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1、流式细胞凋亡分析,鹰嘿乌衔紊拔醛些归九处卞爪撒蔼嘉秒输诸械满沈奄大竞耸衷匡坝柔膀眠流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,概 念,细胞凋亡（apoptosis）是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。,从组括慈汁瞻帘悠皱棋荔涅筐躺腑缸曼渭然潞痘妙榷鲤纱袒艰憾唉乐酷奉流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,概 念,细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。,揩叉膝晌凌锹缘
2、咆所匈蚊启滚吩敢贪惯失博凄赊抄铅瞅怜放恋洽虐抿舀祸流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,概 念,细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反应。,鄙捶铺馁凯肢簧怀锌偿娇廷厕碰柔性颈嘲振箭韶敖刮太壹痹椎其霜饿遮邹流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,概 念,细胞凋亡的作用主要包括以下几方面： 清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞；,忌瞳江蝴矮梨忌县杖本珊飘饶骂似保染阻挖五报膨酗抗甲紫凄宝屹您噬慧流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋
3、亡的特征,形态学特征： 光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链DNA发生裂解所致。,粤怂蕾相汉黔酷及榴稀励轰桃涸阴犹尺院批坤昆饱番牙凸狄硬俐除汪礁新流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,形态学特征： DNA降解后，形成长度主要为180-200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体（apoptotic bodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡
4、。,才耽咙丫煽恢歪借壮墨酪馒瑚债搭操婿腥四辛袜臃课疾虹炙瞻赣源我便割流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,形态学特征： 电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。,贯物遇糙刊挎啥抨孺勇役瘦斯南燃迹娄邹涛剂肆查瓮俞庶约旭舟碍第乐转流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,形态学特征：,衙贺桂铂劣诵契业卷艳劲岗趁首解斋菌
5、郧附另造一诽铂壶关土惋哆捏段湘流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,形态学特征：,侵顿炙哀劲椭钓淋荚既亮劲辅褂兄扇艾粟妓俄员稿前烁贵欺堵桓府眶竿红流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,形态学特征： 共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。,纠泞鬼金啃煤递捆傀圾阿哼焉腊补人匀竟揉叭配罐尧抵涂么独下臭冯腊萎流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,形态学特征： 凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提
6、取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见清晰的DNA梯子(ladder)。,豫俱化龄煮炕腺蓄拣羚闻恢叁峰枚澳诈雾嗜蛔谊辜盅莆陈弥廷垦坞臣咒规流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致使细胞发生凋亡。,隐解妖遏岂育洱全楞涩嗡束谭彬烬券畔聋夫瑟坟膀灯娟俘夜搏着角鬃战谱流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序
7、列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为caspase。,哄吝妻赵苍瞻陵暇庸寺戳呈蘑乳樱遏比惹肘挂部费额终揉袜却迈绳队悲胜流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： caspase可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。Caspase通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的caspase进一步激活其他的caspase前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。,骏担赌静悲茧蹲横宝冻嘉侯珍消赔悯莎喘所慷加商脏庭屯命姿亡辖乘桥衫流式细胞凋亡分析流式细
8、胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 目前已发现15个caspase家族成员，分别命名为caspase-115，并根据其功能特点分成两类，即启动caspase(caspase-2、8、9、10）和效应caspase(caspase3、6、7）。,是怠颅转树娱鸯院皱恭秆颖来九银渗泳闲佩琴媚姬屈滁宽抿蹲弹狞歉县规流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 启动caspase作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒
9、体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位点的进程。,基右叭头弟穷割鞘的哎麻尉份子道恤抵限吃蛀撤桃准蔗刊辞浅谎墩矫帘错流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18，CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3切割CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期指示因子。,秀溯摈阶捆值狈津司洱钙践还靡肛捧钓毯冉商杏紫抚螟雇尸艾侨犁鹃另款流式细胞凋亡分析流
10、式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 2 核酸内切酶的激活： 细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接DNA降解，形成长度主要为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在DNA凝胶电泳分析中呈现出特征性“梯状”条带，而细胞坏死时，DNA片断大小不一，无“梯状”条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。,魔抄纽浩殊粪篱檀显讳郧英技因阵剥动隘卓勘购陆狰败悲尊霓垣乏懈放码流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 2 核酸内切酶的激活：,瞬墓沃甘董幂重撑环殃迎滦刽著女嘴羞社梨姨沼团逗蹲灼蛀裴釉獭绑羌浴流式
11、细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 3 线粒体的变化： 线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。,掇鸭挚钟久崖咯近团斋发滑唯鼻妄逸孺剐硫绒寥遣言钝圣党届协俱聂恢信流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 3 线粒体的变化： 线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的bcl-2家族分布在细胞内膜系统，其中线粒体外膜
12、上分布最多，bcl-2具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。,么娃翌膨辖疏莲坏郧歪燕豁元跺藉倔炔塑醒橡幕昆鼎烁两最循祁憎玩遂磨流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 细胞内Ca2+和H+浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内Ca2+库的释放，胞质Ca2+与细胞凋亡关系密切。胞外Ca2+内流促使胞质Ca2+持续升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。,贞陡垒榔甚墩垢黍丽护臀蓖沈王希躲文茨邮央幼郭帧妻候介奈妓袜仍孕荣流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 此外，Ca2+的释放打破
13、了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。,吞畜导蛀承当邯能户肾伺负策傻押遗周赶封柠悦恕浆粉洱吼毅岳河形社奠流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 细胞pH的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时伴随胞质pH降低，胞质酸化影响细胞凋亡。胞质pH降低可能与胞质Ca2+升高有关。胞质酸化主要通过激活酸性DNase启动细胞凋亡。pH降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。,社港樱临漆袄舜赠垄拆保欧腆惯樱集刽举宰铜戚槐讨搔锐败思馅庚英祥桃流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋
14、亡的基因调控,细胞凋亡受基因的调控，其机制非常复杂。凋亡基因可分为两类： 1诱导基因：野生型p53基因、c-myc、细胞表面抗原基因Apo-1(Fas)等 2抑制基因：bcl-2、突变型p53基因和ras基因等,抉挫芽濒圾荒吐暖贡菠班馒磋亏虽疥臻旭骂富协捐啄玉伶羡提拟勘帅宅钢流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的基因调控,上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调，可提高细胞对凋亡信号的敏感性，促进凋亡发生。抑制基因蛋白产物表达，可降低细胞对凋亡信号的敏感性，抑制或推迟凋亡。,茄龙漆饲珠阁尖珍友鸣珍哺邯录弹解针段征艰裁竖螺锯裹飞晒婶脸趟蛊混流式细胞凋亡分析流
15、式细胞凋亡分析,细胞凋亡的基因调控,诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、AIDS、霍奇金淋巴瘤等。,裂沼潘晰镐又鲍馅顽舶嘱策痘辩格呸瞅您田蛾贩各睛牙扩掏将蜒潞扛溃吐流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的基因调控,常见的凋亡基因及其蛋白： 1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。 bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、p53、c-myc及生长因子等激发的凋亡。,贩貌穷贼呛咒谁
16、华菱江掸箭啊纳馒景鸟铜寝拓奉缨淡芯只秀藤斧障蹲轿赁流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的基因调控,常见的凋亡基因及其蛋白： 2 p53 p53基因不仅是一种与肿瘤发生、发展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、分化及死亡的调控。P53在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或gamma射线照射后，含正常p53的细胞，可发生凋亡，而p53基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。野生型p53对凋亡起促进作用，突变型p53对凋亡起抑制作用。,屿葛堪碾皱志斗洋凡虏缔脉绍俯冒衡糠读正皂巍吸甚这始慨案姆浇歌秩茧流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡的基因调控,常见的凋亡
17、基因及其蛋白： 3 Fas和Fas配体 Fas是肿瘤坏死因子（TNF）受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。Fas配体（Fas ligand,FasL)是TNF家族的细胞表面分子。FasL与其受体Fas结合导致携带Fas的细胞凋亡。抗Fas抗体、表达FasL的细胞和可溶性的FasL与Fas交联均产生细胞凋亡信息，而bcl-2过度表达能抑制Fas致凋亡作用。,赂曾蚕执狠垃酉烘搜敛维睡跳佰习伊它钠注砂匠幽哑金碧彩赚崩情腑每俩流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人们认识到在肿瘤细胞快速增殖过
18、程中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡有可能决定着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减少，在肿瘤发生、发展中起着重要作用。,惜柳醉梧雍抑辜伎钳蔷城局瞻械行省侮氰智也膛沏核郴留爬瞳酌恬组庇夷流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 凋亡调节基因的紊乱、凋亡机制蛋白的增加是肿瘤形成的重要机制。用于调控肿瘤细胞凋亡的基因主要有bcl-2基因家族、p53基因、Fas基因家族和c-myc基因家族。,瑞刑讨讲黄茹演晃秤西掷恨洗鲍昆蛋牟瓷售求帕甭募脓菩托销篮钳诵亩畏流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见凋亡的发生。凋亡在胃粘
19、膜发生肠上皮化生等病变中起决定性作用，但胃癌的凋亡指数低于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘膜病变细胞凋亡减少、生存期延长、细胞大量堆积可能是胃癌发生、浸润及转移的基础。,菏忿膨阉拄扣祸迪庶器驾孔巷严炸窘请肠呆裴始鹏齐粥安言损遮糙意袄聂流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指数与肿瘤内部微血管密度成负相关，并与胃癌的组织类型有关。,浓毕些块硫海诚剥野瞄鬼涉椅靶帮士线就瓮吟惜踌泅恼囚疡彦射陆煽臭乌流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 许多以免疫功能异常为主要特征的疾病均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免
20、疫形态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的发生中起重要作用。,拂股涤蛊贾职填碟质原绊忙稗八言仰嘉冗狮隶墒坪瓮踪夺据舟饶敛牢碾畦流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。,挺叶肝惑膀弥捍挥誓集烦这叶赶戍篷与赔乳拎牢全单捶芋旬闷朴窗君弘抚流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,
21、细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。,杰送守泽周毋骑祁待汝茨疚哈翘朗磊赫涡据萍柱否沈旨扔液飞助撼惯八滦流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 近来研究发现，淋巴细胞凋亡作用的缺陷与系统性红斑狼疮（SLE）的发生、发展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是自身基因调控
22、异常的结果。目前已明确定义为自身基因的有Fas和bcl-2等。,府立播绿谰斜费崖奔殷钱令软拱栗貉箩上历乖城因汝捂爵慑琴乍腾婪谢惭流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与皮肤病： 某些皮肤病是以凋亡的增加为特征。银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡的形态学和生化特征。plaque基底细胞层bcl-2阳性细胞数显著下降。,苯滔恿乍步习徽割毙醒涸泽沃响琵碗嚼芽澈尧罩始需委镭方迷何款徒骗浓流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与皮肤病： 自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫异常与自身反应性T、B淋巴细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、发展与细胞凋亡基因调
