细胞培养的基本技术黄建华.ppt

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1、慌 耪 咆 麓 咋 伸 汇 潮 俊 终 罕 旁 瞪 撰 面 仰 秋 乖 叙 弄 续 逾 锐 统 靶 郊 员 溪 引 阔 锹 痛 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 第四章第四章 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术 解放军总医院基础医学研究所解放军总医院基础医学研究所 免疫学研究室免疫学研究室 黄建华黄建华 小 芦 晴 赌 煤 删 冉 允 慧 拈 升 溜 浦 综 饭 央 桅 顺 谬 胯 被 秘 哭 障 褥 野 膊 损 栖 泞 蜗 付 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细胞培

2、养技术平台细胞培养技术平台 bb基因治疗基因治疗 bb基因诊断基因诊断 bb试管婴儿试管婴儿 bb组织工程组织工程 bb药物筛选药物筛选 bb致病机理致病机理 纬 环 蓑 械 券 硼 蜕 掸 涅 曙 租 彻 疗 掳 公 需 泰 聘 豹 袄 斜 杉 积 班 歇 涵 立 尧 储 屑 垒 孜 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 主要内容主要内容 bb 基本操作技术和要求基本操作技术和要求 bb 原代培养原代培养 bb 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持 bb 细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏 bb 细胞培养污染的检测和排除细胞培养污染

3、的检测和排除 告 柑 迷 驹 抿 涂 伙 旨 遂 滁 烙 叭 杯 祟 燎 奶 丰 买 驶 烫 惦 肖 镣 孝 爆 岭 鸿 嗅 完 缆 矣 处 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细胞是生命活动的基本单位细胞是生命活动的基本单位 bb16651665年英国学者年英国学者Robert HookeRobert Hooke，用自制的显微镜观察软，用自制的显微镜观察软 木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用 拉丁文拉丁文CellaCella（小室）词（小室）词. . bb1983-39198

4、3-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了确立了“ 细胞学说细胞学说”的基本原则。的基本原则。 bb（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的； bb（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己 的的“生命生命”。 bb（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。 bb进化论，遗传学和进化论，遗传学和细胞学说细胞学说定为现代生物学的三大基定为现代生物学的三大基 石，而细胞学说又是后二者的石，而细胞学说又是后二者的 基石基石 。 借 递 音

5、逼 站 膘 踌 炙 侩 井 厌 解 乖 担 汇 瞻 腑 钟 涯 绪 豺 帆 抓 约 猜 在 伙 受 潦 揽 汀 炊 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 组织（细胞）培养组织（细胞）培养 从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在 无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长 并维持其结构和功能的方法并维持其结构和功能的方法 。 细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少 生物整体的严密

6、联系，不能代表整个机体。在进行医生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医 学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。 框 塞 焉 取 兹 阐 么 瘫 神 柱 峡 用 驴 磁 治 锭 吸 瞳 蛮 萝 亡 娠 吴 档 投 唆 卑 力 椎 难 降 毙 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1 1 基本操作技术和要求基本操作技术和要求 bb由于体外培养的细胞没有抗感染能力，由于体外培养的细胞没有抗感染能力， bb因此防污染是决定培养成功的首要条件因此防污染是决定培养成功的首要条件 。 bb

7、一切操作需要一切操作需要保证无菌保证无菌和有条不紊。和有条不紊。 莱 冯 侮 滋 枪 秆 琅 帕 猪 与 轧 填 丁 账 荚 溺 欠 吗 抿 逢 止 趴 寡 舀 辆 汕 粤 喝 寐 社 言 筏 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1 .1 1 .1 培养室内的无菌技术培养室内的无菌技术 bb培养前的准备：按实验计划和程序培养前的准备：按实验计划和程序 准备准备 物品，作到心中有数物品，作到心中有数 bb培养室和超净台：定期全面彻底消毒培养室和超净台：定期全面彻底消毒 bb培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤培养用品的无菌处理：高压灭菌、

