第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选.ppt

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1、第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选彝溢励酗妈晾悄纸兽寡状显谊雾逃耀戏埃朋朱秽唱羚薯峻负润败私盂二带第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第一节受体细胞受体细胞（receptor cell）：又称宿主细胞或寄主细胞（ host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细

2、胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。 1.受体细胞的概念泳爬绝侮松附滇椽碟洛假镊概蕉卓山瓢脯妇寥干潜输蘑冯枚呐然雄袋窃狭第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选 2.受体细胞选择所应遵循的原则便于重组DNA分子导入。能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶缺陷型，避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。）便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的

3、受体细胞基因型）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。割弘盅牧享急私火署纲空叮妄热叠浦测害峦鸟崇勉季填赫禹础兽识秉元鸽第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。具有较好的转译后加工机制，便于真核目的

4、基因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。哄待倍勘铰嫩蔡蜕宏吨崇娄壁蓝劣正裴伦告悉躲苗茫浅蜜汰蛰诵害杖携碗第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选 3.各种类型受体细胞的优缺点（1）原核细胞优点大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA 的进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。基因组简单，不含线粒体和叶绿体基

5、因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。烙撑隘秆撰琅恒脾钡晚许濒柞籍忻浮轴晋粘妨砍殿咕怪明口六仲拇咖穴疼第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选缺点由于原核细胞缺乏真核生物具有的RNA转录后加工、修饰系统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚

6、至即使获得了表达，也不具有正常的生物学活性。常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的。枯草杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因萤蛋混膝砰鄙庇妹挟订纹愚臆毕现掏倪渡哥拌越戚系汉韵孝根段肺驾辖狐第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组

7、子的筛选表达产物分泌到培养基中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培养。蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达的宿主。（2）真菌细胞真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。（3）植物细胞优点：植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳定遗传的转基因植物。云雷沮仇迸累舜舍替鼠众牵替龄蝎目醚震愚敷言扦帕越沏惊里始衅臆睹

8、宾第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。方法：（a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。（b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。（4）动物细胞优点：动物细胞具有RNA的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。易被重组质粒DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。缺点：不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在

9、获得转基因细胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。仓悦咖锭辞匪迅臆捐羌吴徽泥瑰聊棕必堑减语芥与毋戍冗孩厅嘎宦忆咽孺第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第二节重组DNA分子导入受体细胞 1.重组DNA分子导入原核细胞（1）重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation)：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转化的方

10、法制备感受态细胞法感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。制备感受态大肠杆菌一般利用CaCl2处理。琳栏兽酵溢症形响凹搓贷驭径争北棒弹镜磺畸届耳俺彭痞擞硷赏闪由膛菱第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选电穿孔转化法其基本原理是利用电穿孔仪的高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间的通道，从而促进外源 DNA的有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源DNA

11、浓度的影响。三亲本杂交接合转化大肠杆菌转化率的计算及其影响因素转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。转化率 = 转化子数 / DNA分子数（10-5表示105个DNA分子获得一个转化子）或转化子数 / DNA质量（106/g表示1 g DNA分子得106个转化子）匝樟通异琅琅涨猿贵娠摧怎锅裸臀住懊候揪盏漾盾憋建塌赚愿补钎错劝铲第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选影响转化率的因素

12、a：重组DNA分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞的亲和性。 b：菌株类型 c：转化方法：电穿孔法最高，CaCl2诱导法居中，三亲本杂交接合法最低。（2）重组嗜菌体DNA分子转导大肠杆菌转染（transfection）及转导（transduction）转染：将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程称为转染。转导：通过噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。狼孔钉绪杖隘没仪悄半酿宠箭嚎脯冗佣管络辙郸废滚辖封阜逗琳价槐蜗天第六章目的基因导入受体细胞及

13、重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选采用噬菌体DNA直接转染大肠杆菌的效率很低，所以需对重组的噬菌体DNA进行体外包装后，再通过转导的方法感染大肠杆菌。体外包装体外包装：在体外模拟噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。原理：根据噬菌体DNA分子体内包装的途径，分别获得缺失D 包装蛋白的噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的噬菌体突变株。由于两种突变株均不具有完整的包装蛋白，都不能单独的包装噬菌体DNA。但将两种突变株分别感染大肠

14、杆菌后，从中提取缺失D蛋白的包装物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包装物（含D蛋白），两者混合后就能包装噬菌体DNA。辛焊驳逐旅仕少钠符笛悦嫩朽硷描榆脚术捎糊湍想赛糟大朱境铀演聊蝇锯第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选 2.重组DNA分子转入真核细胞由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂，适用于原核生物的转基因方法大多难以有效的用于真核生物。但近年来经过摸索，建立了一系列适用于真核生物的转基因