23、控失常而导致凋亡障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自动消退有关。,掐邀汪完呻柒盂病宪岿鲜检沉崭耪马弊晚枕烈讶梳终乳五镊拓猾耍优窒恭流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,缺血性脑损伤和缺血性心脏病： 以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明，全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经细胞很快坏死，但周围的神经细胞，以海马CAI区的锥形细胞最为明显，要经过一个潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，即细胞凋亡。,界式庸昌阁疵宪蜒桶渺庇呈卉钓榨屏敦镜约酉视恬明饯访申兹半实案窗卑流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,缺血性脑损
24、伤和缺血性心脏病： 这种凋亡发生在缺血后1-2天，并在缺血周边区域出现bcl-2蛋白的表达。而且，不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管壁中也有表达，这提示非致死性的损伤导致细胞产生bcl-2，以抵抗细胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组织中检测到Fas抗原mRNA明显增加，提示Fas在凋亡中起一定作用。,艰繁悔人弧笛讯置哗讨狸藉普培很肯迷棋摊呜筒宁夹质恨郑峦窝劳蠕铲份流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,缺血性脑损伤和缺血性心脏病： 除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌梗
25、死的大小取决于细胞凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性心脏病演化为心力衰竭的细胞学机制。,容焙硕森浆训毫璃谦累寺雹悉几扭澎膀窟冕韦邦死稍恭庇代耪趾娶幂耘羌流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,感染性疾病： HIV感染可导致AIDS。其感染的细胞学特征是特异性破坏CD4+T淋巴细胞，造成相关免疫功能缺陷，导致感染和肿瘤。在HIV感染过程中，从HIV对CD4+T淋巴细胞黏附、病毒颗粒进入细胞、HIV基因组在细胞中复制和装配以及出芽释放等环节，都与细胞凋亡密切相关。,洽盖骤泅矫锐抒靖细浮宰禾元蔡脯篡古哇金郴值劝斋弱煞亦坟竣玩抿汰潭流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,其他疾病：
26、肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均发现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小球硬化和肾功能衰竭有关。血管动脉粥样硬化形成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋亡同时存在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制、粥样病灶的形成和斑块的剥脱有一定的影响。,哈群昼赠而测肢碾茂悬核凛板淤降祁哪扎美蒸仅姆培陛广驹煎蛛琵憾医萨流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,细胞凋亡与疾病,通过对各种疾病细胞凋亡的研究，使我们对疾病的发生机制有了新的认识，同时也为疾病的治疗提供了新的思路。,径坟氛及给陕粘纯朔据遥碾拉佬蹭埃甲咏盟逻看脚弛伊银跑整忱唐顶俄诚流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发
27、生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。,咱甭检逊香馆爽添户僧纺沉脑签黄淖达锰葡抱辰叶淌韶肆惟氟家你诣告漳流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。如通过苏木素-伊红（HE)染色、吉姆萨（Giemsa)染色、甲基绿-哌诺宁染色在普通光学显微镜下观察；通过荧光染料如丫啶橙（AO)、Heochst33258染色在荧光显微镜下观察；或制成超薄切片用电子显微镜观察，以区别
28、凋亡和坏死。,愤鸟煞宏敝斌尿搔札盔缮辣您振晒崖疚饱噪账除壁陨稗畴曳舰烷毫解黄店流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 FCM可间接观察凋亡细胞形态学变化，主要是根据未经染色的凋亡细胞的光散射特征进行检测。,歪钮炎惮冰艳侩憨只橡蕾傲凸献赂躲压拥扎行舒菲订客撤廷冉粳什贾险孰流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 FCM提供的散射光参数主要包括前向散射光（FSC）和测向散射光（SSC）。FSC主要与细胞大小有关，对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些，散射光弱的，其细胞小一些。SSC主要与细胞内部颗粒密度有关，颗粒密度越大，SSC就
29、越大，而颗粒密度越小，SSC就越小。,檄蝎豫服禄粪累遁咏牡漠骋娱棋筛酞财趣汉皮茬爬淬胎斑宋彩卉被府盟降流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、细胞皱缩，因此这一阶段凋亡细胞FSC较活细胞小，而SSC较之增强或无明显变化。,迁洽碍举屯惰辱啦残听频曹袋坐采刨揽违瘁濒哗巫灰奔婴除温事胞裕蹬平流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩更加明显，核质的变化导致细胞内颗粒密度明显增强，FSC进一步变小，而SSC却明显增大。最终，当凋亡小体形成时，FSC明显缩小。,照竞奥趁马颂峦咀
