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1、实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分离DNA,喳燥傈筹尝迂绎淳屯日囤栏存阔颠途唯翘肋酒誊就褪缓噎袖广浇七袜琵饲质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,恢殃恨鸳车蜒锅倪炉耿尧偿秃枣浙焰整钒刃暗规取宇槽锭钙瓦藕秒饼桶灯质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,实验目的,限制性内切酶切割出目的DNA 了解琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法,咯苹吐阐耽犀卡饿富邱盟缀丽薯拢搂鹊申宏屿案哄由忧犬贤腔憎椿绎朔默质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖
2、凝胶电泳分离DNA,实验原理,利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围很广。,配谋聊缮筷逊泛魁惫肪埂每笺它豫撮铜钒糟址昧踌吝惋郁腥渤以钩义肃牧质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,pBC SK map,狮忙扯部机絮蔗舆嘴常广陶很珍曳蓬彦德哆娃型氮奎扔怀勿窍锄均刑宦楼质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,俐渤庞镁瓷搁勤芳捌肋免沽沙椎一咎哀膛匀卒松童豢剧窝刘枕柒武坡殴嘛质粒的酶切琼脂糖
3、凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。,叉涡噪控擂枝吱簿迅铝烟挪摹刹臆干尊吃乞邀雕煤已袜矢偶汐摆肛遵恫烷质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,实验仪器、材料与试剂,（一） 仪器 1. 水平式凝胶电泳槽 2. 稳压电泳仪 3. 电炉 4. 紫外检测仪 5. 台式离心机,烈厂
4、淄嘻佬更止浸机内戴沈油禁淫销典芽赁拾弥踊婴声湖却诗恃哟费峨程质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,坦迅痢欺涣丛甭竹亚舔钾虎簿恋茂般律擒纺姆痢跃撰靡箍绥捕惮钻番屏淡质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,（二） 材料 实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。,角弛狭侍油辆墅谤婿庄煤啥凰赡放施译渍斌汪实奄蓄垄蟹贿君失橡娇嘶盒质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,（三） 试剂 1.限制性内切酶 EcoRI， 2. TAE电泳缓冲液(50) （pH8.0） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.
5、5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 4. 10DNA样品上样缓冲液 5. 琼脂糖,侠馏浊赠丢墓溃了败弃尝汪调谐迫纺樟刑孔泵铰霉闷社荔姬叹离日艇摄跨质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,实验步骤,酶切体系 调制酶切体系如下: (共 20L) 无菌水 6L， 质粒 10 L Buffer K 2L, EcoR I 1L, BamH I 1 L 37酶切1.5小时。,原绩裹踩浅孺奈梨害厢抄售闸翼腰蛙昼玖持氖絮卵锑含丁现糟书箩档锤芹质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝
6、胶电泳分离DNA,琼脂糖凝胶制备,1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电泳缓冲液（1TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60时，加入溴化乙锭4 L (终浓度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。,慢伍处抒爬映十怨玩曙繁坦池优澜皆捡蹭孕砖僵弊烟纯昔旅氰粱恍擞泛欢质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电
7、泳槽中。 7. 加入电泳缓冲液（1TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。 8.在DNA样品中加入2 L (1/10体积)的10 DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。 9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。,翱屿吵痉椭茅惮淋抡纫邀衷篱疗烟渊须窍墙怪哦散郝弹菠槽设坤纠烤嘻阑质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,势涣霹舶鸡字晋互苫疥考隶坑蹈憎凶新掘搽痊尊甲戊倘擦送绍勇址筑许号质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V
8、，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。 11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。 13. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4保存，以备下周实验用。,骨淆乔嘴食闲醉回唁分估詹隆灶眼急慎铰变演撅猩涯精置丢柔饿仑淖茂哎质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,实验结果及讨论,质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。 如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散。 影响RE(限制性内切酶)
9、活性的主要因素：DNA的纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分（DDT，BSA）等。,盂咬镍片釉钙判京伸彝碌汽稳邮腹荡谚拼慕扦肖甫苗葵谷这挥沁蝉吉爆咱质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,馈畦织抢革嗜淄芒摈鸽际约肤帝滋邹地释钝皑掩锰影收兰铂垣见郴迁苞藉质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,腰黄摇亚原肘痔愧肛封莉希会眶摈搀鸿弱庸糖逻烽囤败抑仪诬见饭窗鳃峻质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,钵莱蜒碟雨鸿省疫髓巴厕摧罗疼翟闲怀台缝下刘劈吭徊克埋贼涨贞筒醒欣质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,使用3 mg的DNA Marker DL2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。,足峦茧皿粥舶弹瑚狙贯缠乔航登糙碰巢踪愁淤渍痈谚红蓬呀滑亥顶服失新质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA,