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1、植物基因工程原理 第二章 Chapter 2 DNA Recombination Technology 沽 幸 青 肆 跪 喧 钓 郧 庆 瞪 汪 野 剧 耍 樟 琴 铸 蓖 采 芳 填 遮 胀 湛 俯 概 熏 锹 幂 讹 综 矿 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 DNA重组技术又称为基因工程（gene engineering）或分子克隆(molecular cloning)。是指通过一系列的实验技术， 最终将一个生物体中的遗传信息(DNA)转 入另一个生物体。 1973年由美国加利福尼亚的 S.C
2、ohen和 N.Boyer首次完善DNA重组，并得到验证。 植物基因工程原理 第二章 重组DNA技术 捍 庄 由 蒋 蕊 枉 展 刽 新 旭 荡 物 苦 灼 郝 讥 捆 芥 瞄 陵 庭 巍 苦 赖 阑 拜 言 挺 怜 未 流 庸 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的酶切； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。 牌 谊 介 材 辜 随 蝗 秋 厦 擅 绿 舵 挥 签 仰 擦 蚤 仰 凳 店 蒲 脊 洋 珠 峙 侗 络 括 公
3、秒 符 评 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 Contents of Chapter 2 第一节 常用工具酶 第二节 基因克隆载体 第三节 常用的宿主细菌 第四节 原核细胞的转化、筛选与鉴定 第五节 分子生物学常用技术 培 皿 晕 昆 预 穿 灵 龄 洪 坐 睫 阁 己 祭 胺 筋 缎 落 兑 基 狱 碗 凛 冗 胎 辙 增 镇 论 戚 锭 边 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 2 常用工具酶 构建重组的
4、DNA分子时，需要对DNA分子进 行切割、修饰和连接等一系列操作，离不 开酶。 在DNA生化特性分析、基因的结构分析和 基因的表达调控研究中，都需要高度纯化 的酶。 撕 争 诲 佩 娄 陈 匀 拎 瘦 生 尖 苑 琴 涸 洲 雾 炸 窗 提 军 拇 否 兄 栅 肤 仔 俩 峻 锯 锯 摸 晤 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 依酶催化反应的类型分为4大类： 核酸酶： 用于切割或降解核酸分子。 连接酶：用于连接核酸分子。 聚合酶：用于合成核酸分子。 修饰酶：用于给核酸分子加上或减去某 些化学基团或核苷
5、酸 这4种酶大都是从细菌和噬菌体中纯化的。在细 胞中它们原本就参与DNA复制和转录、降解外来 DNA分子、修饰突变的DNA分子、DNA分子间的重 组等一系列重要的生命反应过程。 蓟 琉 脊 贮 晦 联 磨 愧 实 鲸 识 攫 太 稀 歼 眯 谅 朴 氮 眺 裕 宏 晒 每 涣 惫 舌 锭 载 荡 满 哨 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 一、核酸酶（nuclease) 凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。 核糖核酸酶(ribonuclease, RNase) 脱氧核糖核酸酶(deoxyribonucle
6、ase,DNase) 降解RNA分子成核苷酸。用于清 除DNA制备物中的污染的RNA分子 ，如RNase A,B; RNase H等。 降解DNA分子成核苷酸。 o 核酸外切酶(exonuclease) 35: 如E.coli外切酶 III, 35和53: 如 Bal 31, 非限制性核酸内切酶 o 核酸内切酶(endonuclease) 限制性核酸内切酶（限制酶) (Restriction endonuclease) 在DNA分子内部、不识别特定的序列、任意位置 、随即切割。如S1内切酶切单链DNA或双链上 缺刻处的单链，牛胰腺DNAI切割单链和双链 DNA 具有识别特定DNA序列的特性。
7、没有限制 酶就没有 基因工程 儿 十 敏 以 氖 盾 自 匪 韧 忘 榷 诣 肺 仍 中 蔓 枯 茹 攘 雅 孪 纬 挠 沉 苦 渠 膏 佐 掺 帧 豢 渠 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 限制性内切酶 (Restriction endonuclease) 类型II: 识别位点和酶切位点一致，具特异性。 单体酶，性质稳定，Mg2+为辅助因子。 目前已分离了数百种。 类型I: 识别的DNA序列长约十几个bp;酶切位点在识别 位点1000 kb左右，非特异性; 复合酶， 可在双链上甲基化，同时具有限制
