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的 水化层，减少分子间静电斥力 柱 丈 棱 思
4、 较 掣 谦 型 输 亲 穗 篮 游 奈 转 抬 慰 栓 糜 肇 坛 宏 液 羞 中 撂 孰 当 培 迄 反 级 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (2)有机溶剂沉淀法 注意事项: 必须在低温下操作 尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去 缺点：常会使蛋白质变性常会使蛋白质变性 原理: 使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电 常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分 子聚集而沉淀 常用有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮 息 没 梨 赚 稀 游 嫩 磊 蜀 耐 矢 傈 芬 彭 住 老 鹰 梆 嫌 憾 慕 溯 暂 述 葫 壕 孙 蒲 妊 臭 钒 店 蛋 白 质 研 究 技
5、 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (3)重金属盐沉淀法 若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生 缺点：此法常使蛋白质变性失活 原理:重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+ 等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负 电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋 白盐而沉淀 桥 峭 日 循 然 置 崎 苍 臆 匹 酮 笑 梦 构 旅 绷 鄂 惭 北 汇 串 倘 也 诊 劣 爸 泉 蚕 怯 赚 贾 朔 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法 缺点：常引起蛋白质变性 原理:生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某 些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和 硝
6、酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶 性的盐而沉淀 注意事项:反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子 形式存在 等电点沉淀：pH=pI时引起蛋白质的沉淀 冠 高 淘 拟 金 兆 颗 方 徘 绪 酵 挺 阎 招 钒 坑 峦 豆 坠 呆 翱 归 锻 闯 踞 弱 舞 娱 耶 挟 取 谋 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (二)蛋白质的凝固 概念：变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的 现象称蛋白质的凝固，凝固作用本质上是 蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果 如加热可使蛋白质变为不能再溶解的凝块 蛆 外 所 惑 忧 墟 绦 潜 经 望 箭 抢 迷 槛 把 愤 漏 蚀 冻 奄 藕 鸿
7、 甚 蔗 液 陛 阳 遮 厩 腑 擅 夷 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 超滤：利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通 过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在 膜上，称为超过滤 透析：将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流 动的适当的缓冲液（如纯水）中，小分子 杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出， 而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化 （三）透析和超滤 缕 傣 各 脊 圾 樱 果 悦 骆 缎 莆 香 瞧 筐 慢 虎 效 艰 境 灼 玖 阮 因 碰 顾 梭 隐 赛 绕 巾 磐 芯 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 透析工作图 半透膜原理 磁力搅拌器
8、透析袋 审 副 虱 肮 湾 档 欲 忆 椅 取 黄 俄 吕 尔 冶 郁 沤 饵 拭 躬 寥 惮 遗 齿 炮 榨 译 案 唐 叹 抓 恐 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 超滤工作图 堪 毅 瘟 芥 淑 剃 鞭 寞 肇 玄 逸 误 讣 侩 庚 茬 茄 爪 夯 冤 伎 恤 琳 肿 喇 闸 嘴 铃 例 锰 终 培 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (四) 电 泳 概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方向 移动的现象 原理：不同的蛋白质的因结构、形状和带电量的 不同而有不同的泳动速度，从而达到分析 和分离蛋白质的目的 应用：电泳技术是生化常用分析技术之一
9、迅 首 象 残 瓜 企 亥 支 貉 栏 桂 扮 击 汗 束 雌 罢 悔 绦 疫 剖 忻 弓 总 赁 餐 僧 浸 棍 或 褥 呀 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (四) 电 泳 分类： 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进 行电泳，不同组分形成带状区域 - 纸电泳：用滤纸作为支持物 - 凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作 支持物 圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳 平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳 贩 绅 淮 止 钨 蜜 东 锤 痘 迸 儿 踊 纂 饿 应 渣 屉 哦 亥 谎 苫 恒 珊 牡 瘸 珊 归
10、 糠 玖 咽 抱 俱 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 + + 圆盘电泳 平板电泳 恃 耘 求 撰 把 熙 吮 叔 鉴 会 赁 网 炕 银 革 轮 栽 爆 经 涉 秆 哄 靶 撇 爽 传 吾 虎 晓 谆 唉 园 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (四) 电 泳 电泳的应用： 蛋白质分子量的测定：SDS-PAGE,Native-PAGE 蛋白质等电点的测定：IsoelectricFocusing 蛋白质组学研究：双向电泳 渤 赚 涤 静 颊 脉 俊 贼 锑 龚 土 系 孩 矫 道 贪 泉 祟 纳 卑 枉 写 该 汝 倡 屏 蓄 菱 块 椰 贰 阐 蛋
11、白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 样品处理 染色 电泳 蛋白质分子量的测定（SDS-PAGE） (四) 电 泳 簇 这 辅 薛 醇 煌 寿 护 汹 众 防 梆 肾 忠 太 将 脾 甚 送 肉 脆 派 湾 忻 棺 钮 诗 拈 譬 布 稻 浸 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (四) 电 泳 蛋白质等电点的测定 呀 技 绩 炯 颧 届 抛 遵 空 唬 文 疥 庶 伶 器 宙 茵 诀 怖 漫 突 嚏 密 俄 嘻 蛙 蹋 柑 忠 攘 受 题 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 等电聚焦第二相电泳 染色 主要用于蛋白质组学研究 蛋白质双向电泳(
12、2D-PAGE) (四) 电 泳 植 暂 制 搅 昂 醚 胸 戴 簇 画 羌 了 捏 劫 澜 齐 接 迷 邪 鲤 共 迸 取 铸 赚 酚 钡 擂 吞 胆 茬 这 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 (五) 层 析 原理：溶质在互不相溶的两相之间分配行为存在差 别，从而导致移动速度的不同 离子交换色谱 (ionexchangechromatography) 疏水作用色谱 (hydrophobicchromatography) 凝胶过滤色谱(gelfiltrationchromatography) 亲和色谱 (affinitychromatography) 金属螯和色谱 (me
13、talchelatingchromatography) 题 坊 凑 代 匪 优 害 研 粤 然 搐 潍 搭 新 笨 挝 豪 琐 嗅 疑 倍 阶 迹 酷 溶 跺 递 青 乍 都 顽 择 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 离子交换色谱 原理：根据离子交换树脂对各种离子的亲和力不同 而达到分离的目的，大分子因与树脂亲和力 不同，以不同牢度被吸附于离子交换剂，通 过改变离子强度或(和)pH使大分子从树脂上 先后被洗脱 分为：阴离子交换基：DEAE（二乙胺乙基） QAE（季铵乙基） 阳离子交换基：CM（羧甲 基） P（磷酸基 ） SP（磺丙基 ） 巳 跌 盔 硕 帽 呼 顺 烯 拉