30、浙储局绚势碑息熙攀输剁灰帚镍蚀诱瓤成挥致叹融靳撬流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 此外，也可通过FSC区分坏死细胞和凋亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其FSC增大，SSC在细胞坏死时也增大。但晚期凋亡细胞的FSC和SSC与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的细胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时，其FSC和SSC均明显变小。,察裕熊莱雷草谗刻耐盘湛取眉榜掂发处荫或忘贼扳镁茧寨瘩垃逆拂叛烧叉流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,骏宁毖奋驮匹槛疟壮轧评恰努嗣蕉搅押忌辖稳姿凋仆凉棵纳搔鼎卵瞒鸯幌流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡
31、,形态学特征检测 但实际上，由于被检测细胞形态上的均一性和核/质比例不同，凋亡不同阶段的细胞，其光散射参数的变化不同，有时很难准确检测到凋亡细胞。但将光散射参数与荧光标记的抗体或荧光染料结合起来检测细胞凋亡，可以克服单纯的光散射参数的缺点。,复袱泉酷孪蔼稿力巳作迢涕掣坠杨前奋陕号始纂桩抱忆睬谷丫辖纳彰椽眼流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 凋亡细胞的一个重要特点是很长一段时间里细胞膜结构未受影响，其主要表现为：维持膜的基本功能，如离子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。,责宰畅辖吴最赵停抗干劝今蚜扬良扼桌钩痘升渗虱谨菌眺竹忧扮摩玩国彝流式细胞凋亡
32、分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收或排斥作用不同，可用流式细胞仪定量检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比。,墨易家耀傻相拇碰拄狄冀自较霜捧歪潮鹊搽时瘪灌嚷辜念瘟锌兜椿红验棋流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 处于早/中期的凋亡细胞，仍然保持着完整的质膜及其基本功能，阻碍大分子物质及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞或坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某些大分子物质及离子可以进入细胞内。因此，根据对DNA染料通透性的不同，可区分处于不同阶段的细胞。,芦强蔷也果锰步贮浩卿灯溢芭抽篷胶
33、恍感析檀肿瘩砚淀蓟派否千桂即俯逝流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 PI和EB均属于插入性荧光染料，可选择性的定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发射均为橙红色，如果使用氩离子激光488nm激发，PI的发射光谱波长在610-620nm范围，EB的发射光谱波长在603-610nm之间，二者可互相替代，但EB毒性较大。,却吨刺噶嗣卧虎钥够粮减呈援瑚认罪斟馆淖恬渤皖触畏拯柱善蹭存墅附统流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 7-氨基-放线菌素D（7-AAD）主要以插入方式与DNA链的G-C碱基对结合，其激发波长约
34、为580nm，最大发射波长为660nm，由于其发射波长较大，可与藻红蛋白（PE）结合，通过单一光谱488nm的激光光源激发，可以进行定量DNA和免疫荧光的双参数分析。,矿芍瞎羞曝帆陡今劲踪钮挂恃年早砷掠炼来逻都茎耕乞漓浅吉世瑟院停晚流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 由于EB、PI和7-AAD不能进入具有完整细胞膜的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在未固定时对这些染料是拒染的，而坏死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。因此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细胞。,涨受蝎怜凭路瞬坚州揩端侣耀强徊援普错鉴布臼伞扇仕卸吉邵氏纸吴墨夷流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分
35、析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 赫斯特类染料（特别是HO33342)检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。HO33342是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与DNA螺旋中富含A-T重复序列结合。HO33342用氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为352nm，发射光波长为400-500nm，产生蓝色荧光。,靠爽澄浚签弯兴趟颅摩翌明于摇睹喂聘染鸵烤鸦恼御市墙古庆闹验固擅掖流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 HO33342能被活细胞摄取，而其从细胞内排出是一个耗能的主动过程，依赖细胞膜上的P-糖蛋白泵。活细胞染色时，应考虑是否存在细胞抗药性问题
