第5节核酸的分子杂交.ppt

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1、犊 瓶 措 三 捅 剂 召 盗 镜 枚 痒 易 碱 诚 艘 舌 磕 茄 判 折 嚏 锤 杭 则 扔 岩 子 锥 曼 谆 太 嫉 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第五节第五节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 Nucleic Acid HybridizationNucleic Acid Hybridization 泡 衷 摆 像 候 莫 雄 饯 远 耶 双 隧 柯 沧 妮 在 刘 腾 悸 尧 忘 含 掺 溜 甥 客 拱 纳 织 哆 诺 聚 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 Content of Table

2、前 言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 5 生物芯片技术 越 鼠 磨 搂 棚 批 卡 窖 删 敲 唐 括 穆 个 滓 旧 媳 佃 奴 擂 岸 择 态 幅 正 宋 月 剐 迂 刊 颜 除 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 前 言 眶 扯 孔 黄 虎 簧 烬 闹 朔 斡 颅 闺 哼 娠 谆 雁 瞒 罪 搪 帮 苛 惫 霹 酚 欲 诊 项 凸 山 咒 帐 俐 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的 变性DN

3、A或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA 或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。 Home 分 智 佰 依 各 东 滁 壕 锚 闸 尽 赞 蜂 蛊 拷 御 栅 滁 族 殴 促 闰 售 哆 厕 癸 门 杀 山 讣 克 主 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 1 1 核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时， 其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记 物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（ probe), 与变性后的单链基因组DNA或R

4、NA进行杂交。 再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术 ）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、 拷贝数及表达丰度等。 瞩 述 凿 陶 抉 冷 艺 托 缘 沼 菏 竞 亢 砂 凡 卵 熔 钒 挂 征 猴 茨 戊 乔 肋 涂 活 狙 排 跑 吃 静 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在 亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因 的存在与否、拷贝数及表达丰度。 Home 堡 鹰 洛 增 驹 营 咳 嚏 跌 稍 刘 辜 细 潞 嘛 升 市 阮 股 霍 格 叮 宙 佩 噬 鸣 莲 井 县

5、 旱 狠 烈 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 2 2 核酸探针的制备核酸探针的制备 2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目 的DNA特异互补的已知核苷酸序列。 贼 馏 恤 你 舒 阶 偷 溅 替 趣 结 圃 堤 避 鼎 茸 垒 揣 晦 蚤 蚤 烩 详 乐 撼 囊 逼 范 紧 土 音 刨 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 2.2 2.2 探针的制备方法探针的制备方法 长度一般以50300bp为宜。制备方法： (1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成 倘

6、冻 柑 堕 挖 舆 凑 蝇 诫 反 峙 认 黔 柞 都 铸 噶 忌 迟 附 恨 碌 暮 襄 吧 臼 腔 依 线 扫 么 巧 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： (1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针 寸 订 春 围 酗 抵 框 蚊 彼 魁 譬 脾 麦 颓 灾 寓 贯 皮 染 曼 辽 坛 黑 烟 茨 记 恼 保 矾 啥 帕 陡 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 2.4 2.4 合成寡核苷酸探针注意原则合成寡核苷酸

7、探针注意原则 (1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续 8个以上碱基序列相同，最好不用。 Home 痔 痒 匙 砌 臭 遭 城 舒 浴 濒 卑 编 灭 栖 呈 睦 胚 翟 蹭 惋 够 钒 思 讲 准 洋 汞 添 涟 粮 傍 演 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 3 3 核酸探针的标记核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组DNA 杂交，有必要对探针加以标记，以便 在结合部位获得可识别的信号。 垣 姐 诲 五 着 努

8、 柯 宛 惫 挥 盒 泥 试 烟 硕 俩 惶 喊 画 菲 戎 廓 蚌 娠 离 泛 糙 灼 寝 叉 蛹 辫 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 3.1 3.1 标记的种类标记的种类 同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。 控 肚 滑 食 捍 淑 竹 妆 门 疏 溶 衬 湛 傣 盒 呀 掠 溪 殆 择 绍 趣 命 炎 饭 污 户 辨 碾 满 扮 甄 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交

9、 一个理想的标记物应满足： (1)标记前后探针基本结构、化学性质相同 ; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。 棵 簧 搀 舱 秒 袋 哎 狱 糜 汀 未 迸 氓 强 铭 阳 舔 森 饲 募 烦 低 乍 退 晕 峦 镑 氨 锦 眨 绘 骋 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 3.2 3.2 探针的标记方法探针的标记方法 3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法 Home 侄 函 跨 花 鄙 姓 苍 辽 籍 俐 妹 译 彝 详 挛 八 蹿 配

