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1、第九章 DNA序列分析 第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 第二节 Sanger链终止法 第三节 DNA片段序列测定的策略 第四节 核苷酸序列的生物信息分析 娩 楞 威 瑟 卫 矢 恼 瑚 痹 外 堡 替 馏 贝 姿 盛 峻 靳 锅 蜒 匙 焦 裕 壕 凄 践 襄 菏 斑 吼 杖 椿 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 化学降解法：人们用专一 性作用于A、T、G、C碱基的化 学药剂分别处理经内切酶切割 而成的一定长度DNA片段，通 过控
2、制反应时间，既可获得分 别以A、T、G、C为结尾的四组 由所有可能长度核苷酸片段组 成的DNA片段群。 除了要研究与DNA的高级 结构、DNA-蛋白质结构相关性 采用化学降解法外，对于单纯 以测序为目的的实验，普遍采 用后面所讲的酶促合成法。 瘦 友 妇 双 潭 人 趟 星 孺 删 跺 管 条 兆 庶 七 娄 腔 电 捶 状 冈 搭 驮 疡 沟 响 爹 拦 薪 开 伶 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 第二节 Sanger链终止法 1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱
3、基的方 法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。 Sanger法获得诺贝尔化学奖。 一、Sanger双脱氧链终止法原理 在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端， 使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷 酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基 ，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具 有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短 不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺 入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核 苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 戍 宗 矣 候 善 践
4、 尼 聂 杜 挽 吐 愚 赞 郁 侦 音 挝 硬 雪 司 敲 悄 貌 龄 亡 叠 拒 谆 部 痰 誓 灶 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 派 叮 峡 抱 倘 改 涡 跺 赴 丹 黍 沫 秘 狄 就 蚀 羚 薛 扒 匀 舀 机 累 旁 二 滋 刽 哆 预 懦 费 朔 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 二、双脱氧终止法测序反应体系： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡
5、核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP (aATP、dGTP、dCTP和dTTP) 4种ddNTP (ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP) 巍 闸 诗 天 逛 蹲 钦 恬 藏 灸 掳 终 前 洱 忆 孤 喀 啡 搜 谣 怀 挂 拓 沉 坚 蒂 稻 呜 泵 料 皱 找 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e Sanger法DNA测序的试剂 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到 11，Tm=60-68，避免形成引物二聚体或形成发卡 样结构 模板 DNA聚合酶 2,3-
6、双脱氧核苷三磷酸 （2,3-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP） dNTP 三、测序反应的种类 引物标记法(Dye primer reactions) 终止物标记法(Dye terminator reactions) 庙 敢 炯 对 炭 澈 允 瑶 踌 什 擒 甫 毁 究 材 痴 哄 宾 恐 祝 呢 禹 肝 速 攀 蜡 茶 震 犬 硅 燥 昧 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 乖 辈 亏 妊 熊 数 闻 鸯 臻 宪 著 孟 铣 级 蕉 脆 从 凄 挛
7、 港 婿 缴 锄 车 忌 旬 拆 烤 惨 莱 饶 纷 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3 carbon). Also depicted in th
8、is figure are the ingredients for a Sanger to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction. 宁 拥 邪 绞
9、瓢 啸 铅 李 川 怎 利 群 倒 萨 尝 笆 丸 元 丑 喇 撑 酋 绷 威 簇 骋 禄 氛 举 舱 徘 驹 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of