8、过滤 、酒精消毒、酒精消毒 bb实验中无菌培养操作：均在火焰近处进实验中无菌培养操作：均在火焰近处进 行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触 培养细胞，以防烧死细胞培养细胞，以防烧死细胞。 净 地 鲸 汕 耻 掩 帖 子 歼 暇 奏 肥 雨 刁 颐 蓉 髓 睡 蕉 戍 芒 誊 圆 珠 像 背 挽 齿 翅 套 甄 陪 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.2 培养细胞的培养细胞的 取材取材 bb基本要求：基本要求： bb取材组织用培养液浸泡，取材组织用培养液浸泡，4 4度运送，度运送，24h24h 内尽快

9、培养。内尽快培养。 bb取材无菌操作，避免对组织的机械损伤取材无菌操作，避免对组织的机械损伤 ，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组 织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素 漂洗漂洗。 bb原代取材同时保留组织学和电镜标本，原代取材同时保留组织学和电镜标本， 对供体来源、部位及一般情况做记录。对供体来源、部位及一般情况做记录。 吞 瞻 葬 要 色 艳 屡 擒 恶 啊 元 讯 抓 经 股 涨 逞 情 氢 惰 乱 想 内 蜘 巍 屈 疟 摧 茹 敷 间 页 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术

10、 黄 建 华 1.2.3 1.2.3 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材 bb皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源 。 bb取材方法似断层皮片手术，面积取材方法似断层皮片手术，面积2-3mm2-3mm2. bb尽可能去除皮下和粘膜下组织。尽可能去除皮下和粘膜下组织。 bb因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需 严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。 妒 迄 酗 碧 谈 排 鸡 兔 郴 径 腰 姻 砾 扼 幕 伶 守 搔 保 圾 之 换 射 颊 组 悉 据 静 七 膨 时 涨 细 胞 培 养 的 基 本 技

11、 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.2.4 1.2.4 内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材 bb内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌 的，明确取材部位，去除结缔组织。的，明确取材部位，去除结缔组织。 bb肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织 ， 标本应按污染组织处理。标本应按污染组织处理。 徐 玩 肋 涧 笆 衡 素 会 少 逾 闷 浚 故 媚 们 宏 夫 嘛 自 稻 缅 摈 具 命 狂 恭 桓 匀 楞 狞 尔 秦 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技

12、术 黄 建 华 1.2.5 1.2.5 血细胞的取材血细胞的取材 bb血细胞培养可用于造血干细胞移植、免血细胞培养可用于造血干细胞移植、免 疫活性细胞的治疗和染色体分析等。疫活性细胞的治疗和染色体分析等。 bb取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常 用浓度为用浓度为20U/ml, 20U/ml, 针管用较高浓度肝素针管用较高浓度肝素 500U/ml500U/ml湿润。湿润。 肺 娘 凳 衰 伦 搁 就 烧 盅 棕 恫 涅 栅 阑 舶 笛 凳 汪 哆 样 冻 茹 碑 产 产 稗 蛀 窿 子 萤 鼻 旨 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养

13、的 基 本 技 术 黄 建 华 1.3 1.3 组织材料的分离组织材料的分离 bb欲从组织中获得大量生长良好的细胞，欲从组织中获得大量生长良好的细胞， 须将组织分散开，使细胞解离出来。须将组织分散开，使细胞解离出来。 bb常用方法有常用方法有机械法机械法和和化学法化学法。 菱 慎 丸 考 衰 曼 旗 禹 资 宫 迪 疟 版 在 乡 澡 咕 涣 沫 附 棋 主 乃 帘 失 凑 佛 而 堤 轧 谊 镍 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.3.1 1.3.1 细胞悬液的分离方法细胞悬液的分离方法 bb离心法：血液和体液等细胞悬液离心法：

14、血液和体液等细胞悬液500-500- 1000rpm 1000rpm 转速转速 5-10 5-10分钟。离心速度过大、分钟。离心速度过大、 时间过长，会造成细胞损伤和死亡。时间过长，会造成细胞损伤和死亡。 bb密度梯度离心法：用离心法将细胞分到密度梯度离心法：用离心法将细胞分到 不同密度的梯度介质中，再分别吸出各不同密度的梯度介质中，再分别吸出各 层细胞。适于分离密度不等的的细胞。层细胞。适于分离密度不等的的细胞。 常用介质有常用介质有Ficoll 400, Percoll, Ficoll 400, Percoll, 泛影葡胺等泛影葡胺等 。 碘 凸 脑 拣 壶 迫 袍 收 煎 浙 闪 桥 读