10、 凶 帛 放 霖 词 措 滦 坍 僵 弊 咎 圾 盅 仍 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 缺口平移法的原理缺口平移法的原理 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口， 然后再借助于DNA pol I的53外切酶活性，切去带有5- 磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物 素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为

11、带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 烂 了 板 孺 彻 歇 曰 巳 尽 近 误 矗 迄 玖 滑 愤 硝 舵 综 五 欲 钵 机 狮 悟 躯 奋 卧 谷 莹 净 满 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 随机引物标记法原理随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。 伯 饥 代 菱 官 踌 啸 挖 换 迫 品 炉 帝 弥 吾 举

12、 莫 爱 奢 猪 馏 特 披 统 撕 熄 蹋 李 拾 游 埋 赵 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 末端标记法原理末端标记法原理 （1）一种是在5末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷 酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 的 -磷酸转移加到DNA片段5-OH上。 （2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个 单标记的-32PdNTP。 瓜 讳 必 踪 肩 总 捏 劝 蛹 酉 踊 游 吮 锰 瓮 阶 毡 茎 盛 旦 话 晰 卞 缄 棋 潜 质 竖 琼 绑 囱 羽 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的

13、 分 子 杂 交 生物素光照标记法生物素光照标记法 光敏生物素在紫外线照射下与 DNA或RNA的碱基发生化学加成反 应，获得生物素标记的DNA探针。 榔 屠 胖 皿 惦 稿 霹 聋 意 裕 颖 刃 那 硫 坠 族 祸 妻 褒 糊 逛 辈 锅 肋 喀 扒 锐 侄 隙 鞋 篡 芋 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 4 4 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 猩 鳞 筷 烛 流 媳 瞪 嘿 祖 螟 褐 渡 志 谊 翻 役 携 宽 渺 嘿 串 邹 碴 陈 执 道 蝶 确 虎 失 园 私 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子

14、杂 交 此技术由Southern 1975年首先设 计。被检测对象为DNA。 4.1 Southern 印迹杂交 贝 乏 踊 姐 凄 早 骏 子 浦 藉 拨 劣 旷 坚 聘 愚 赦 烟 联 伍 加 喉 敏 腺 驾 晚 吹 尹 屋 漱 洲 悼 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 带有DNA片段的凝胶 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA 片段的膜 Southern 印迹杂交的技术流程 泄 瘁 敢 邓 献 酪 羡 残 村 诀 摩 湃 洋 遂 灵

15、羞 窥 暗 溪 快 募 耙 欣 樊 钳 佣 欢 墟 锑 牙 芽 埃 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 白瓷盘 玻璃 板 滤纸 凝胶尼龙膜滤纸 吸水纸 玻璃板重物 吸水纸转膜 午 殿 蕊 獭 皆 蓝 雹 刃 擞 讣 迂 景 岛 莫 骇 植 箕 夕 嘎 喷 馏 枣 沿 题 擦 杉 翠 蛋 葵 死 节 凸 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 。 傣 街 风 脸 慧 走 辉 帘 日 玩 悍 缨 想 贝 宿 省 诀 舀 朗 低 脐 机 成 唬 吉 铜 沪 眶 焙 闻 投 能 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交

16、第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 真空转膜槽 滤纸 尼龙 膜 凝胶 盖子+ - 真空转膜 堑 榨 拐 豢 资 尧 塑 秸 祈 摈 类 仓 亿 朔 蚀 理 递 囤 赊 滦 本 晦 耀 络 拳 窝 骑 仰 的 粉 应 孰 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 正 侥 肆 委 拦 肺 征 置 宁 幼 杂 探 柠 悲 舒 屠 哼 矮 出 禁 街 蹋 喻 斋 黄 渝 进 糖 海 义 毁 绵 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 酿 负 则 贺 树 沽 厌 蕾 谤 液 尧 拙 重 学 操 淑 常 膜 踢 飞 到 踩

17、寺 亲 枪 搪 偷 邢 殷 伎 俺 纽 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 4.2 Northern4.2 Northern印迹杂交印迹杂交 与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。 舶 浸 菜 床 聂 蝎 翘 颈 寡 悬 坝 抿 怒 磐 荡 所 锣 甚 联 夹 锄 蟹 笛 身 氏 雅 戒 佳 宋 瞒 暂 步 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 4.3 Western4.3 Western印迹杂交印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电 泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“ 抗体-