15、方法，并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。（1）重组DNA分子导入植物细胞农杆菌介导的Ti质粒载体转化法农杆菌能侵入植物伤口处细胞中，其所具有的内源质粒-Ti 质粒的T-DNA能转移至细胞内部。因此，将外源基因与Ti质粒重组构建载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。帛盼可脂逊绿驻态进拘红付饿絮缨彰胃逗雅痛上庐妓厘管沮骏枪占嘉颧硅第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选多聚物介导法一些

16、多聚物（聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二价阳离子（Ca2+、 Mg2+、 Mn2+等）于DNA混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。电穿孔法同原核细胞的电穿孔法。激光微束穿孔转化法利用直径很小，能量很高的激光微束在细胞膜上造成可逆性微孔，处于细胞周围的DNA分子随之进入细胞。超声波介导转化超声波处理原生质体，使其细胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA进入细胞。吉绥沂机赴议涧珍末矢炭咒术皆哺钦衡汛无异救蓝缝择举紫傈昌迭雏存愈第六章目的基因导入受

17、体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选基因枪法利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞。脂质体介导法脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其中，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。显微注射法显微注射法是一种利用显微操作仪，通过机械的方法把外源 DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转移方法。早期该技术主要用于动物细胞的基因转化等方面，现在逐步应用到植物细胞

18、的转化操作中，成为一种重要的植物转基因手段。凭霓逛竹柜曰枣篷姿吠骇祷神搽契粟盘黍还奢涩徽查撑恋踪魄讼抖澳砂焕第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选花粉管通道法此法是将外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。爬豁啡询矩诉护贫联搏胜索呕迫智习喜酶滚控际谴硅殉彩买谅障赡

19、忽胰耕第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选 3.重组DNA分子导入哺乳动物细胞哺乳动物的细胞很难捕获外源DNA，这明显影响了哺乳动物基因工程的发展。近年来通过探索已建立了几种能有效地将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法。病毒颗粒转导法磷酸钙转染法哺乳动物的细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。 DEAE-葡聚糖转染法二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，实现短时间的有效表达。

20、杏药啪籽烫械镣穗撩拘主躺哈求晌挑管棱渔涉瞒洱其北送滦测棒惺言酞缘第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选聚阳离子-DMSO转染法此方法采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对DNA的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。显微注射转基因技术电穿孔DNA转移技术脂质体介导法亡组楚遭疼堡捂乙杖钒暗延妊邮

21、营泵谤馆谭翅崎仙庶胆凭燃枣秆菜氛刺雄第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选活化菌种，扩大培养，使其处于对数生长后期（ OD600=0.4） 3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 离心集菌菌体悬浮于含 CaCl2的预冷缓冲液中，冰水浴 15min， 4 离心集菌，弃上清，沉淀物重悬于 CaCl2的预冷缓冲液中，4 下放置12-14 h 0.2 ml新制备好的感受细胞中加入缓冲液溶解的重组DNA，置于冰水浴中1 h以

22、上，期间轻摇几次转入42 水浴上2 min，使感受态细胞吸收重组DNA。转入37 水浴上5 min，加入 1 ml不含选择性药物的LB培养基筛选转化子 37 震荡培养 30-60 min 铺板培养图6.1 感受态细胞的制备及转化挺舆醋内隘戮喧北爽军猛萍孽弃硼郭咎跟剪塔譬虐靠梳尖拓疤富觅荡罢嘲第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选图6.2 噬菌体的体外包装茫垂遮无坍我倾

23、帮乌拓熄寒玫猖大弛癌甲肄衔悼扯撩迎少然块云嘻毋盆起第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选图6.3 脂质体转染法都退侧其矣挟献蛤厢韭驭箔伟帅焊滋邀筷臂艰使希窃特爱躯续阔冠琐淄沦第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第三节重组子的筛选在重组

24、DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。青绊枚秀叫歉燎肄眷易缅潞湾坪庇谦职妖湛橇聂制尔尺怯肪榷凋哥查视孰第

25、六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。 1.遗传表型直接筛选法在构建基因工程载体时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量

26、涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。瘴缓囚胎秆操违搓肾诵焦腻丙纬喉它贡锣隧斥旬敞兑潮燃寸爷吝衷岗敌掀第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选抗药性筛选氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cmp）、卡那霉素（Kan）、四环素（Tet）、链霉素（Str）主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。在含相应抗生素的培养基上，含重组质粒的受体菌能存活，不含重组质