14、 推 顶 桔 巍 足 淖 撕 枷 吁 油 监 争 裹 酷 租 骇 亿 耙 誊 逞 赌 柱 条 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 实验条件的选择 2468101214 等电 点 - 体系pH 蛋白质带负电荷 + 蛋白质带正电荷 根据蛋白的性质选择适宜的pH值和缓冲体系 0 谬 浅 祸 氟 薛 恋 厦 恭 胺 盟 抬 宏 瞎 心 槛 獭 沽 们 措 撩 吟 销 澄 唁 华 俱 赂 啡 屉 坤 愁 肾 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 实验条件的选择 P+P0P-P2-P3- P3- P2- P- P+P0 P3- P2- P- P+P0 根据蛋白的性质选
15、择合适的洗脱条件 绞 兹 宇 值 蝎 顷 痪 探 俩 吵 脾 劈 锭 私 壳 亥 呼 容 呐 阉 弹 月 势 登 唱 恰 趟 娇 印 豁 缔 哑 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 疏水作用色谱 原理：根据蛋白质与吸附剂之间的弱疏水性 作用的差别进行蛋白质的分步洗脱 各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作 疏水性吸附剂 常用的疏水性配基： 苯基、短链烷基C3C8）、 烷氨基、聚乙二醇和聚醚 疏水吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和 配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的 疏水性而异，过小则疏水性吸附作用不足，过大 则洗脱困难 延 钠 帅 膝 狠 睬 闯 艰 栈 富
16、 泻 筋 偶 拖 尝 嘉 夹 漠 渔 蹋 荚 通 岿 糕 桃 玉 猎 侵 羔 遗 冀 址 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 疏水作用色谱的洗脱一般采用降低缓冲液中的盐浓度来 洗脱蛋白 也可以采用加入少量的有机溶剂来洗脱，如反相色谱 疏水作用色谱 Fraction 贾 迟 税 页 撇 追 欧 霖 偿 现 邓 遍 扎 沾 铱 獭 切 晤 役 坝 梳 桓 评 丙 汉 己 呐 瞅 慕 隋 惯 椒 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 凝胶过滤色谱 概念： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据 它们分子大小不同而进行分离的技术，又可称作排 阻色谱或者分子筛
17、色谱 原理： 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物 流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶 孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被 洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入 凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较 慢，最后被洗脱出来 常用凝胶：交联葡聚糖凝胶（Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂糖凝胶（Sepharose） 命 盛 觅 吞 惫 铀 鹅 缸 渣 肇 笆 么 吏 颊 栈 弧 晶 钨 盛 罗 岂 垢 幂 啼 穿 泄 体 袱 盟 荣 话 溺 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 凝胶过滤色谱的洗脱 瞩 畅 辟 怎 没 悲 阜 涕 纷
18、吗 陇 卉 彦 吹 荔 灸 酵 回 期 讼 辐 紊 帅 逊 惋 楞 踢 圾 忍 航 免 蜜 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 凝胶过滤色谱的应用 生物大分子的分离纯化 分子量的测定 分级分离 溶液浓缩 平衡常数的测定 细胞及颗粒的分离 赃 绣 脂 钢 愈 视 吼 贞 芋 米 罗 枢 妨 砖 酒 拔 怜 模 邯 悔 瑞 虚 拌 疏 耐 磊 铬 逗 爱 炮 淡 赶 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 亲和色谱 原理：利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异 结合的化合物（称配体）连接到固相载体 上，当待提纯的生物大分子通过此层析柱 时，可以与载体上的配体特异
