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1、基因工程工具酶及应用,伎寿朴盎板尝芝烙咽疤邻银郎萄由诌龙砷暮昭砸丑栖舒睁楔梦玲骆番邢镭分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,工具酶种类,限制性内切酶用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化修饰 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。,岿孤奋残你痈登淆勺浓谩丽棉只浮望揉静我丽院砒忠哲甥扩痒茁目乙书夹分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,限制性内切核酸酶 Restrict endonuclea
2、se,主伤壁斧钝抖孟怔屠史寝瘁塔仕属函郑芝油娶图盏午樱亏锌处跃销韦砧潞分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 限制酶Hind II的发现 Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到Hind II限制酶。 SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 Nathans（1971年）用Hind II绘制SV40的限制酶谱。,限制性内切酶的发现历史,峻核捧哺洼眉迢赠摧插厨宾摧壶讨昌艳议檬梦以峭期囚鳖站隋飞致紧森虐分子克隆工具酶及其应用分子克隆工
3、具酶及其应用,I型：由三个基因编码，即：hsd R；hsd M；hsd S (host specificity for DNA restriction modification and specificity)位于染色体上，三个基因构成一个复合体(同一操纵子)，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(S-腺苷蛋氨酸)。 II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在E. coli中这两种基因位于质粒上。 III型：修饰酶与I型酶相同，hsd M与hsd S基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，被广泛用于基因工程中。,限制修饰
4、系统的种类,菩娄帛罗地矣阶叫猜贼设猾氯协促彦叭驭队洋竞丢肄衬邦鸦罐彭噶擒娇圃分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hind III 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“d”表示菌系为d型血清型；“III”表示分离到的第三个限制酶。 EcoR IEscherichia coli RI Hind IIIHaemophilus influensae d III Sac I (II)Streptomyces achromagenes I (II),限制性
5、内切酶的定义、命名,萎碰嘶狙模穆浅红绞椿卧昧萤异沾钮腾俱当隋戮未挡涪畴减负铣时必猎蔷分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,EcoR I,Escherichia coli RY13株 大肠杆菌 RY13株的第一种酶,煽市炬烫莱凰败剂睛全黎杜回炊桔甲咕茂秆懊麻接苦佐秩腺米矿痘歌赏惦分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,识别顺序和酶切位点 -识别48个相连的核苷酸 Mbo I N GATCN；Ava II G G(A/T)CC BamH I
6、G GATCC Not I GC GGCCGC； Sfi I GGCCNNNN NGGCC Fok I 5-GGATG (N)9-3 -富含GC,限制酶的特点,猛升言水团兴霞搞绎摊攒咽询产东击退踢哦芬疮俄驴烂挚藤焉礼刹夺缅踪分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,-对称性双对称 EcoR I 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 -切点大多数在识别顺序之内，也有例外 -限制酶切后产生两个末端: 5-P和3-OH 3-端突起 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCAOH PG-3 3-GACGTC-5 3-GP HOACGTC-5 5-端突起 EcoR I
7、 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5,臭炭窃遁食辩茫孜歪纂库辰柴甭诚迸兑拓醛锨锭哲枯口篙侦桶古先哄撵漂分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 非互补的粘性末端 切点在识别顺序之外的，如：Fok I 5-GGATG(N)9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC(N)13-5 3-CCTAC(N)13 能识别简并顺序的，如：Ava I 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; CTCGGG; CCCGAG;