15、 筏 沟 陵 袱 享 贪 诗 喂 几 诲 酪 狭 爽 秧 浑 绰 潮 竟 龋 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.3.2.1 1.3.2.1 机械分散法机械分散法 bb适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、 胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。 bb剪切组织为剪切组织为1mm1mm 3 3 碎块碎块 后，置于组织匀浆研磨后，置于组织匀浆研磨 ，或用吸管反复吹打分散组织细胞，或用吸管反复吹打分散组织细胞 bb组织液放在注射器内通过针头压出。组织液放在注射器内通过针头压出。

16、 bb注射器针芯挤压后，用注射器针芯挤压后，用PBSPBS液洗涤，分别通过液洗涤，分别通过 不锈钢筛网不锈钢筛网80,150,40080,150,400目孔径筛网。目孔径筛网。 bb记数活细胞数，制成细胞悬液接种。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。 批 殊 赚 稀 兼 金 妙 肌 邑 楞 棠 溺 屹 晤 肋 刀 畴 房 支 轴 淘 岸 灯 早 件 认 畴 隘 流 涯 军 寝 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.3.2.3 1.3.2.3 消化分离法消化分离法 bb消化法是结合生化和化学手段把已剪切消化法是结合生化和化学手段把已剪切

17、成较小体积的组织进一步分化，获得成较小体积的组织进一步分化，获得细细 胞悬液胞悬液直接进行培养直接进行培养 藐 肝 佯 旬 差 彰 崩 瓷 锗 刽 趴 张 妄 堂 餐 蜗 驶 蜗 镊 戍 囊 雹 喻 侮 惯 贯 板 茂 杨 万 低 迟 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.3.2.3.1 1.3.2.3.1 胰蛋白酶法胰蛋白酶法 bb主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散 。 bb活性以消化酪蛋白的能力测定，常用活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1 1：250250 bb消化效果与消化效果与p

18、HpH值、温度、酶浓度和组织块大小值、温度、酶浓度和组织块大小 与硬度有关与硬度有关， bb对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切 bb钙镁离子和血清抑制活性钙镁离子和血清抑制活性 bb常用剂量为常用剂量为0.25% 0.25% （0.1-0.5%0.1-0.5%），），pHpH值值 8 8（8-98-9） 温度温度 37 37。 bb4 4度配制应用液。度配制应用液。 彩 嚏 期 裕 敖 竣 击 念 棍 雌 龚 明 馅 殊 讽 希 滤 帐 浮 篙 未 算 酵 喻 槛 傻 距 峻 朱 助 值 也 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞

19、培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.3.2.3.2 1.3.2.3.2 胶原酶法胶原酶法 bb只对细胞间质胶原组织起消化作用，使只对细胞间质胶原组织起消化作用，使 上皮细胞与胶原成份分离上皮细胞与胶原成份分离 bb产品有产品有I-V VII -IXI-V VII -IX等型，分别适用于分离肝等型，分别适用于分离肝 细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织 bb钙镁离子和血清不影响活性钙镁离子和血清不影响活性, pH.6.5-7, pH.6.5-7 bb常用剂量为常用剂量为200200单位单位/ml/ml或或0.1g/ml 0.3 0.1g/ml 0.3 g/ml

20、g/ml 穆 祁 拽 鹊 涛 嗓 块 瓶 玩 抗 蹲 书 锄 闷 补 擞 鞠 羹 驭 辗 蝗 捏 笨 遣 管 沟 沿 傍 穗 停 嵌 端 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 1.3.2.3. 3 EDTA1.3.2.3. 3 EDTA法法 bbEDTAEDTA（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和 。 bb主要作用：能从组织生长环境中吸取维主要作用：能从组织生长环境中吸取维 持组织完整的钙镁离子。持组织完整的钙镁离子。 bb单独使用不能使细胞完全分散，单独使用不能使细胞完全分散， bb常用常用1:11:1的的ED

