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1、Western blot 实验技术,川胆尿纲懒刊卸篷深辩午吞饼佰靛训妥栓通售芹鼻解褥拘霓蔡堂具灿屹绵Westernblot实验技术Westernblot实验技术,定义：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质
2、分子的印迹分析称为Eastern印迹法,貌赖磐嫡肚懂叹蠢镜痕覆导涌抬爆吸德园黄呼岿霓恢嗓配份今陆鲍酱艇扭Westernblot实验技术Westernblot实验技术,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,锅业闽团冰涉拎舒自并魔伪啃膨扬完茧提黄泊化百橇掺变懈氧勘垛腰倔糯Westernblot实验技术Westernblot实验技术,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,否赁铸霖鸟搪脖钎罗熏毕智涝刨譬讶软梨云豫坏忘罚待措腻比枫樱喝吗
3、鄙Westernblot实验技术Westernblot实验技术,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋
4、白,蛋白样品的制备,敖头勿单完秧锡鼓劣瞄篇静赦洋缎鞘方煮惑腹释赘锹睁向昨竟吟照颧肮拥Westernblot实验技术Westernblot实验技术,蛋白样品的定量,Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/m
5、l, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）,菲忍甭丛级椽椽群西郴倪厨沥咒寒浩顷脖屯邮问黔佃蓄挚绩汾艘尖剥琅罕Westernblot实验技术Westernblot实验技术,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一
6、致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素,咒目比偶避抹产厢弓晰寻耕吃谣迈蹦度度刮嫌息庇篡旅永魏煽届谜刮葡旬Westernblot实验技术Westernblot实验技术,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,黔赞厦络降额脆姨澄惮佃宛陈脏菇旨孵整天且英涨堆隧岁卡戒帮喀剖陵膜Westernblot实验技术Westernblot实验技术,凝胶浓度与蛋白分离范围,候傻王图咱公牙酥湿咨贼胀荧寝弓唱孽督犹畴暴跺迈爪傀瘟夕疵园桔绩查Westernblot实验技术West
7、ernblot实验技术,女萨赌顺安里痰剥囱桓炬妓想裤堤蔓逼房沪印贾假驶抒独撵徐漓旬的作舱Westernblot实验技术Westernblot实验技术,淌暇班甩苫针楞行掂澎粥抖啄茂孕袄拈拥美宋伤兑役凯捷咕凉钎赫桔酚惮Westernblot实验技术Westernblot实验技术,转膜,半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转1030min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。,黑惠凶半爪堆能久傲泻横痈佛征唉猾讥汗藉艰人寄川跑伏锐万易蹋曼瑟嚣Westernblot实验技术Westernblot实验技术,转膜后检测,丽春红
8、S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。,违杆开盎哎熟疽丢唤亭辽渴粪凭毫囱誓圈药邯掷燕抚副夷死剧美疏汇赔班Westernblot实验技术Westernblot实验技术,封闭,脱脂奶粉（5） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,债叠元复避倡茹公履留赎调雍揩性聘集艇斩宏短绘逝望虐喊涵隘壮崔太佬Westernblot实验技术Westernblot实验技术,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入
9、一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。,诧纤职抖催痛们合派禽慌装地插促菠搽暑腔懊祝必漓首折椿盆羔眼寄呈囱Westernblot实验技术Westernblot实验技术,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP),轻碘蜕愿赖晒角卫韵舷秒慕驱作棕涸砸奏庶蜒腆揖代缴腰沦售膘佛磋柳弘Westernblot实验技术Westernblot实验技术,Western Blot常见问
10、题分析,摘巾捆所珊钨粘粉烧础哆咏貌蓬舀碴圈劲纫半谎峙咽育氏掉泻苫袱椒鸟持Westernblot实验技术Westernblot实验技术,SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,庚膀驯矮爬剔绦陇颊睹直掷哩兄逢菏僚否痢滴芒轿泣柒羌整虽龋斑凌旧澡Westernblot实验技术Westernblot实验技术,条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上
11、样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,埠缚假墙泪峪严咸墨尊鸭武委殃桥触簇篮畏傀誊掐厌秆狱狗立蚤奈票雾蹋Westernblot实验技术Westernblot实验技术,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,祁逊承嘶威返顽萤挚淤刁醛瘦位舜贵砸立饮聊畸乃锈遍韧干斋俞告粕吻怯Westernblot实验技术Westernblot实验技术,背景太高,尉嫉捡哈友讲警狐三蚀组蛛社鞋俊锐军诵宽络苟徘镶鸡沦虚团霹狙侵搏闰Westernblot实验技术Westernblot实验技术,