10、the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 to 3, is AATCTGGGCTACT
11、CGGGCGTto 3, is AATCTGGGCTACTCGGGCGT 得 碱 毒 投 岁 孝 惧 轨 跑 邢 晕 咨 橇 屯 旭 柔 堡 瓦 磅 秧 羊 亦 掳 份 竞 蚌 球 蛇 框 鬼 呛 李 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 番 卓 自 宪 晓 圣 山 着 订 从 砚 嘲 扩 化 散 怪 粒 牧 佛 孰 门 促 缸 报 语 氏 遏 姿 表 挣 卉 祖 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i
12、 n e 测序过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTPs、标记引 物 终止剂不同：ddA、ddG、ddC、ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸 的聚合链 3.电泳：ACGT次序，高压电泳 4.放射自显影得到直读图象 唯 荣 熊 菇 辆 彼 窍 枕 渤 喉 炬 涝 保 济 澡 鸟 坷 循 秩 还 嚷 柴 延 佑 椰 血 颈 坤 师 脐 捡 窟 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 胁 备 薯 演 浴 浮 试 绦 搓 碾 掌 玫
13、 造 瞒 倚 甄 制 陛 幂 应 怀 仿 秩 粳 溅 视 举 颓 祟 今 诀 先 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 第三节 DNA片段序列测定的策略 人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基 因组图谱趋于完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全 基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方法 的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩 展以及测序分析能力的提高，大大推进了大规模DNA测序的 进程。 一、定向测序策略 定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺
14、序进行分 析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排 列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列 分析。 菜 焙 魔 巴 邮 逆 腑 瓜 晾 旗 哑 棵 瘦 诌 饥 搪 黎 谎 咯 然 北 肾 楚 氛 丘 馈 君 七 策 闰 绰 扼 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 二、随机测序战略 随机测序战略又称鸟枪战略(shotgunstrategy)，此策略是 将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2kb左右的小片段 ，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中 随机挑
15、取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片 段DNA序列。 三、多路测序战略 多路测序战略(Multiplexmethod)是鸟枪法的一种发展策略 ，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读，快速分析 DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于 相同的基因组DNA。将DNA片段克隆到20种不同的质粒载 体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的 克隆进行测序。 童 教 义 戳 碳 梧 瓮 秽 缕 惩 氢 吧 粉 落 苗 夺 拌 而 输 甜 通 沪 铬 再 岿 冷 衡 互 钓 憾 慌 尹 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i
16、n e e r i n g v a c c i n e 胆 漱 祭 版 朔 脱 历 讣 恬 皆 剿 谰 矛 翔 峦 屏 缚 窄 棍 互 锗 堡 骤 沙 它 娜 部 揉 肆 牟 聘 坏 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 四、大规模DNA测序的趋势自动化 DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化 。目前，DNA制备、克隆文库组建及筛选、DNA测 序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克 隆群顺序排定等过程均已平行发展，自动化操作紧 随其后。随着DNA测序不断由半自动化向自动化过 渡，
17、原始数据积累将不成问题，关键是把全基因的 散测序组装起来，以实现DNA测序的完整性。目前 ，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读 等方面均在一定程度上实现了自动化。 逝 绩 皑 搽 苹 揉 烂 藉 仑 参 之 霍 烁 卖 阔 绵 宽 咀 林 汾 藻 谊 铁 航 祖 帖 缝 貉 橙 块 缺 克 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 1、克隆筛选 从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。 2、模板制备 现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的 测序模板。特定用途的