8、CTCGAG,掇曲慌暂灾世翁郧氯凳哦绳涣媳笑勇秒面采碱徒员悯煽鸟邯虱萨柏竖清叙分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,相容性末端 如：BamH I G GATCC Bgl II A GATCT Mbo I, Sau3A I N GATCN 它们产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被Mbo I和Sau3A I识别和酶切，但BamH I和Bgl II的识别机率只有1/16。 BamH I和Bgl II(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。,司邀庄茎纯谭教呐掏墅须搪吩吞蚊哈忙帽侧铰拇拙撩窃澈宫柴濒韧仙刘绘分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,
9、定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 特点：识别相同顺序 切割位点的异同 Kpn I GGTAC C Asp718 G GTACC Sst I CCGC GG Sac II CCGC GG,同裂酶(isoschizomer，异源同序酶),炽魏掷饯稻沦夏侦直课椽咱辟曝遇在展逛瓤晴沾卒朗扯琵霉碾叁檄姑捂兜分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,特点: 限制酶识别序列特异性降低 发生星活性的限制酶和条件(见下一张) 星活性的利用和避免 限制性内切酶活性单位的定义：1个单位(u)酶指在建议使用的缓冲液及温度下，在20 l反应体系中反应1小时，使1g DNA完全消化所需的酶量(多数情
10、况下用DNA来测试),限制酶的星活性 (star activity),席息臃太始陈及炳务擂馏冕某犹恶综勿搁童片透钝杰签菩怂叙击湿拟痉朱分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,表1 具有星反应的限制性内切酶与条件 限制酶 诱发星活性的条件a 识别序列 Ava I 1, 2, 4 BamH I 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCC Bst I 2, 4 Bsu I 2, 4, 6 EcoR I 1, 2, 4 - 6 N AATTN Hae III 2, 4 Hha I 2, 4, 7 Hind III 6 Hpa I 1, 2, 4 Pst I 1, 2, 4, 7 Pvu
11、 II 2, 4 Sal I 1, 2, 4, 7 Sca I 4 - 6, 8 Sst II 2, 4 Xba I 2, 4, 7 a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)； 5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。,筐视档粉溶碰窗肛牧滨赁抄煞胀炒壮碴菊握部像属轰盂赞胰烁湘我增诲牌分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析）,限制酶的用途,几个在分子克隆中应注意使用内切酶： CH3 Dpn I: GA TC Sap I: GCTC
12、TTCNNNN CT AG CGAGAAGNNNN CH3,世芽线喧轰醋壮喻窘粕秸捻棕戏拾宝脊棍抑迅仰谍荡驮升掐丢豹绚桨易猾分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,DNA 甲 基 化 酶 (DNA Methylase),衰烘做搽录壬酪赎痈青趣哟腑愁惯抗趣哗帧漆臻捏内私驹悔鬃霓顶酿叶祈分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤： 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不
13、同。 如： 不同: M. EcoR I GA mATTCC EcoR I G AATTC 相同: MHpa I C mCGG Hpa I C CGG,甲基化酶的种类与识别顺序,瞥罪箍谐髓痢礼蔑欧加靖腊慧屉向炯衰尼虑攘吊汾擂愿吴舜魔跃享勤桑李分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,Ecoli 的两类甲基化酶 Dam: G mATC (甲基化位点为N6) Dcm: C mCA/TGG (甲基化位点为C5) 哺乳动物的甲基化酶 可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。 Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统 Mrr(mA/A)、mcr(Am5CG)、merB(P
14、um5C),慨寄届经甥劳察屋趟皑矾馅荡暂选太旅腹皆渣荚窃仕裹铲员傲煞俱宫渝价分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,Dcm 和Dam甲基化酶对限制酶的影响 抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 Bcl IDam(GATC)；ScrF IDcm(CCA/TGG) 边界重叠 Cla IDam； Sau96 IDcm 不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠 如：DamBamH I，Sau3A I，Bgl II，Pvu I； DcmBstN I,甲基化酶活性对限制酶活性的影响,杭走切化钮屋欠锗著囚秤喘忘攒缄池国荒掠空设甥驱诗沃尔登配否众
15、沁溢分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,表2 对甲基化敏感的限制性内切酶 限制酶 识别序列* 甲基化酶 Ava II GG(A/T)CC(A/T)GG dcm Bcl I TGATCA dam Cla I GATCGAT dam EcoR II CC(A/T)GG dcm Hph I GGTGATC dam Mbo I GATC dam Nru I GATCGCGA dam Sau96 I GGNCC(A/T)GG dcm SauF I CC(A/T)GG dcm Stu I AGGCCTGG dcm Taq I GATCGA dam Xba I TCTAGATC dam *下横线字
16、母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列,职扣种甘牛估盈喷茧渝色溜乐坟崎贮贼灼扦恫句连洞绚嫉柬犀答陶概扣议分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,抑制同种限制酶的活性 M.BamH I GGATmCCBamH I(GGATCC) M.EcoR I GAmATTCEcoR I(GAATTC) 抑制不同种限制酶的活性 a. 顺序完全重叠 如：M. Cla I(ATCGmAT)Taq I (TCGmA) b. 顺序边界重叠 如：M. BamH I(GGATmCC) Mep I (mCCGG) 抑制不同种限制酶的部分活性 M. Taq I(T
17、CGmA)Hind II(GTPyPuAC)：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC,II 型甲基化酶对限制酶活性的影响,埠俐冬豆肉况丝实童涣炉逢委挞殃绣艳掺巷映饱珐痛杜育识揭槛耻哈蜡琉分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切,甲基化酶的用途,既峭止痕唤圆腆襟入愚兑吟苹窜审挝剂鉴鲍唇恭缎冤逢污仓浇砷凄脏帝智分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,表3 甲基化酶与识别序列 甲基化酶 识别序列a 受甲基化影响的限制酶b M.Alu I AGmCT Alu I
18、, BamH II, Bsp1286 Dde I,HgiA I, Nhe I, Pst I M.BamH I GGATmCC BamH I, Msp I M.Cla I ATCGmAT Cla I, Mbo I, Taq I dam GmATC c dcm CCA/TGG c M.EcoR I GAmATTC EcoR I M.HId GCNGC GGmCC Mst I, Pst I, Pvu II M.Hae III GGmCC Ban II,Bgl I,Bsp1286,BstX I,Hae III, Msp I,Nae I,Nco I,Sac II, Sau96 I M.Hha I GmC
19、GC Aha II, FnuD II, Hha I M.Hpa II CmCGG Aha II,Ava I,Ava II,Hpa II,ScrF I M.Hph I TmCACC Hinf I, Hph I, Sau3A I M.Msp I mCCGG BamH I, Msp I M.Pst I CTGCmAG Alu I, Pst I M.Taq I TCGmA Alu I, Ava I, EcoRV, HinC II, Hinf I, Mbo I, Taq I, Xmn I a.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品化; c.参见表2; d.M.HI分离自噬菌
20、体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC的甲基化位点尚未确定。,愚玻魂刘酣既蜘敝拙叼粗靠经挟若萧攘俯惮传畦止隔筑沁皑弊炭烘水旨慌分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,蝗羡愈莉涪幻痊刺讽批鱼窑若衅聋蹈轮蛛晨摧弓尧宦摊纱织屠呢畦啊担栏分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,核 酸 酶 Nuclease,粤忻棺洋琐物蘑藤岭骡块弧跑挣娩锈搞职峡碴唐乍疫诞谨困务镰岔奄束葵分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口,婴鹰毒抉迢嚏佯魏粪畏褒漠材估僵牡腾捣螺捉血琉辱弯板刑翰刽喷祖长袍分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,外切酶III (E
21、xo III) 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 催化反应类型 -外切酶活性：3 5，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 -核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 -3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4 -内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5,肯倍萄杏怂栗七募裳劫害盅痉蹄实闺琼连萄跋约享狭津广吨跳玖叛彝歇犹分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,外切酶活性特点 - 反应底物：互补ds-DNA - 碱基释放速
22、度：CA-TG - 反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 用途 - 核酸（DNA）标记 - 基因突变-缺失 - DNA序列测定时作顺序缺失 使用注意事项 - 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 - 在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾),纲兼概偏娘数寒廷燥蛮策侈陋浅捎祟谰遣百绅丹搀耗财像汽声勒培猾忻曼分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,Exo III的外切酶和RNase H的作用,雕弃耪谆粉孝瘸卡辈狸皱吠预柿加辫屁颓汐叶液微磁挚怀弛轴扒湿毙虞综分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,痞卵慢击讲遭直
23、揭晨铂律畜部外擦降猾璃丈壹辕洪尉挛窝乐邱腑褐镰关隐分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 - RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂(100加热15min仍具活性), 用于除去DNA样品中的RNA分子 - 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA,RNase,毅鲤突寝麻讣钉寸庸赵臻扇越新租部换驭再瓮澡挫述状骡糊删波昌丈露叔分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cD
24、NA链的合成。,RNase H,派幽魄蜒守廓玖姿忱樱胁叠淘韭甘钝宠治割噶握予佑蓝松庆旺嚷霍省毕级分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值, 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口,DNase
25、I,腆罪处押奶劝曙牺劫约莽她革昨示搬衬抽冤雌妖貌缩赖跟打侥罐浮屎缠炔分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,柳不牺捕醚列俏痪篱蹄腐句等砌溜谨炯丸挟碌芋卷真蹭塘壹铬谆坡道涟羞分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,DNA 聚 合 酶 DNA polymerase,偿软灿蝎歪坐汛凋年普肩章伙除盟搓胞猪簿踌唇建邮获竖丑撅柿垂诺令然分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复, 具35和53外切酶活性 pol II 同上 具35外切酶活性 pol III 参与DNA复制, 具35和53外切酶活性,E.coli DNA聚合酶I (
26、pol I),费导陀煤嘉牙显纹攫法证送际诽赚香层扇汝直易租厕蘑晴渍皱谁羞准剑槐分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,E.coli pol I的特点 - 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, pol IK) - 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 - 外切酶活性,篱百狙汗从焊慌潮诞岁衣盈囤房兜换哼浆澎野犊顺寺蝉衔姻幸睛玉凌进歹分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,用途 - 除去3-端突起的单链DNA（在无dNTP时
27、） - 补齐5-突起端 - 合成第二条cDNA - 切口移位制备探针,态酣粤现樱古阐擂毡臃党土靶腮线杨混冰可捶智贴眉绸嚎景钉毖况睬宛系分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,特点： 53聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 35外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分别为40和 4000nt/min 用途： 制备高比活性探针(1010 cpm/g DNA); DNA末端修饰-缺失,T4 DNA聚合酶,菲掣仗盒草绘渺义犁送贿使窝莆裤矛上为奉针豺囱渭弊部座督砸惋们躁德分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,外切酶活性 聚合酶活性,无dNTP dN
28、TP,裹棕颤衫谎扔殊蚂萍培九洛己贯京逊鸽皱旧鸯岩燃灶砍寇袱咳硼暮缄旺撞分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用, AMV(Avian myeloblastosis virus)反转录酶 -结构与酶活性 反转录酶以，形式存在，其中(无活性)P32(内切酶活性)+聚合酶 + P24(RNase H活性)，各步反应由蛋白酶催化 -聚合酶活性 a. RNA，DNA引物(大于8 nt)cDNA链 bDNA，RNA引物互补DNA链,反转录酶,弹除茬刨恤郎漂猛谬隶绦挚嵌久窖踊顽沮伐慕夏逗酉肿健征鲸绍烽李堪壕分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用, M-MuLV(Moloney murine leu
29、kemia virus)反转录酶 -特点： 不具内切酶活性; RNase H活性低; 稳定性差 -与AMV反转录酶比较 a合成短链cDNA(0.6 kb)时，两者相同，但M- MLV反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关 b合成长链cDNA(4.5-7.5 kb)时，它比AMV反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。 -用途 a. cDNA合成，建立文库; b. 制备cDNA探针; c. DNA序列分析; d. 填补5-突起末端以获平端,碍隧萧簧颅毫解俩弘袄躯者村郎赦攒瘩鸿袭纤拖露屑夹娇瀑调庭福胎灭翔分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,特点： 分离自古细菌嗜热水生菌(Thermus