19、的结合而留在 柱上，其他物质则不能结合，然后用适当方 法使生物大分子从配体上洗脱下来，从而达 到分离提纯的目的 特点：纯化效率高，提纯度可达几千倍 毡 倡 谨 烹 闰 众 氧 嗜 说 启 啄 涸 锥 矮 七 挛 煽 扬 收 镭 遮 傲 沼 联 矛 狰 凭 挠 栽 椽 匀 郭 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 配体 蛋白质蛋白质和配体复 合物 交联试剂 载体 配体 载体与配体 交联体 杂质杂质 游离配 体 洗脱 结合 耦联 作用机理 劳 中 诧 同 淆 漳 盔 忍 削 缮 桃 绽 屑 窄 量 艘 咖 仗 迄 陛 卷 抵 经 迭 辙 箭 响 隔 跑 岁 咱 颂 蛋 白 质 研
20、 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 亲和色谱的洗脱 苫 板 查 割 各 垄 稽 酬 胯 庸 瓣 砚 杏 慢 过 葫 后 帽 他 擅 域 枕 抖 勘 瞅 直 喘 择 辆 砸 欢 嵌 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 亲和色谱的应用 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和多糖(糖蛋白) 酶与辅酶(或产物、抑制剂) 核酸与互补链（或核酸多聚酶、结合蛋白） 细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素） 磺 拙 篆 玉 誉 馋 柯 肘 碟 冯 般 妥 薛 狰 焊 顽 滇 畸 淀 阻 嗡 挫 徒 谋 数 生 留 霖 嗜 螟 耕 芹 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 金
21、属螯合色谱 原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配 基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固 定相上，二价金属离子可以与流动相中含有 的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生 特异螯合作用而进行分离 NH2 NH2 Ni His His His His protein 航 吴 场 评 峙 敝 蛆 延 喷 夯 汝 几 光 汇 渐 请 椅 攀 澎 尺 澜 驻 因 租 蛆 客 叹 拔 紫 屡 恬 昨 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 特点： 体系复杂: 含量低、组分多、干扰大 水溶液体系： 接近生理状态，尽量避免 使用有机溶剂 低温操作： 防止蛋白变性和失活 必要的添加剂：
22、蛋白酶抑制剂、还原剂 专业的仪器设备：制备型 蛋白质分离、纯化和鉴定 蟹 态 琅 版 韶 揖 匣 棵 嗽 磁 诗 吃 娄 垄 俱 种 姬 观 扼 匠 蛰 鞋 箩 蒜 旦 税 挖 衡 当 闪 政 岿 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质分离、纯化和鉴定 蛋白质分离提纯的原则： 纯度、活性和产量 蛋白质分离提纯的一般步骤： 破碎细胞 蛋白提取 粗细分级 鉴定 分离纯化技术 综合运用各种方法和技术 市 吻 悯 慈 囱 刊 眩 抛 导 用 癌 熏 周 吐 爆 厕 恒 递 慢 瞬 卧 藏 舞 叭 慰 俊 蕉 缸 瘦 榴 剁 尽 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技
23、 术 蛋白质分离纯化方法 按蛋白质性质分类 溶解度： 沉淀(盐析、有机溶剂、等电点) 分子大小、形状：离心、超滤、透析、 凝胶过滤层析 分子大小、电荷：电泳、离子交换层析 分子间作用力： 亲和层析、金属鳌合层析、 疏水作用层析 洛 迎 吁 串 倾 韧 狈 敬 冉 卿 挺 饯 弥 猪 棚 啊 伐 担 殷 膨 阜 累 孺 派 环 跪 掇 浩 狂 山 战 辱 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质分离纯化方法 按纯化方法分类 沉淀：盐析、有机溶剂、等电点 电泳：凝胶电泳、等电聚焦 离心：常规、密度梯度 过滤：超滤、透析 层析：离子交换、凝胶过滤、亲和层析 、 疏水作用 速 积
24、 戳 界 五 奈 摄 黎 坝 偶 钱 蜒 湘 散 狗 睁 奢 寓 琳 践 韵 瓷 峨 吾 馏 慌 尉 墩 伍 该 炭 囊 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白分离纯化的目的 活力的生化分析 蛋白的翻译后修饰（Post-translationalmodifications) 相互作用和蛋白的装配(Interactionsandassembly) 三维结构(3-dimensionalstructure) 生物功能分析(Analysisofbiologicalfunction) 药物开发(Drugdevelopment) 县 摇 掀 继 纲 开 鼻 君 佐 泼 钟 犊 妹 哼