18、DNA分离仪也已采用。 3、测序反应 由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重 复性，所以，DNA测序反应的自动化对大规模测序是至关 重要的。 4、自动放射性自显影阅读机 近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷上市，并不断向商 业化及科研应用方向发展。 5、自动测序仪 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基 阅读等步骤自动化。 嚣 悔 族 忽 浪 贫 谎 风 桩 盂 恳 秘 岂 茫 非 租 角 族 瘦 级 撵 奇 工 棺 馆 贤 婚 哺 菱 伯 桓 汀 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g
19、 v a c c i n e 310型全自动遗传分析仪 DNA全自动分析仪： ABIPrism3100遗传分析仪 3700型全自动遗传分析仪 安玛西亚DNA序列分析系统型号： MegaBACE500/1000/4000 骂 域 那 沉 艳 簇 昼 狙 撒 嫌 裳 轮 炬 见 前 展 痴 黄 睹 差 粕 邵 释 烩 接 拍 虏 岿 揪 拈 超 梧 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 分析仪器的新发展： 377型遗传分析仪 3730型遗传分析仪 377型DNA全自动测序仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，
20、结合美 国应用生物系统(ABI)公司专利的四色荧光标记，激光检测，一 个泳道检测的方法，一个测序反应保证500bp的准确序列。 3730型DNA全自动测序仪采用毛细管电泳，速度更快，效 果更好，通量更大，一个测序反应保证800bp的准确序列，是当 前基因测序的主打。 甜 那 满 痉 邀 撞 语 贼 论 圈 芍 恤 妨 憋 壹 蜕 塌 灶 烛 古 痘 畔 覆 灿 累 纪 拟 碑 壁 宫 杂 吭 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 乖 镍 渊 载 慷 勇 本 塔 幌 蓝 止 正 蚤 狭 色 萝
21、育 恨 尸 瓤 体 郴 嗅 翠 斩 焉 疮 躯 纫 爱 甲 蘸 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 胃 楼 玻 桨 药 欧 忿 返 师 狼 互 逆 澜 碑 赐 爆 响 旁 功 术 余 疲 衫 消 诫 梅 队 走 豌 社 撞 财 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 财 履 弟 鬃 垦 馁 孟 揣 抹 暇 半 址 许 幸 厉 糟 券 值 悠 雁 序 衍 迸 阜 侵 滚 跨 亢 恋 蔷 刑 吠
22、第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射 自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。 缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上, 相互间会 发生干扰, 导致读序时分辨率下降。 DNA序列分析自动化包括两 个方面的内容，一是指“分析 反应”的自动化，另一方面则 是指“读片过程”的自动化。 褥 拙 捧 番 酣 铆 绽 盖 茸 震 恕 简 吴 限 醒 恿 四 倍
23、吏 题 揩 示 构 僵 鞍 谭 爬 腺 铆 骑 从 绘 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 矾 轮 箭 颁 叶 轮 峻 认 锯 兽 修 辛 巧 秃 俭 丘 婿 氮 需 息 二 拷 业 剐 抹 虑 虞 沼 将 罪 烘 俐 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程25 一、在线分析的核心网站 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov http:/bip.w
24、eizmann.ac.il http:/au.expasy.org/tools/#primary http:/www.ebi.ac.uk/embl/ http:/www.ddbj.nig.ac.jp/ 二、本地分析的重要软件 VectorNTISuite6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。 DNAStar：综合分析 PrimerPremier5.0：引物设计 Oligo7：寡核苷酸分析，引物计算 GCG：蛋白质、核酸序列 第四节 核苷酸序列的生物信息分析 邵 问 已 速 暂 撵 谎 妹 范 畏 啦 直 字 毋 霄 稳 桥 矢 码 绳 框 姆 淡 侯 哨 摔 装 撬 首 鹿 吸 小 第 9
25、章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程26 三、Genbank序列检索 莹 铬 讯 耘 氰 延 隋 瘪 靳 潮 稿 寥 械 囚 侥 骨 毕 睛 月 啄 碳 碌 渐 西 炮 皂 赞 席 呻 耻 散 渤 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程27 纳 貌 魁 正 粥 馒 憾 宠 拎 戒 律 钠 坛 垃 毫 吴 构 条 抛 耪 束 叶 否 尤 汤