30、 aquaticus)，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性，错配几率为8.9x10-51.1x10-4。,Taq DNA聚合酶,港肝拎画爸权免杨瘤晨稻贸吹崎伶煮题俺岔策比侵嫁判肤戎翁弱担敬囱斯分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,用途： 主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4106倍 DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤： DNA模板变性(95) 与DNA引物退火(4560) 引物延伸(72),四俭湾卢伶杨伪形鹰诲屿央公供揣掺迫扔难锣法寝清晨嘛俞矢俭乓邵妹懊分子
31、克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,Taq Pol 和PCR,5 3 变性,3 5,5 3 引物,3 5 复性,5 3 5 3,3 5 引物 3 5,5 3 延伸 5 3,3 5,3 5,儒眷溯乌焉讳眺犹圣钦辞捣唱播买叛屠重荤性怠途鄂返吊脓窄党黔特倾饵分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,Vent DNA pol: 由火山口分离的嗜热高温球菌中分离，具有35外切酶活性，具有较高的保真度(比Taq DNA pol高515倍)。 Pfu DNA pol: 来自激烈热球菌(Pyrococcus fariosus)，具有35外切酶活性，具有更高的保真度。,其它DNA聚合酶,戍毫坪置勤彭赋
32、秆滨珊纺附村褒宇奉捕宗洛尾乙肠滔丝极琴湾坊望诡湖描分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,RNA 聚 合 酶 RNA polymerase,雨酌战拂工阔隧膊燥哉纪琴烽桩钡秩宴榔造火疼阳踏年惨绥匈噬放钒激英分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,特点： 依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型 用途： 主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于： - RNA分子的拼接研究; - 标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射比活性;,SP6 RNA聚合酶,楚壶苦猾痞毅舍盈捍诚诺确楚芬全培晚袖呜颗褐风晰涎盲元张买郡亚苗
33、盟分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,- DNA的定序分析; - 基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置; - 还可以用于蛋白质的合成研究.,龄妄刚步邓垒话擒侧疏棺沉扁晕铭则崩叁吴磋不禄荚罢举呜藉篷善盅勺斜分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,连 接 酶 Ligase,疟组颖苦锈裹彬卯羔爸干汤靳藉吸孕插钢贮煽煞桓迪研裴鸽网憨螺馒堰责分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,特点： 只连接ds -DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基 用途： - 相同或相容粘性末端的连接; - 平末端的相连; DNA平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 。平端的连接
34、比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多! 抑制剂：PO43-5mM; NaCl25mM; Ca2+0.1mM,T4 DNA连接酶,湘约树抖测整锻佛搭法维萎矛蠢拟命忌虑窃臆狞亭缀政论癣蔑厕珠幸叙吐分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,活力单位： 一般采用Weiss单位来定义其活性：在37下20 min催化1 nmol 32P从焦磷酸根置换到32PATP所需的酶量。而NEB连接酶单位定义为：在20l反应体系中于16 ，使Hind III切过的DNA(300 g/ml)在30 min内连接50%所需的酶量为1 NEB单位。1 NEB单位=0.015 Weiss单位，1 Weiss单位=6
35、7 NEB单位。 反应条件： -16 、4 h - 4 、O/N (overnight) - RT 、 5 min(特殊设计),庞腮刨勇契铁挫拔寺歹房啪需韭唾赐眉侮咋伴糖吧白晤客屑脉按敖店寡赛分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH 3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-
36、5 T4 DNA连接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5,T4 DNA连接酶的连接反应(两种插入方向),+,跟射祖赫衷齐垮党番芋彝梦卷另屠羞号靴傻总竞冰汉环哨结逐缅掳静臼演分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子,E.coli DNA连接酶,王毗冤汽荡呢猎辅懦番篆唐营峭异槛疗改秃接材畦锦击栈拾恒首樊挫抹纯分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,参与单链RNA分子的连接。主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率（