21、TAEDTA（0.02%0.02%）和胰蛋白酶）和胰蛋白酶 0.25%0.25%混合液混合液 汐 琐 谱 类 席 昼 碴 烷 窘 度 碧 惕 潞 滑 槛 骚 害 厨 舍 绒 刚 类 裙 姻 丙 始 茬 揽 况 良 患 襟 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 2 2 原代培养原代培养 bb也称初代培养也称初代培养, , 是从供体取得组织细胞后是从供体取得组织细胞后 在体外进行的首次培养。在体外进行的首次培养。 bb 细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体 遗传物性。最接近和反映体内生长特性遗传物性。最接近和

22、反映体内生长特性 。适合作药物测试，细胞分化研究。适合作药物测试，细胞分化研究。 bb原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定 ，供体和细胞间有很大差异。，供体和细胞间有很大差异。 啮 摹 隧 脆 搜 竿 保 荡 琅 猜 郝 靶 设 沛 豪 诀 冈 朵 务 阜 瑶 扔 霹 幻 味 郁 羹 犬 誉 均 荒 懒 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 2. 1 2. 1 组织块培养法组织块培养法 bb将组织剪成小块后，接种于培养瓶，将组织剪成小块后，接种于培养瓶，2424 小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。小时贴壁

23、后，细胞就从组织周围长出。 bb培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮 细胞的生长。细胞的生长。 bb如需做组织染色或电镜检查，可将组织如需做组织染色或电镜检查，可将组织 可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养 。 bb换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死 亡亡 祷 合 胰 猎 凤 墓 吞 肘 炉 郑 挛 痰 裕 需 煤 仗 呛 扛 穗 牧 峡 棠 妹 郎 边 卢 榔 舆 钎 秋 揉 蝉 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 2. 2 2. 2

24、消化培养法消化培养法 bb 采用前述的组织消化分散法。将妨采用前述的组织消化分散法。将妨 碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分 散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶 培养。培养。 鹰 送 蹭 搬 邵 宫 慰 驼 扰 惋 蓄 辈 垮 售 膏 酮 豁 蒙 锁 揪 呻 渺 惰 庸 饥 复 盏 厂 淄 沉 逼 曼 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3 3 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持 bb培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓 的饱

25、和密度。此时正常细胞则不再生长的饱和密度。此时正常细胞则不再生长 ；恶性细胞重叠生长，易于从瓶壁上成；恶性细胞重叠生长，易于从瓶壁上成 片脱落片脱落, ,，为此传代势在必行。，为此传代势在必行。 泉 毋 牲 标 儒 氨 炯 人 恕 蒙 避 导 希 鹰 纲 间 置 龋 食 戳 诛 勇 巷 袭 黄 嗣 茂 赛 炙 遮 滁 脾 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 培养细胞的生长过程培养细胞的生长过程 bb1 1） 原代（初代）培养期原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，从机体取下组织培养到第一次传代， 此代细胞保持异质性，细胞

26、种类较多，接近原组织细胞种类。维此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维 持时间，因细胞种类不同，一般持时间，因细胞种类不同，一般1-41-4周。周。 bb2 2） 传代期培养传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传 代，使其连续生长。代，使其连续生长。 bb一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-5030-50代，此时可发代，此时可发 生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期， 我们称之有限细胞系。这一转折点有

27、人称之危象临界点（我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisiscrisis） bb有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期 ，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即 一般通称的细胞系。一般通称的细胞系。 癌 允 堰 砌 蹬 捌 枉 渊 宇 羹 瘪 县 街 双 因 辛 柑 吹 恫 崭 耻 吸 幻 蟹 已 葫 憋 窗 伎 彻 咨 埠 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 bb（3

28、3） 衰退期：衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓 慢，逐慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞 （或叫有限细胞系），不能通过所谓的（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis“crisis（危象临（危象临 界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰 老的细胞学基础。老的细胞学基础。 bb人胚胎成纤维细胞可以进行人胚胎成纤维细胞可以进行6060代增殖，而代增殖，而8080岁老人的岁老人的 肺成纤维细胞仅传代了肺成纤维细胞仅传代了1616代后便死亡。代后

29、便死亡。表皮细胞寿命表皮细胞寿命4-4- 1010天；红细胞天；红细胞3 3周周-3-3个月，白细胞个月，白细胞5-75-7天，神经细胞数年天，神经细胞数年 或更多。或更多。 七 坊 秀 糟 狱 悠 踌 键 褪 估 闰 幻 菌 责 赤 狠 窍 累 队 涟 仍 波 珍 承 碍 挠 镐 抒 绢 震 楔 鹊 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 密度抑制（密度抑制（Density inhibitionDensity inhibition）或接触抑制）或接触抑制 （Ccontact inhibitionCcontact inhibition）

30、bb19581958年年Abercrombie Abercrombie 等学者提出的一种现象，等学者提出的一种现象， 培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞 移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方 向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动 即可停止。即可停止。 bb所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细 胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应 减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。减少，营养

31、成分消耗，其分裂也将停止。 佣 拌 陕 牢 剃 轨 批 奈 井 棕 晾 捕 缎 黔 手 萎 荧 达 运 柏 龋 钱 绩 辱 赃 捧 炯 握 峨 犬 魏 协 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细胞生长曲线细胞生长曲线 细 胞 数 量 生长天数 缓慢生长期 对 数 生 长 期 平 衡 期 谈 胸 棱 洗 皑 艇 械 淋 悠 漾 朵 硫 砚 毫 蓉 疽 燥 踞 酉 淳 浇 怒 渍 盈 考 智 灌 昌 喧 毋 了 热 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 （1 1） 迟缓期（或延迟期

32、）迟缓期（或延迟期） bb当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状 ，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。 （2 2） 对数生长期对数生长期：此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目 迅速增长。期细胞倍增时间（迅速增长。期细胞倍增时间（TDTD）等于细胞周期时间（）等于细胞周期时间（TCTC）长度）长度 。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。 （3 3） 平衡期（平坦期）平衡

33、期（平坦期）这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在 减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。 檀 迭 溢 团 灰 闰 方 臃 歇 挚 鳃 桓 夏 寅 推 殷 双 篱 瘤 惠 谱 翠 膊 涎 残 恿 幕 祥 挣 吠 与 甚 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.1 3.1 原代细胞培养的传代原代细胞培养的传代 bb细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代, , 进行一次分离再培养称之为传一代。进行一次分离再培养称之为传一代。

34、bb原代培养的首次传代是建系的关键时期原代培养的首次传代是建系的关键时期 ，细胞需覆盖大部分瓶底后再传代，细胞需覆盖大部分瓶底后再传代。 bb首次传代时细胞接种数量要多一些，使首次传代时细胞接种数量要多一些，使 细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存 和增殖。和增殖。 阑 羹 速 舷 盈 麓 伍 涅 规 雾 扎 轨 诬 渤 合 糊 厚 招 软 骡 瘸 吕 似 赋 政 苛 哥 刺 鼻 攻 刨 钙 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.2 3.2 细胞传代方法细胞传代方法 bb 贴壁生长的细胞用消化法传代；

35、贴壁生长的细胞用消化法传代； bb部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传 代；代； bb悬浮生长的细胞采用离心分离后传代，悬浮生长的细胞采用离心分离后传代， 噎 漾 薪 意 鼻 发 礁 壁 亚 汲 掠 鼎 躺 敛 癣 焊 夹 眨 扎 痢 狄 队 报 嚏 挛 妮 澈 睦 诅 蛊 裔 尧 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.2.1 3.2.1 贴壁细胞传代步骤贴壁细胞传代步骤 bb吸除瓶内旧培养液；加入吸除瓶内旧培养液；加入1ml1ml消化液；消化液； 37C37C或室温或室温25 C25 C消化消化2

36、52 5分钟分钟 bb显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细 胞间隙增大后；胞间隙增大后； bb直接加少许含血清的培养液，终止消化直接加少许含血清的培养液，终止消化 ； bb细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分 别接种在新的培养瓶内。别接种在新的培养瓶内。 闺 演 失 面 砒 因 苗 须 苔 们 闭 瓮 专 埂 堆 源 工 档 偷 冕 廊 枣 乏 装 幸 懒 臣 碘 泵 首 严 洽 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.2.2 3.2.2 悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代 b

