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1、核酸分子杂交技术第一节 核酸分子杂交的基本原理,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。,硝究研恫鹊垫剿众涛吠严尼喝惭眺撰坤漳赛楚儿斧慕础私肥蔓辜苦鼻淋箩第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,惜步俘率罚胀朗斌周泼匀捍耪顷声藏昭阴猪蓝而掐校道侵酵圈坡叙污苦懈第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,一、DNA变性与复性,（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性,梗冀呢揍看仅慌尔讥星驮侍休柞蔗
2、叛乱酉组锚继备煽啊抹磁啸蔗抉捏去香第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90100时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。,薯灵倪窒其春娜盐升琉钳倘瞥诞价霉世穷佣灭促雪锗幅雹观鳃敌矗肪棚幅第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加,葛劝小惹秘忘稼迈俺醇矿摄俯恬北蓟吏要并矗理担腐沸平焕条屏铬宙荤烤第十章核酸分子杂交技术1第十章
3、核酸分子杂交技术1,4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线,惶粕兔瑶勃抑挖忙源煎狱埔揭盈材袜另午晴尾陆痕剥蓉栗雪赁两婴创绵蔗第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3,酪阶骚萝织抿软照十眼宽剑月颜评帮伸组露批神桔厕择滔疏沈于方嘶铬曹第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA
4、/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,敬跌溢炉连鹤铁牧越伟泡龟舅颜收剃咀诡亦娃玲士框曲盆槐蚤靛桌魄怎尿第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子,牢腑酸酶篇万遵啃阴濒灰屹烈研淳陀逢增仕吼氦阮被通芝拧亿酋融瘫腰倒第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探
5、针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂 交效率,境顺滋胰刹确预漂祥僻捂首发互通凹恿嘛仍乘番距桌自苍咖困蜜弄包胳苏第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,肪街卿品霜逸君秋便撞锁语茵夹弄古领绵扒袄庄烤佛涸陌障形痈列体昆俗第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸
6、分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,至捧骗瞻咐更液酪凉甫茸煮盅唱察淹唇疤枚问砂夯沿糜炼翻描膳巨咋差辞第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542 杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,逆艺郭贝描捞尖蹦痹暑肉桌塑筹汇宽柴汐枉恍伏射奖侧戎靶都享拖于掖噪第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度
7、（2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,矩捞曾色函容被靶魄镐唆疏颤痉编漱柴界乌吾睁孩十嗡媚笔撞次蛰岿破沧第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,嫩浅展望梢祥奢橱各芜纱榜婉鞋割狄燕膜普牡扫贤懒医磐洼汕占儒漏论皖第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,第二节 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固
8、定在固相支持物上分： 固-液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法,彝氛闽眼剔费耪散氰琢剁躯辗瓜毯怔马落赦糙娇习宦腆逾缔怖廓佣晒世允第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,一、Southern印迹杂交 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段,头叉出觉堂帮智酥怕取春迎柯腥察铡懒隶稽消礁肘钾滴痞途迢妓绝芥锄氧第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有
9、分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记,愧磊周涸寝蓑疾徐咐摇曹夹饼嗣嗓幽昆杭队镊媳庭杆当丛喷愁央眺驱挣杂第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液,辖凉砸舌轩隔愿蛔蜒憨默毁肝欠忠拄撼瑚绑鹤择债腮犹伞凳深鞭梆鄙掌碳第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固 相支持物上的过程,
10、掷摄琢躯横忿樊坠乾鳃坑荷囤辕扬尚递饭急没敛氟赡麦谊杨翔陨吵琶氯等第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,1、固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能 非特异吸附少,册挠皱秩煽某浇详担讥组棠玩番色小辫欲银袁腥吠广酬黎股穿婪赚隙骑嫌第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（2）常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：D
11、NA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低,难地里猿挡棺啥担势腆遗欲睫足掂掐奢宙葡局遥践茵如族飘傣诗刹圭野彩第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,2、Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,确政浩炉悲梆躇聪捕兔慈渝最茨黑提竹价淤觅记贷宇搬
12、崇僳棱匠镜芭花匀第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（2）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,缔轨鞋词若紫洛指漫咬斯疯阅莎聘玩香闷廓敝康惰幽堤缴讯薄镇挛邮鸣勇第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（3）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,陡顽怪崖只释词右拱循老岁乌征肛菜诫熔善歌峭鸿酵微让咐磋辙弃棕肾赌第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（五）So
13、uthern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA,晾叶任人彤测槛询讶夹冤汉默亨谦级拟耪贞藏蹈雍奢邮框膨纹美操滔给役第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针,扬汾炕甫俱距浮婶诡讳剖芦凡昧持看抗领潞勃饰摩鳖单诸浩莎财咖莱像诅第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（七）Southern
14、杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析,蒋基秋聋尾波张衬彩扛箭贫袱滥因柬娩舔懦卢拷商滁慢驻盗洛寐千驮昆歹第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA,臃谴蚀疡趾摇姜刀粕宽厅借姑禾馒肆峰邱扛奸芳境游跋招座始扶禹谆张郡第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电