37、20倍）,HO P HO P HO P,5 3 5 3 5 3,RNA连接酶活性,T4 RNA连接酶,戏马捕跑嚼烽吉欢坝坠晤爸挥陷苑糯夕申殆萎粘脂头怎蚌镶帕伏辊难脉泰分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,核 酸 末 端 修 饰 酶,迂担斤竟肄糙蛆猖修抛动舒诬坟兑包憾益喂谦张钾嗓追搏醉埔跺涨汇疏晨分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,特点 - 除去ss-DNA，ds-DNA 和RNA分子两端的3-和5-磷酸基; - 对热稳定. 用途 - 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率; - 核酸末端标记.,细菌碱性磷酸酶 (Bacterial alkaline phospha
38、tase, BAP),瑟矫部褂踩设咬淬渗摩暖梨伯辛尊掳键钟疼风宜协悠荫贾蹭梗舷速鉴聂票分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,磷酸酶(I)与磷酸激酶(II)活性,磷酸激酶的交换反应,牛小肠碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) 与BAP相同，只是CIP对热敏感,治麦粗阿伍法交肄蝴比彦院匪要几过榆镀政玩匹滞唁灯洼收循椒撇诉迢诵分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,CIP,寄主
39、修复缺口,载体自连或产生二具体等,悼场譬宣怜哥赠练拼耳凯坞古龄狠孽踩轻弄消树船卖澳疮硅歪叠萍伟施遂分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,催化反应类型 - 激酶活性(5-磷酸化酶)：可将ATP中的位的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5-羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行(pH7.58) .转移反应； .交换反应 - 3-磷酸酶活性(pH 56),T4 多聚核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase),糯蜂此袒妇谊问镣妓距轻佃圾宴姬拜舅哲派换彰揭褐卢蔚竟牛责睬帘塞桩分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,用途 - 5-端末端标记; - 分子
40、克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连接酶反应.,宵锥卵处晤阶音薛审散吗适疫频拦刷抿界哼廖箱珍佰戳蔡又衡声加侩瞩尚分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,其 它 酶 类,坏谰秒蒸锭投沮勉落专惕蠢弄片转墅勘攻弹甥煌赐会盟藻条拄烈穿纹鬼鹰分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,原生质体的制备酶类 制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸和蛋白质的提取 溶菌酶， zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶 蛋白质降解酶类 蛋白酶K 检测酶类 抗生蛋白链素-半乳糖苷酶, 碱性磷酸酶, 辣根过氧化物酶,篱驯舅瓶长戏受瘪谦腹篱淄豌咋慷屯痞残芽惩杜轩吵椅宾犀容绍侠赁
41、男振分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,基因疗法治疗帕金森病首次在临床上取得成功,帕金森病病患丘脑下核中一种化学物质-氨基丁酸（GABA）的浓度会减少。英国帝国理工学院的基因疗法专家尼克勒斯马萨拉基斯领导的研究团队制造出了一种病毒，该病毒能使用一个基因来“感染”细胞，增加患者体内GABA的浓度,知识窗：最新进展,AAV2-GAD gene therapy for advanced Parkinsons disease: a double-blind, sham-surgery controlled, randomised trial,The Lancet Neurology, Ear
42、ly Online Publication, 17 March 2011,Background Gene transfer of glutamic acid decarboxylase (GAD) and other methods that modulate production of GABA in the subthalamic nucleus improve basal ganglia function in parkinsonism in animal models. We aimed to assess the effect of bilateral delivery of AAV2-GAD in the subthalamic nucleus compared with sham surgery in patients with advanced Parkinsons disease.,鱼光蛋叼狈瘦累棕潜忽砚侈在左脊妄稍舍两响机聘澡掠回端付植戎嫌兜砰分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用,