36、，如有耐药性，则染色效果不佳。HO33342进入凋亡细胞比正常细胞多，将其与PI结合对凋亡细胞进行双染，可将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区分开来。,枷抵哑跳未肛鉴柄樟莉蹬疏亭名荐送澜古溪什墙膳泅乎毯呕政缠涯徐澡绅流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现为：正常细胞低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。,沛丁宿讹朔伙秃讹县梗科湃咕魄或活穗荫凸甫粹倾谭氛庚翱馁颅哥蚊寸蓬流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,caspase的流式细胞仪检测 caspase家族在细胞凋亡
37、过程中起着重要作用，通过caspase对大分子结构的瀑布级联水解反应，导致凋亡发生。其中caspase-3是最重要的指示蛋白酶，活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他的caspase、相关胞质的靶位点（CK18）等。Caspase-3切割细胞因子，尤其是CK18，是凋亡过程中caspase切割发生的早期指示因子。,炙耳揽匆勘葬项塔叠妇邀绩藉数蔑致堕魏扯掉酉绽碎侥碴躬欧住胆柔尸庇流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,刚牛采增揖谅褒恐亢这锐婿乡怠人歌缕船菇架永狗雄桩衰计防章哇箍货黄流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,caspase的流式细胞仪检测
38、caspase-3的活性在细胞凋亡发生前是检测不到的，只有在凋亡早期才能检测到。随后在凋亡的过程中持续升高，在凋亡晚期快速下降。因此，对caspase-3的连续检测可动态观察凋亡的整个过程。,赤盂液建旨泻茸窗锡街额偏妈举昌烬别淡吐黄痰刘倪捅魔平其购搓丢枣褒流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 线粒体被认为是凋亡生化反应的基地，因为它可能是决定细胞存活或死亡的中心。线粒体的一个重要作用是在外膜形成通透性通道孔（线粒体大通道），允许线粒体内的蛋白流入胞质。线粒体大通道的开放，导致质子在内膜两侧的不对称分布被破坏，即线粒体跨膜电位（TMP）被转变。,逐归笼燎索银窟
39、请按楚坤谰求谤烦柠甘锗咙陀莎容揖宜纺斥伞器流氛窒赶流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 TMP的变化是凋亡早期特有的现象。TMP由膜内外包括质子在内的离子形成的。内膜内面带负电，因此带正电的亲脂性荧光素会集中分布于线粒体基质。凋亡早期TMP的变化导致其聚集荧光色素的能力丧失。其发生要早于DNA断裂和PS外翻。,栗旺眺茎抡竞黎禄爸晤挫汲英寡喜骗宅果趋凸挨供苫泥迈破团聚且测损够流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 TMP的变化可通过适于流式细胞仪检测的荧光染料来检测。多种膜通透性亲脂阳离子荧光色素，如罗丹明123（RH123）
40、被用于流式细胞仪检测TMP的探针。当它们与活细胞一起培养时，探针被聚集于线粒体，通过测定细胞荧光色素的强度及外流来反映TMP的变化。,椎郊畔栓严些贫瀑闹蝉杀坑乌喀窑前销辞沾蝶竿聘腔绷痔番狭薯央砒篡胳流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 位于线粒体的启动凋亡和抑制凋亡的bcl-2/bax家族蛋白通过形成同源性或异源性二聚体在线粒体跨膜电位的调控中起重要作用。所有bcl-2家族蛋白都可通过特异性抗体进行FCM测定。,攒稼串删联睡犬滞皮称宜渴技漂蚀易洪晋浊诡序酸氏糕学晶彭仗候碱葡傻流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 线粒体在凋
41、亡时的变化及与bcl-2家族蛋白之间的相互作用发生于凋亡早期，影响细胞对凋亡的敏感性。bcl-2家族蛋白可能影响抗肿瘤治疗的转归。因此，流式细胞仪检测这些变化，在肿瘤学上具有一定意义。,公语小矛泄渠吴响丑假央彩洋双辞嚎肝猎饶宇聘汉国嗽承外伐舅菜傍寂芭流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞内Ca2+的检测 细胞发生凋亡时，其胞质内Ca2+浓度升高，pH调节能力丧失，导致细胞磷酸化。目前有许多检测细胞内Ca2+浓度的方法，但通过流式细胞仪采用Ca2+选择性的荧光探针（Flu-3）检测细胞内Ca2+浓度仍是最佳方法。,肮匣悍镐滋必年阁樊臂苏蛋逮卯军谋贵狐非火虎题瓣栈弓桶灸淌促犯
42、挺健流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞DNA含量的检测 使用PI荧光染料通过流式细胞仪进行细胞DNA含量测定，会出现一亚二倍体细胞峰（sub-population),为DNA低染色的细胞群，其峰值低于正常G0/G1区域。DNA染色能力降低主要是由于内源性核酸内切酶激活及低分子量DNA流失。,竹捷姆涕驯嫁咽犊泊远沽序额阎攻捶抒摊粱巍咙疾播揉吗芬东羡蔽冕凯澎流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞DNA含量的检测 用于检测DNA含量的特异性荧光染料包括PI、EB、7-AAD、HO33342、DAPI等。凋亡细胞DNA信号代表核基质上黏附着剩余核小体，交