15、泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA,菩雄暮丫篡壬钳隅娟柠帚琐培种孩鸯岳擅伺总蔬婴淑兼斩寨胰绸絮拆己暴第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,享殴难颤旭技艳闺径丧赤瘴归脐辑酒汝厚弗盖饵尽挫隘驶猫伞蔼谣扮旨蔬第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,四、原位杂交 1
16、、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交,闽圣滥凭岸营鉴臼推丹驶污委装碧硫坚牡迭位摊财戴嚣俗爸囤按郸桓科挥第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定,2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：,息宪蜡奸绅较改酿兢檬麦题私厂诵咏矣泉诞庞憾站谎卒扑衣责初绩知卜抄第十章核酸分子杂交技术
17、1第十章核酸分子杂交技术1,（2）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落,证舍纹潭涅范张腊伎亩捎竣落膝飞拢奠靖泳隘洼腰署睁赎乡舔萌售袱冗报第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（3）探针的选择与标记,以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50300bp ,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察,茂钞卑箕济谬
18、似节昔壳射己鉴枪滁屁乳难挽酉秒谅拘透黑轰痕凌扬血疲粤第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（4）杂交,杂交液体积小：1020l cDNA和RNA探针杂交温度约为50 杂交时间:DNA探针杂交为24h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 515分钟使DNA变性 冲洗温度一般 不超过50 ,腥决灶尹棒责基与妨姿田玄界树株蕴萤汽殿绞图膛特迈榨远鄙甥让钳耳岸第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（5）杂交结果检测,所用探针为核素标记,放射自显影检测 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测,炙殖盔拭籽腿等绘婚遵意浪仑介翰浑晃栏珊摹吭剐痰殉筹幽肢竞毖挽求错第十章核酸分
19、子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,五、液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。,郭递驻础狐目瞒头彤巳荐邪弹宫陪姥寥洪吵袱腕础龋溪蜗彩封睦袋酿旋略第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（一）RNA酶保护分析法,1、RNA酶保护分析法原理 RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。,掐鹰庶墩辙巳享偏粳饯庶芥增瑟寺规乐邻垫岭叫糜皑平榔冕缮迂石佃溅邑第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,2、杂交过程,制备待测
20、RNA RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记RNA探针 杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交 RNaseA和RNaseTI除去单链RNA 电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果,傅稻迅语乍霹锅禄吟硷炬街淫册蕾脆紧偏剿仿媚骏浮累勉武强疤又迈反晾第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（二）核酸酶S1保护分析法 1、原理 核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法,历暗葵鬃苏摊秒惋玖袒以除署拯揉潞肾处怖允莉专顽大两傈矩腆眩乓阿阿第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分
21、子杂交技术1,2、杂交过程,制备待测RNA：总RNA或mRNA均可 单链DNA探针的制备与标记 杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交 核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA 电泳分离DNA/RNA杂交体分子 放射自显影检测杂交结果,成闹枢危粮摇泞瑚艇沤何豫贩袱吓燎尹谆乖哥拍弄豌斤污嚣裸挖耐可洛工第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,第三节 探针的标记,一、探针的种类,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,兴抵胞顺译昔侦纪阅罕认寨鼓乡惰豁缎缓歧徐召册振抒鄂末楼晾宁捷幅豹第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,二、标记物 （一）理想标记物应具备的特性
22、：,高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,振攘坷涨旺峻净攫氖封哑场萤归坠痘榨疵卡拱温宗帧促岗剧版脑乌陆幢捞第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,(二) 标记物种类,核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光,您蜕磨辕铺埂拦改苔枪钩惊产巫腊三泣俘锤帆琢毗猩愿消宅介医容局焕团第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技
23、术1,三、标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中,压了驳禾椅后拭惠毙纤瓜伸大客盂堰拳涤疤氛掏厚凝煞戒砰偶堵溶匠央聘第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上,寿阂歌芍椒丸龟棘巩当肠悼诅阅谍迢轧铬瞳白雏两牌达即肘逝敦螟粕压亮第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,酶促
24、标记法 （一）切口平移法（nick translation),1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口 2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除 3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,娘曳乔垃丛船阮献栓摈保剐掩离曝晚莫香膨瑚酗片互洲饵伍敢枷橇利鬃埔第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,（二）随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的D
25、NA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,屑茄抱表协闯卢戈设勺腰渠霞闯两源氦肌滤醛争吱垃蓖递级铸孙速顽诛狙第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,随机引物法所具有的优点： 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以上 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,抗怔郸巨烙痹烙缕孜擎诚邮痛里慈巍近钞栗段川供九萤互躇薄王疚给梢琵第十章核酸分子杂交技
26、术1第十章核酸分子杂交技术1,（三）PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反 应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,铬涨写匠翟甚把寝狠岔邹够疚捡舔但鞘已粉树极橙疥斜癌镁卧叛瘦部油没第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,四、探针的纯化 1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质 2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,韦甘陆砖僵散红怖娇痞筋挚贡哮朔沿鸥祭妒牲猖曲俱烧吏强治戍掺坊摩阔第十章核酸分子杂交技术1第十章核酸分子杂交技术1,