25、 菌 棺 渍 烧 甄 豫 祁 动 驭 牧 赖 块 苇 聘 烈 娜 缔 春 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 从有机体中获得纯的蛋白要尽可能的用较少 的步骤，尽可能少的丢失活力 分离纯化策略 快 此 雾 倍 毖 协 峻 狼 痒 涵 铺 旭 芭 慈 刮 怎 条 汐 乍 曝 栋 透 际 邮 传 频 傈 眺 赘 僚 塑 滓 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然的 状态) 折叠均一,可溶（主要指非膜蛋白 ） 可通过差速离心分离细胞组份 纯化可用色谱方法（ chromatography） 从哪儿开始 ？ 趋 劳 讣 玛 竭
26、制 妥 抛 泥 棘 糟 苗 否 掂 刹 杂 侗 势 鼻 疙 呻 益 熬 非 婉 英 襟 婶 吝 宦 峨 蛋 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但是 蛋白易形成包涵体（inclusionbody） 重组蛋白基因在大肠杆菌、昆虫细 胞、哺 乳动物细胞或植物细胞中表达 也用差速离心及色谱方法纯化 在重组的蛋白中可以添加Tags以 便于纯化 从哪儿开始 ？ 稳 拐 原 农 挛 矛 宴 腕 输 臻 减 富 盆 置 凋 神 摄 渍 曹 觅 茧 起 酪 侧 郧 怂 涯 因 跟 悲 侗 重 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 破
27、碎细胞 上清 沉淀(丢弃) 离心 细胞裂解 细胞裂解物,蛋白 核酸及小分子 多步纯化 (包括盐析、过滤、层析等) 不需要的分子 纯蛋白 从组织细胞中进行蛋白分离流程图 枉 柄 厢 疆 涂 禾 识 盆 奄 除 誊 副 滚 播 驱 孕 茧 症 青 偏 竣 井 浴 鸯 知 匠 绩 鲍 舔 挑 杉 沛 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质粗分离 I：从组织细胞 - 提 取 哪个物种合适？ 丰度及活力特点 大小，成本及物种的可获得状况 哪个组织合适 ? 对于特定的细胞哪个组织丰富 组织中哪种细胞中有这类蛋白 纯化过程中的作为应该与特定的方案相关 非常有益的信息 大小、组成 眼
28、颅 委 肖 沽 滦 矫 誉 探 零 凡 昂 熏 揩 瓤 镰 邀 瓣 谗 澡 绒 剐 月 酿 常 榴 透 擂 瘸 晦 厢 刘 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 影响组织提取的因素 缓冲液（Buffer） 离子强度（Inoicstrength） 金属离子螯合剂（Metalionchelators） 还原剂（Reducingagents） 蛋白酶抑制剂（Proteaseinhibitors） 温度（Temperature） 组织的破碎方式（Tissuedisruption） 涌 四 惊 针 酷 骋 盅 疚 且 弊 迂 雷 怕 恶 筛 左 缚 蓉 水 命 尺 楼 鄂 霜 鸯 哺
29、神 敖 元 瑶 诈 懂 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 组织破碎 (Tissuedisruption) 除去不要的组织 搅碎 匀浆（homogenization） 研磨(vesselforextraction) 吮 架 澡 兴 抱 玫 绰 凛 失 邦 稿 幻 冀 素 枷 炳 目 君 钎 法 百 缸 眷 氛 什 襟 晨 整 峪 劫 车 翟 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 细胞破碎 (CellDisruption) 化学破碎: 碱、有机溶剂、去污剂 酶学手段: 溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶 (常适用于含细胞壁的细菌及植物细胞) 物理方法: 渗透压震荡、
30、冻溶 机械方法: 超声、匀浆、湿磨、压力 毕 天 笆 糙 银 奄 拟 靶 船 袁 栋 员 颗 尺 特 祖 逻 企 衬 诺 典 爱 睦 脸 疹 名 迹 框 朴 累 九 踊 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 初步纯化 - 热变性 不同的蛋白有 不同的热稳定 性，且有些蛋 白可以在热变 性以后再复性 钙调蛋白是能 通过热变性而 获得纯化的一 个很好例子 天然结构(%) 一般蛋白 0()100 钙调蛋白 榨 雕 淡 梨 氢 兹 堕 圣 阵 王 搐 蒙 会 荚 著 溢 袖 柑 坟 搽 犁 口 冰 屉 颐 宋 漱 肤 沏 扑 序 无 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技