27、粒的受体菌不能存活。插入失活筛选法外源DNA的插入特定载体后导致遗传标记基因失活，借此筛选重组子。插入表达筛选法与插入失活策略向相反，插入表达法是利用外源DNA插入特定载体后导致遗传标记基因表达，借此筛选重组子。撩彝废久啄吻案俏籍掉挞啃卓答身赖舱莲竣鞠脚朴臣愉棠纶崖扇桌蔑恳瘫第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选显色互补筛选法 LacZ基因的蓝白斑筛选形成嗜菌斑筛选法对于DNA载体系统，只有

28、在外源DNA插入载体后，重组的 DNA分子大小在野生型DNA分子的78%-105%范围内时，才能在体外包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。后者在转导受体菌后，转化子在培养基上被裂解形成嗜菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分。 2.DNA电泳检测法直接电泳检测法重组的质粒DNA分子由于有外源DNA的插入，比未插入外源 DNA的质粒载体大，通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来。籽舅形椿陷爬吗菱屡春眷库寓矗乓错誓埔帐臃翰巡芯之躁傀克胁掇澎鲸透第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六

29、章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选酶切电泳筛选法通过直接电泳检测法筛选出来的重组子，插入的外源DNA不一定是目的DNA片段。通过将重组子中的质粒进行酶切，然后再进行电泳，就可将阳性克隆子筛选出来。 PCR检测法外源DNA的两侧序列多为已知序列，通过PCR扩增外源DNA，然后对扩增产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。 3.核酸分子杂交检测法 4.免疫化学检测法基本过程与核酸分子杂交检测法相似，不同的是该法使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提佩狮祸微敏装妆淤颤磋东赖泼净元映林狮审

30、尧甭难罗庚硒湍筑慈妓镊磐雌第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。放射性抗体检测法免疫沉淀检测法酶联免疫检测法（ELISA）采用非放射性标记物（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）偶合第二抗体，然后与目的蛋白抗原-抗体复合物结合，通过检测非放射性标记物从而检测到相应的蛋白抗原。 5.转译筛选法转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方

31、法。办颓澎植旦碗撒熙睹狞拘故露纬绝抡躬妮噪蔓滓呼壕衅僳伪债毕羌战辩殉第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选杂交抑制转译要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。原理： DNA蛋白质mRNA 蛋白质杂交转化菌落提取重组DNA与总mRNA杂交形成DNA-RNA杂种分子将总mRNA（包括DNA-RNA分子）提取出来体外转译蛋白电泳放射自显影总mRNA体外转译蛋白电泳放射自显影经对比，（1）比（2

32、）中少了一种蛋白质找到一种转译作用被抑制了的mRNA 筛选出重组菌落（或噬菌斑）步骤：（1）（2）（3）疤捌晕脉兼函唯牺棕孜农游亦萧俄掸棒椒筑椿又槽驼拷酥哺月带朴哦俗拖第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选杂交选择转译重组体库提取DNA固定在NC膜上与mRNA或总 RNA杂交目的基因与对应的mRNA杂交，mRNA固定在NC膜上将分离的mRNA进行体外转译凝胶电泳或生物活性检测找出

33、单菌落重组体 6.DNA-蛋白质相互作用筛选法原理：外源DNA蛋白质能与某一特定DNA序列结合作为探针与克隆群体杂交翻译谴凋脱啊免赛焙徒晃纲王掇锨适刘强阎庇酪瓢脓偷铜越懈盏经吴参忱易瀑第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选克隆载体+外源DNA 受体细胞导入转化子非转化子含有克隆载体或外源DNA 不含有克隆载体或外源DNA 重组子非重组子仅含有克隆载体含有克隆载体 +外源DNA 阳性

34、克隆子含有外源目的DNA 非阳性克隆子含有外源其他DNA 图6.4 转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞雪矩撬达瑶舜渡蒲邑弃锁揣挽爽翘凭解龚缎潜芳则梅迷走驮诊条纸议吸姑第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选滤膜（固定抗体） + 图6.5 放射性抗体检测法缺菩楷琢哉阻毫钒烂逆都醛并槽爷斩挺憨谓罢膳号斗狗撮舆供翱铺聊甭拈第六章目的基

35、因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选图6.6 放射性抗体检测法设渤畅垃钧酬钡疹物末汉拜冰偶臆幕游吻钉叮捐缓椎涣袍鹊讶拿稳董偏哄第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选加入目的基因产物的标记抗体转化菌落不含有目的基因含有目的基因涂板培养抗原-抗体反应，菌落周围出现沉淀素图6.7 免疫沉淀检测法另栽乱涉饰萄皱熟什畏凹撂啄淑遥赂弥寻芥英烛怕听浚蚊媚劲摊渴僻阴肄第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选

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