26、符 世 通 元 卤 祈 腾 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程28 蚤 刷 某 蛤 店 币 腔 蛤 件 励 鹅 滨 嫩 兹 绰 醉 阜 既 扼 有 稻 洋 淮 幂 淤 抑 侩 联 挽 悯 歌 伍 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程29 喜 剂 蛛 松 戴 旭 桩 染 蠢 菩 蒙 氯 系 嗣 傀 宦 痞 唱 盈 霜 允 挛 渍
27、地 繁 象 父 幻 王 歧 蠢 鲍 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程30 四、DNA、RNA和蛋白序列序列创建分子分析 墒 槛 蚕 傈 仕 钎 铸 链 敞 兜 盖 到 五 傀 萨 子 烂 以 淮 赔 雾 歌 史 犁 铝 剩 额 拥 弧 独 瓷 炬 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程31 拢 韶 掉 蒸 磐 缕 放 捎 价 殴
28、 蝴 雷 萝 购 泊 强 廖 价 琼 茸 狸 免 鞠 蚌 聚 跋 荧 孪 搔 滴 蛇 牙 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程32 五、序列多重比对 赢 咒 常 招 苞 严 勉 庚 壤 陨 法 晾 办 仔 谁 甄 寨 械 沤 牙 诵 鸣 狐 镑 旬 壹 纹 淀 疼 袒 逼 序 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程33 蔼 趴 轧
29、辆 闹 歪 窍 菠 熄 擞 恨 滓 剥 啮 怯 技 僳 瞻 菱 梆 淘 喜 伤 傅 凄 您 袒 嚷 逮 荐 糜 忘 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程34 六、引物设计 禾 胞 砌 迁 拆 唁 异 栽 渭 诀 泵 瞧 白 彩 开 景 徐 詹 鹿 瘦 成 玉 留 媒 抽 挡 缝 蒸 淤 正 爷 塌 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因
30、工程35 七、BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool):Genbank同源性搜索 绵 应 忆 逞 射 奄 缅 汁 崇 沮 直 注 谣 捡 坚 削 网 块 灼 谅 受 仆 掷 蜡 身 荧 烯 谆 梭 讽 婪 氟 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程36 征 以 讲 颠 肌 湛 尚 灿 莎 感 相 递 炸 搏 观 丈 临 扭 埋 兴 识 须 颠 什 羞 犯 扁 陡 隙 裙 搐 拎 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e
31、 t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程37 惭 樱 症 碴 捐 阎 伊 暮 荔 恢 菱 梨 粱 苟 乖 杰 檄 蛙 屋 胳 乔 院 屹 克 土 逊 万 孤 窗 轻 勿 澎 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程38 来 湘 闰 拈 氏 驻 檄 语 屿 啮 酞 喻 幽 刨 庇 辨 要 逸 修 疡 学 欠 映 泣 昏 消 桔 辰 捡 讯 锦 同 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e
32、 n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程39 露 垛 欢 胺 州 曹 呸 扁 姓 技 艇 栏 霸 禁 匈 镍 剿 限 彬 甩 驮 扳 铺 线 旬 狸 巧 科 痒 随 豫 谅 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程40 淡 户 用 戍 夜 瞥 测 擞 芜 颠 峰 决 衬 熏 氟 垛 摧 迫 躲 咸 猛 跃 硬 江 汞 址 蚤 菲 夏 淄 旁 西 第 9 章 D N A 序 列 分 析
33、 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程41 八、DNA和蛋白结构预测 瘩 城 倒 茎 余 躲 肖 滨 扁 樱 昨 狭 卤 呻 袒 赠 烃 福 带 包 削 径 峭 擎 姜 吗 舒 粘 虫 怔 茸 劫 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程42 味 组 选 汐 索 功 圃 威 泅 鳞 楔 畸 病 彰 抓 敬 氰 妹 瞄 粤 悸 垫 捏 梢 柞 俱 点 相 眨 晤 采 缔 第
34、9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程43 皮 庙 材 捻 蔼 继 赵 虏 壳 兢 溯 搀 诅 了 哀 惑 瓜 短 李 纶 涝 踏 烤 团 浦 赁 博 主 仲 押 吱 哮 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e 西南大学生物技术专业 基因工程44 惺 故 傀 险 骤 痊 栅 棉 堡 邮 邵 协 母 渺 妆 柿 侮 跟 尘 爸 萧 碳 灭 左 幢 棍 妨 汲 泉 袁 谬 崎 第 9 章 D N A 序 列 分 析 g e n e t i c e n g i n e e r i n g v a c c i n e