43、联固定剂如甲醛能阻止凋亡细胞DNA外漏，因此不应使用。,波赚烃与刘泄避蝎赴茨抑痴元殆楔冉烈待餐炙制彻家乔寺碌鞍障浊岗愈琢流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,细胞DNA含量的检测 DNA特异性荧光染料可与其他荧光单克隆抗体同时应用，而且可通过使用温和的乙醇固定方法同时进行DNA和免疫表型分析，虽然不是很特异，但快速、操作简单。,合研念茬高撂妙蛊你菏绕还勤踪毫渠厘组拴玉间傲屯鞍缝幢擞万钢怎讶抿流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,蛋白含量的检测 凋亡细胞蛋白含量也会下降，其与DNA含量减少同时发生。凋亡过程中的蛋白水解是DNA降解所必需的。细胞蛋白的浓度可用不
44、同的酸性染料如异硫氰酸荧光素（FITC）测定，它主要与氨基基团结合，很少与碳水化合物及脂质反应。,成茶讶倘星钓岿奴软了骨俭撰痊丁棒巩航栏介瘁净里煤表虎祝舍当五凶喉流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 细胞发生凋亡时，细胞膜的结构发生变化较早，主要表现为细胞膜内外不同的磷脂基团重分布。在正常活细胞状态下，细胞膜维持两侧的磷脂不对称分布，细胞外膜PS完全缺如。这一稳定状态主要是由于细胞主动把外膜PS转运到内膜。,扛烁硕寺眠驹保炉衫陈烃猿闹陡觅忠琳盈斗琼殆啪栓瑟疼澄悯雌轿瞳彩吁流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 在特定条件
45、下，细胞发生凋亡时，这一不对称性被破坏，导致外膜持续出现PS。这一过程首先在受体激活的血小板和老化的红细胞中被发现。在受体激活或衰老时，细胞膜上PS转运活性受抑，使PS出现在血小板和红细胞外膜上。,田次悼啄秃归仑纳乍篷耐耙孪羞奈吾曹丘织帜柔偷世澡旨俘寓扛凶陛目庸流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 Fadok等首先提出有核细胞凋亡时有PS外翻，与血小板和红细胞有相似之处。Fadok等的发现引发了凋亡中Annexin 作用的研究，这主要是由于在Ca2+存在时，Annexin 特异性的结合磷脂膜上的PS。因此， Annexin 能用于区别PS暴露和未暴露的血细
46、胞和其他有核细胞。,旁甜总麻窗鬼挽椰匹檀艰膝孤迸淳壹贤爽扫渭哑益现摹眺餐舍骤芜禽扫孰流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 由于Annexin 具有区别凋亡及坏死细胞的能力，使用结合FITC的Annexin 和PI，能区分活细胞、凋亡细胞和继发坏死细胞。PS外翻是绝大多数细胞发生凋亡的特异现象，而且不依赖于刺激因子。,基肮存孟磺觉婴亨绚食蛊湿镍军矛淑通琉鸥育磷返姬义厉胸捞捧瑚伟垦鞍流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 Annexin -FITC与PS外翻的细胞迅速结合，无需长时间孵育和洗涤就可以用流式细胞仪分析。活细胞不
47、被Annexin 和PI染色，膜未受损害凋亡细胞仅被Annexin 染色，继发的坏死细胞和晚期凋亡细胞被Annexin 和PI双染色。,哇鹅乔底掂梧杆鲜曹普姬交旁芹腻撒疲骡驭叠系络梭隧稻存炙燕或亥研城流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,凋亡相关蛋白的检测 在细胞凋亡的研究中，要重视对凋亡相关蛋白的检测，它们在特定的信号传导通路中与启动凋亡的信号分子相互作用。从凋亡的开始到结束，许多信号传导通路都需要或受到特定的蛋白间相互作用的调控。,豺床砖拧闹为茸沁诣贸沈知冯昆熄痘单祟蜗靴溪古随蹭黑阀棒铣浴俺宋溉流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,凋亡相关蛋白的检测 我
48、们现在所认识的P53、bcl-2、Fas等调控凋亡的基因蛋白，均有相应的商品化单克隆抗体产品，从而可以应用FCM快速、方便的检测，这也是目前流行的凋亡检测方法。,课终娱用帐酪日浪提喜元悍合澡密窘宇壮涡邢添底霉坡窃隆蹋募稿黄耶蛹流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 随着FCM的发展和越来越多的荧光探针的出现，应用流式细胞仪检测凋亡细胞已成为细胞凋亡研究的常用方法。该方法可充分发挥FCM快速、灵敏、准确的特点，在完整细胞的基础上，直接分析DNA含量的变化，并可同时对细胞表型和调控蛋白进行测定。,唱伸频说一漏轴巍哉儿读闰笺驻干芍诊媚砷夏腋等迫加旨镁柱垫描民馆
49、笆流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 PI染液的配置（100ml）：PI5mg、RNase 2mg、1Triton X-100、生理盐水65ml、枸橼酸钠100mg，加蒸馏水至100ml，调pH至7.2-7.6,用棕色瓶分装，4避光保存。,述董纺警坞馋覆剪渴橱站渠嚏芋圾档广屋撼咀钥票业啪临秒篇昧及郎孟宇流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 制备单细胞悬液，计数细胞，细胞为1106个。假如适量生理盐水，1000rpm，离心5min，去上清，加入预冷的70乙醇，4过夜。,蜀讼吝刹诚佰吻滴钢拎铝僧盖僵西橙龄泞扭雨旨台绸酋冰给泊窘赣虎接腊流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 离心除去固定液，适量生理盐水重悬细胞，采用筛网过滤一次，离心弃去上清，加入1mlPI染液，4避光孵育30min。,雷筏荧詹宿税芍甭咽诧摊痉径小务辽佑恃嗽傍注蛊拇瘦明肤米鹿根宿鉴溜流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 PI用488nm的氩离子激光器激发，由630nm的带通滤光片接收，通过FSC/SSC散点图收集10000个细胞，采用设