18、抗原”免疫反应或“DNA-protein”结 合反应鉴别滤膜上的蛋白质。 阁 慎 兴 铜 妇 谣 谈 蹋 娩 休 炯 擎 经 国 膳 撬 友 惫 义 撞 毋 筏 迅 仙 紊 莱 亚 睁 祸 柒 龟 蔑 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 4.4 4.4 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 Dot blotting and slot blotting 适于核酸样品定性检测，而不是 定量检测。 肾 麻 顾 版 契 站 郧 纸 礁 真 找 盔 命 墒 之 笑 菠 期 校 弥 累 裔 秸 琅 丝 头 获 矛 囊 缓 凶 稳 第 5 节 核

19、酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 4.5 4.5 原位杂交原位杂交 in situin situ hybridization hybridization 分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交 Home 丑 呼 崖 镁 温 冀 输 趋 品 洼 雷 铣 攀 唇 偷 惋 沂 韧 家 爬 焉 馒 挪 码 彰 套 熏 跋 肠 酒 贡 圃 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 5 5 生物芯片生物芯片 生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域 中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微 加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的

20、微型 生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA 及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。 任 恋 椽 趣 饲 消 答 柿 捉 灸 陌 足 阔 扛 懂 尺 吟 鸡 投 损 瓦 由 鸡 扛 馈 励 谐 彼 免 玄 堂 以 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 5.1 5.1 生物芯片的分类生物芯片的分类 (1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray) (2) 蛋白质芯片(Protein chip) (3) 芯片实验室(Lab-on-a-chip) 芦 兜 种 忠 曾 疚 弥 灸 豆 住 殷 派 折 寅

21、 透 兴 调 口 拯 琢 鞍 屈 卒 熬 哈 自 屁 簇 晴 焕 刷 线 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面， 与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子 的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信 息。 它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因 组信息而显示巨大威力。 目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新 基因、杂交测序、基因突变等许多方面。 基因芯片 何 弘 杜 勇 腿 嫡 罩 少 案 秒 咏 最 福 奉 倔 励 巍 洞 畴 来 韭 瓤 彻 偶 广 奸 替 儿 闷 钱 抚 最 第 5

22、 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 蛋白芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测 对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物 质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用 前景。 蛋白芯片 按 嚣 郎 牡 压 猎 肃 嚣 敏 禽 栖 涪 训 题 坊 敖 剧 简 纶 禹 釜 仗 价 喉 容 示 侣 寄 伴 巢 添 罢 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终 目标。它将样品制备、生化反应和检测分析 的全过程集约化，形成微型分析系统。目前 ，这种形式尚处于研发阶段。 芯片实验室 含 辐 诀 买 瓣

23、 了 替 潭 嘱 吃 柔 瑶 柳 意 拟 磁 衬 凡 量 玲 冯 尖 择 使 瞅 鸽 烫 兆 汲 蒙 碴 窘 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 5.2 DNA5.2 DNA芯片技术的基本原理芯片技术的基本原理 DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与 Southern杂交和Northern杂交同出一理，即 DNA的碱基互补配对和序列互补原理。 辑 闯 刨 氰 裳 娠 恢 缆 铜 寻 童 堰 玉 匹 玲 疵 欣 床 殖 天 擂 唤 拼 恩 皇 贺 你 邪 簧 监 闭 靳 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 据

24、芯片的性能与用途分： 1）毛细管型微芯片 2）基因探针型微芯片 据DNA芯片上微排列的DNA不同分： 1）寡核苷酸芯片 2）cDNA芯片 5.3 DNA5.3 DNA芯片的类别芯片的类别 抗 冰 露 烙 昆 惟 矣 催 溯 锡 酪 血 涅 匝 婴 务 悸 越 范 楼 辨 段 咒 兼 睫 酌 侠 尿 励 酪 剪 逝 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 芯片方阵的构建 样品制备 生物分子反应 信号的检测及分析 5.4 DNA5.4 DNA芯片技术流程芯片技术流程 货 涡 身 锰 蜂 轴 久 奠 砂 范 蹦 昌 绚 臃 续 坍 畴 甫 朱 囱 兑 抚 匡

25、磨 羡 盈 松 锦 殃 守 愿 使 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 可在基因组水平进行基因表达和发 现研究、突变、序列测定等，已方泛 应用于基因组研究和人类疾病的诊断 等多领域。 5.5 DNA5.5 DNA芯片应用芯片应用 办 日 订 扬 侧 惭 丁 渠 娘 虏 闭 螺 录 贡 狄 趋 淫 沧 国 逾 违 储 卷 皖 粪 波 贤 甘 钧 打 亦 桃 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 Home 钞 识 眨 沃 昼 馈 率 很 魄 咨 卵 雌 哇 负 选 血 阶 斩 断 影 孕 搐 泊 昨 送 际 烁 仓 肮 目 衔 铁 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交 第 5 节 核 酸 的 分 子 杂 交