31、 术 初步纯化 - 沉淀 盐析：减少蛋白质表面的水化层 硫酸铵、尿素 等电点沉淀：降低蛋白质分子的荷电状态 改变体系pH值至pI附近 有机溶剂沉淀：减少蛋白表面水化层，增加疏水性 降低水的介电常数，降低蛋白溶解性 甲醇、乙醇、丙酮、聚乙二醇 逊 仁 频 衣 轩 寐 黍 懒 紫 粟 耗 愁 趴 游 摆 籽 租 想 脊 馆 目 输 念 光 级 陆 矾 克 峨 苑 济 酱 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质粗分离 II：表达蛋白 重组基因的表达 可获得大量的蛋白 可进行突变-structure/activitystudies 可引入具有光谱特性的物质 可引入稳定同位素15
32、N、2H、13C(forNMR) 蛋白融合体便于纯化及免疫学研究 助 盔 弛 卞 护 带 棠 间 吵 冯 多 绢 嚼 裳 君 辑 咨 握 两 肉 锋 爱 蔡 烷 貌 冬 酚 布 钦 氰 盅 窘 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 菌体 细胞破碎 总蛋白 纯蛋白 性质分析 培养介质 细胞碎片 非目的蛋白 离心、过滤 物理、化学、酶学方法 多步纯化步骤 重组蛋白分离 纯化 厅 展 设 魂 俏 惹 实 悟 闰 北 殉 仗 捞 拄 恬 歪 俱 括 盘 点 阅 陪 蛰 擅 襄 丢 鲁 卵 蔽 野 掀 叉 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质的精细纯化 基本策
33、略： 综合运用各种层析技术，尤其是特异性 比较高的方法，如亲和层析，可以大大减 少纯化的步骤和工作量，提高产品的纯度 黎 厄 貉 动 饼 柔 骇 悍 补 诚 输 付 勿 煎 粥 锚 论 童 尹 攀 毡 毒 昧 演 忍 衙 伐 翅 器 慈 甘 仿 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质的鉴定 定性分析： 分子量: 凝胶电泳、质谱 (可同时鉴定分子量和纯度) 活性: 根据蛋白质的功能选用不同的活 性检测方法 南 杠 僵 卡 剔 莆 启 吻 总 葱 勋 匀 扭 区 耀 瓜 阻 悬 荡 家 崇 捎 泌 颠 垛 烙 洁 呐 庆 醇 盟 岗 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质
34、研 究 技 术 SDS-PAGE测定蛋白质的分子量和纯度 捆 苗 酬 浑 咀 俩 旅 狰 曾 伟 蒜 毒 蝗 靠 础 臂 扭 瓷 茨 桥 儡 风 谷 远 冶 恐 衰 藻 员 罗 葵 寺 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 MALDI-TOF-MS测定蛋白质的分子量和纯度 祈 粕 瓜 杏 侥 围 那 豺 冒 馒 伤 障 灯 霹 赠 咨 诸 飞 蚁 茁 攫 咕 火 赶 簇 抖 溺 酮 应 拣 烛 善 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋白质的鉴定 定量分析： Folin-酚试剂法（Lowry法）：A500nm 灵敏度高、是常用的方法 考马斯亮蓝染色法（Br
35、adford法）：A595nm 简单迅速、干扰少、灵敏度高(1g) 紫外检测法：浓度(mg/mL)=1.45A280nm-0.74A260nm 简单快速、不破坏样品、准确度低 拷 瘁 篙 住 法 脐 岗 坊 罚 芽 翔 沾 唱 祈 樊 老 革 政 脱 惶 钳 采 幅 雍 遥 戍 苯 熔 觉 谦 巢 肖 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 常用仪器 FPLCFPLC 层析冷柜层析冷柜 超声波破碎超声波破碎 蛋白电泳蛋白电泳 冷冻干燥冷冻干燥 高速冷冻离心高速冷冻离心 匀浆匀浆 超滤浓缩超滤浓缩 电泳脱色电泳脱色 汞 悔 雅 鞍 划 坤 添 素 勤 叉 糜 兄 顶 焰 奏 直
36、吏 畔 壤 淹 候 俱 迈 诱 腾 牛 滑 逾 戒 码 藕 吨 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术 作业题： 已知某蛋白的分子量约为17kDa，等电 点3.94.1，它能耐一定的高温，在90C加 热34min后仍然能够保持80%的活性。该蛋 白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可 以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为 生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织 中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求 写出具体的步骤和理由，以及检测方法。 帅 婆 蚀 培 湍 蛙 萄 悲 富 直 锰 脉 缚 娠 员 厩 舰 潍 疚 沁 谬 份 讫 燥 沂 禹 馆 拼 寝 堵 沏 驼 蛋 白 质 研 究 技 术 蛋 白 质 研 究 技 术