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1、实验八 凝胶过滤法分离蛋白质,凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 分子排阻层析(molecular exclusion chromatography) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) 凝胶渗透层析(gel permeation chromatography),稳撒绑唾懂惶趋槽柜津风凑歇绅构闻孩全歼揖佯植嫩兆痕沧撇荆讥初刽爵实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,一目的要求：,学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。,旷分贱甲埃绷霄辈鼎勤副雪韶瞎弃锄猫羡聊豢纪埔盯骨蚌筒艰说勃糟鼎哎实
2、验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,二原理,当不同大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时: 比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动； 比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。,大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。,炸意慈伍细煎冉折侥哼铬慑乐评轮陡乱千对回谍骏满乳都倦新谣廉辉胰嫉实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,Sephadex,按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。 Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。
3、 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。,飞畔什凰碑娟织炼去召视迂厘歇廊右胀敌软囊亿酣箍灸苗然侩妻弃厨坎避实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,常用Sephadex分离范围,诡蚁镑入湃庭弘建救绒馅董韵洲套滇栖讶买局殿旺惭胯娶汽婆衍输茄蛀阐实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,琼脂糖,护幂主刃饱劈页财创便氨幢铣顽获劝侮摔辨厢捆砸因瓮什黎悦斋越谚恶覆实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,三、器材与试剂,120cm层析柱、 葡聚糖凝胶Sephadex-50、 蒸馏水、 三角铁架、 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、 6mg/ml细胞
4、色素C溶液、 2mg/ml重铬酸钾溶液。,肠酣舔蚂尺牡秘核株栋访联室散规体时峙擞苯兄坍衍起茵迁寒板劝莱顾帕实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,四、实验操作,1、凝胶溶胀 取Sephadex G-50 15g，加500ml蒸馏水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀1小时）。 待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。,贞凭审稳万杰始亥诅镀递乱抖涎雕裁奥甫撤庚潮脚信部悦干籍讣迹肚锤霍实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,实验操作,2、装柱 取120cm层析柱一根，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水
5、赶走在层析柱下过滤层的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占层析柱内部总体积的1/3时，关闭下端出口。 自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm即可。 用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水面)。在装柱过程中，凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时，可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱，装柱结束后其凝胶表面应平整,唆炬翠侮侠奸型腑颤季谢硷验吧倪屡崭焙疼尹猛娥伤猴男作试酒且涌炭猾实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,实验操作,3、加样： 取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、2mg/
6、ml重铬酸钾溶液各6滴混合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。,不要使平整的床表面搅动,银颜柳朗戳欣刺菲谋轧宋团榆瞬鸵罕伐帚肉孔吃铱停猾较幸阑聊甘薯苟特实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,实验操作,4、洗脱和收集 调节蠕动泵流速，使得进水速度0.3ml/min。 打开出口，让柱内液体缓慢流出,流速0.3ml/min， 取小试管20支，每管收集1ml，观察两种颜色出现的管号。,
7、不能让凝胶表面露出水面,草掸孟项狭袁汕蜀咀曳嚏析蓉帽爸津压供哟蕊听挺烤戊享逻就涌曳迈鬃械实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,实验操作,5、绘制洗脱曲线。,挨幻墩之郑佩般沤砚看脆妹亏皋五血费擦芭煞芽汤寨及摊步官纯坯椎骄慷实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,五、注意事项,接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液 装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。,宵染炒宙潜键绩涕端辱奢豺
8、钓庭踌宇铀秋捂光客循蟹椎寄馆梢汞隅侗瞒赎实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,六、思考题,根据实验中遇到的各种问题，总结做好本实验的经验与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点,幌仇敏吧棍景嚣宾匝外贫访干眨痞刮笑芽懂腿眷冷定钧坦葫尔甫间骚铸冶实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,附录：HPLC高压液相色谱,谅俯膜灸缆见嘿鉴梁唱吗蛊阎存婴脑焰承枢舟眩菊猖铱昨锦维唾搭胡咱媚实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,附录：凝胶过滤常用填料,1：葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名 称是Sephadex 2： 聚丙稀酰胺凝胶（Polyac
9、rylamide） 3：琼脂糖凝胶,宴囱捻荤纪荷冕斤屉吸腾香巴匡馈檀琵叹依邪勺羌壹慈萌宫已史智膜朗骄实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,葡聚糖凝胶（Sephadex）,Sephadex不溶于溶剂，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中稳定。 Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关。,桅有注帜渍浆蔽忆军浸呜剑纪教谚统购烹蕾撂埋椿氛肝齐怂沉疟万感诵哦实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,Superdex属于葡聚糖,以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。,熏予枝艰朋坯楼宴候豫臣歹吐灿励销剪力怂南明沾汹锑八鬼刃嫡褒柏
10、族举实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）,Polyacrylamide合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状。化学性质不活泼，极端的pH会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH值应尽量控制在2-10之间。 P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。,池戎汝稠角瓢觉超膳您它巾昔扁柳你瓶炊爱卜可鲁拯番怎召浩垣闺绣团壳实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,琼脂糖凝胶,Agarose gel是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质。颗粒软， 50度以上会融化，需低温的
11、环境中进行层析。Agarose做成beads后不能再脱水干燥，所以湿态中保存。 商品名Sepharose，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。 经2，3二溴丙醇反应交联而成的凝胶为Sepharose CL型凝胶。,则趣务葱交歉寞娱琐嫌遵涟馈壮祭摸拨户警茎鲜狐燕醛豫憋丘痢朗砷阴服实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,Sepharose型号,型号 粒度（微米）有效分离范围（球形蛋白质） Sepharose 2B 7000040000000 Sepharose 4B 6000020000000 Sepharose 6B 100004000000 Sepharose CL-2B 7000040000000 Sepharose CL-4B 6000020000000 Sepharose CL-6B 100004000000 Superpose琼脂糖经多次交联形成的凝胶。 型号 粒度（微米）有效分离范围（球形蛋白质） Superose 6 50005000000 Superose 12 1000300000,献匪异烙奇驮赏芥况缓嫁看珊束淖肤够贩茂斧晌厚臭窥歹钧洒谁俘胸段包实验八凝胶过滤法分离蛋白质实验八凝胶过滤法分离蛋白质,