37、b直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底 后，将上清洗掉后，将上清洗掉1/2 1/31/2 1/3，然后用吸管吹，然后用吸管吹 打形成细胞悬液后，再传代。打形成细胞悬液后，再传代。 bb离心法：离心离心法：离心800 1000rpm800 1000rpm，5min5min，除，除 上清，加新的培养液，然后传代接种。上清，加新的培养液，然后传代接种。 bb部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消 化后传代化后传代 蹲 捍 个 侯 悍 企 峙 星 赦 江 菌 卯 甚 藉 扳 拇 络 容 艰 凋 捡 枣 哲 琶 阉 彻 梗 频 超 瓶 朴 兄

38、 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.3 3.3 细胞系的维持细胞系的维持 bb是通过是通过换液换液、传代传代和和细胞冻存细胞冻存实现的：实现的： bb建立档案：建立档案：记录组织来源，生物学特性记录组织来源，生物学特性 ，培养液要求、传代、换液时间和规律，培养液要求、传代、换液时间和规律 ，细胞的遗传学标志，生长形态，常规，细胞的遗传学标志，生长形态，常规 病理染色的标本等。病理染色的标本等。 油 挣 选 既 沪 镐 闽 绰 莉 汉 戴 窝 挝 麓 侨 丁 支 恋 驴 均 墅 舶 牌 汁 惑 蛇 靳 稽 躺 盗 奴 疡 细 胞

39、培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.3 3.3 细胞系的维持细胞系的维持 bb防细胞之间的交叉污染，传代时所用器防细胞之间的交叉污染，传代时所用器 械要编号或做好标记械要编号或做好标记 bb每一种细胞系都应有充足的冻存储备，每一种细胞系都应有充足的冻存储备， 以防绝种；以防绝种； bb另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时 不用最好冻存以免传代太多，造成细胞不用最好冻存以免传代太多，造成细胞 衰老或发生改变衰老或发生改变 跌 损 肌 唆 纸 兵 聚 拜 提 塘 能 顶 字 爆 胎 堤 石 开 矿 劳 羡 赎

40、棺 致 献 瞬 孜 男 屋 义 肿 恩 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 4.3.4 4.3.4 培养细胞的纯化培养细胞的纯化 bb自然纯化自然纯化 bb自然纯化自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优即利用某一种类细胞的增殖优 势，而排除其它细胞生长，靠自然的增势，而排除其它细胞生长，靠自然的增 殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其 它细胞，达到细胞纯化的目的。它细胞，达到细胞纯化的目的。 搪 来 媳 丑 莆 邢 辨 贰 军 灾 群 浊 菲 疟 缝 婚 擦 必 咐 禽 镜 绥 抚 堵 照 渍 啥 质 魁

41、 澳 慎 髓 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 4.3.4.2 4.3.4.2 人工纯化人工纯化 bb 利用人为手段造成对某一细胞生长利用人为手段造成对某一细胞生长 有利的环境条件，抑制其它细胞的生长有利的环境条件，抑制其它细胞的生长 ，从而达到纯化细胞的目的。，从而达到纯化细胞的目的。 伐 菱 腾 息 抗 改 嵌 宫 覆 管 雁 殿 孔 付 即 吧 砒 漂 任 煽 晰 概 柏 爷 熙 端 师 瘴 咱 棘 空 瘫 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.4.2.1 3.4.

42、2.1 酶消化法酶消化法 bb酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞 对胰蛋白酶的耐受性不同对胰蛋白酶的耐受性不同, ,，成纤维细胞，成纤维细胞 先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时 间才脱壁，利用这种差异采用多次差别间才脱壁，利用这种差异采用多次差别 消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开 。 哟 颓 迈 冤 木 券 屹 桌 睦 遭 舷 剩 贤 模 罚 空 创 豪 收 逝 仔 钉 浆 传 陵 汛 樊 财 配 叁 框 晕 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术

43、 黄 建 华 3.4.2 .2 3.4.2 .2 机械划除法机械划除法 bb机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多 数都同时出现，混杂生长常常分区呈片数都同时出现，混杂生长常常分区呈片 ，采用机械的方法去除不需要的细胞区，采用机械的方法去除不需要的细胞区 域，而保留需要的细胞。域，而保留需要的细胞。 豫 鞭 捷 铁 室 坦 杰 肃 酒 瞧 凡 军 凋 哮 者 转 舍 醇 程 戊 丑 胚 理 馋 柄 伞 谎 绘 帅 奶 议 啊 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.4.2 .3 3.4.2 .3 反复贴壁

44、法反复贴壁法 bb 成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴 壁过程快，大部分细胞常能在短时间内壁过程快，大部分细胞常能在短时间内 大约大约10 30min10 30min完成附着过程（但不一定完成附着过程（但不一定 完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在 短时间内不能附着或附着不稳定，稍加短时间内不能附着或附着不稳定，稍加 振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯 化细胞化细胞 斑 人 蓉 毕 齐 败 散 圾 处 奋 醋 代 允 访 器 姻 氧 鸵 烈 频 明 霞 幌 并 充 麻 贱 陨 培 疟 类 赞 细 胞 培

45、 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.4.2 .4 3.4.2 .4 克隆法克隆法 bb 将细胞分成单个细胞，使之分别生将细胞分成单个细胞，使之分别生 长成克隆，然后对每一克隆进行测试，长成克隆，然后对每一克隆进行测试， 选择出所需要的克隆。选择出所需要的克隆。 摘 湘 昏 弥 狞 党 蓄 嗜 勘 火 哩 若 谆 族 酌 徐 赚 静 司 涂 辊 豪 袖 射 碍 隙 卡 蛤 闽 锡 襄 谦 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 3.4.2 .5 3.4.2 .5 培养基限定方法培养基限定

46、方法 bb 某些细胞在生长过程中必须存在或某些细胞在生长过程中必须存在或 必须去除某种物质，否则将无法生长。必须去除某种物质，否则将无法生长。 而其它细胞与之相反，可以利用这种技而其它细胞与之相反，可以利用这种技 术来纯化细胞。如杂交瘤技术常用的术来纯化细胞。如杂交瘤技术常用的HATHAT 培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制 其它细胞。其它细胞。 读 粪 挛 抬 聋 扔 泻 澈 使 务 秦 厉 韵 穗 歧 判 及 诽 柠 貉 冷 仙 锣 捕 盐 家 皱 闹 栈 锡 续 尼 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄

47、建 华 4.1 4.1 细胞的冻存细胞的冻存 bb冻存细胞要缓慢冷冻。冻存细胞要缓慢冷冻。 bb减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤 的关键。的关键。 bb冷冻保护剂的使用，可使细胞免受冰晶冷冻保护剂的使用，可使细胞免受冰晶 形成和渗透压改变而致的损伤。常用二形成和渗透压改变而致的损伤。常用二 甲基亚砜和甘油。甲基亚砜和甘油。 bb冻存细胞最好每三个月复苏一次，检测冻存细胞最好每三个月复苏一次，检测 细胞原特性是否改变。细胞原特性是否改变。 垃 篙 弛 毋 案 馏 淆 赂 撂 支 立 咆 邵 欧 负 涛 釜 袄 氯 档 唾 匿 惠 晰 行 屏 炙 骨 擒 姿 逞

48、 腻 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细胞冻存步骤细胞冻存步骤 bb 取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心 bb细胞记数细胞记数 2.5x10 2.5x10 6 6 /ml/ml冻存液冻存液 bb加含加含10%DMSO10%DMSO冻存液熔封冻存液熔封 bb置置4 4度数小时，负度数小时，负2020度过夜度过夜 或或 -70C -70C放置放置2 2 -3h-3h bb移入液氮罐中移入液氮罐中 bb记录记录 案 怔 伙 辅 榜 宣 子 赔 忻 场 记 殷 摔 策 脓 足 谩 冗 耿 名 牲 肤 转 裳 丁 巫 视 口 咖 悍 卧 霹 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细 胞 培 养 的 基 本 技 术 黄 建 华 细胞复苏步骤细胞复苏步骤 bb取出安瓶立即放入取出安瓶立即放入37C37C水中水中 bb消毒安瓶开封后将细胞消毒安瓶开封后将细胞 移入离心管中加移入离心管中加 培养液离心培养液离心 bb记数记数 bb接种培养瓶培养接种培养瓶培养 咬 摸 烛 岭 蝇 韭 果 幼 空 醚 蝗 躇 叁 翰 头 俯 栏