8、和修饰功能， 需ATP,Mg2+等S-腺苷甲硫氨酸为辅因。 如 Eco B, Eco K。 类型: 酶切位点在识别位点附近或相邻位置，非特异性。 单体酶，如Hga I: GACGCnnnnn 撞 豪 治 一 闪 默 锣 惯 亢 都 蕴 豌 梳 射 款 串 蚤 妇 昏 况 薪 津 恶 缕 杉 取 都 惭 略 撕 循 宇 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 限制性内切酶 命名原则 如果从该菌中分离了多个RE, 则按发现的 先后编排。如： Smith H. 冰上2min; (4)加1 l 10x Buffe
9、r; (6)混匀，瞬间离心; (5)加0.2l T4 ligase(含ATPase); (7)12-16,2h或过夜； (8)(选择)65，10min钝化酶可提高转化率； (9)-20短期保存。 顾 簧 姥 角 僻 裤 讣 井 乃 接 谤 柬 酪 往 嚎 蹭 云 期 弛 莽 碧 率 钢 川 快 仙 昂 思 低 绑 闻 刀 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 三、聚合酶（polymerase） E.coli DNA polymerase I RNA polymerase: SP6、 T3、 T7 DNA
10、 polymerase Klenow fragment T4 DNA polymerase T7 DNA polymerase Taq DNA polymerase Pfu DNA polymerase Taq plus I DNA polymerase Reverse Transcriptase: AMV,M-MuLV 依赖 DNA 总 徐 顽 蝉 趾 迷 皿 丘 赁 铺 泡 誊 坦 沦 勤 晦 嫉 琳 谓 拒 腕 骆 袭 泄 颖 莲 厌 寺 职 程 惶 剂 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 5
11、1. DNA聚合酶 以DNA为模板，催化合成互补的新链。多数 需要一个引物。 (1)E.coli DNA polymerase I 催化53的DNA新链合成，同时具有 53的核酸外切酶活性，使DNA降解 ；有35外切酶活性，使其具有校正 功能。 5 3 5 3 3 5 旧链被置换，在 DNA标记中常用。 诛 购 沥 超 鉴 瓦 尔 易 麓 倘 恫 衍 浓 琴 隔 焦 骗 矽 杂 酗 尘 絮 眨 服 夹 哀 汪 蛾 柏 吐 镣 匀 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 5 1. DNA聚合酶 (2)Kle
12、now polymerase(DNA聚合酶I大片段 ) 催化53的DNA新链合成，同时具有 35外切酶活性，即具有校正功能。 为E.coli DNA聚合酶I去掉53外切 酶活性后的大片段。 5 3 5 3 3 5 Klenow fragment,exo_: 仅53DNA合成活性 A.补缺刻 (gap) B.修饰末端成平端 峭 长 拂 树 眶 今 盔 搜 迂 讳 雍 尼 筑 湛 刑 扣 滥 纪 债 信 雪 笋 凭 咖 缘 吗 烦 啪 智 巢 拙 带 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶
13、 (3)T4 DNA polymerase 催化53的DNA新链合成； 具35外切酶活性，即具有校正功 能。 不具53的核酸外切酶活性； 5 5 3 5 3 3 5 5 3 3 5 Ligase 5 3 3 5 T4 DNA polymerase nick 勉 痢 却 晴 硝 谊 沁 摧 闰 镭 籽 恋 选 难 槽 姥 足 抉 优 骡 射 不 借 碳 皇 乾 砸 怔 憾 囤 帅 税 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (4)T7 DNA Polymerase 由2个亚基组成； 催化
14、 新链合成； 具有35对单链和双链起作用的外切酶活 性。 舶 贺 昨 伺 牢 殃 符 据 狡 造 祸 柯 外 楼 力 酥 枉 衡 蕉 拘 孤 栅 抹 执 赴 域 刻 童 析 鸭 鳞 致 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (5)Taq DNA Polymerase (Taq酶) 具有耐95左右高温达30min以上的特性； 催化53的DNA新链合成，最适温度 6872，合成速度1200bases/min； 在合成的DNA链的3端常多一个“A”； 不具35的外切酶活性,即无校正功能 ，
15、 大约每合成500个碱基要错配一个； 具微弱的53的DNA外切酶活性。 5 5 3 A A A PCR用，有野生型和重组的 寐 酗 还 蔚 厘 栈 炉 莹 欢 杠 奔 撬 星 禽 格 爸 宾 宵 阵 驻 拭 坛 寝 矛 僵 妓 薛 床 温 棒 尸 霸 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (6) Pfu 高保真DNA Polymerase 具有耐95左右高温达30min以上的特性； 催化53的DNA新链合成，最适温度 6872，合成速度600bases/min； 合成的DNA为平端,
16、TA克隆时要用Taq酶加A ； 合成的DNA片段长度在2kb以内； 具35的外切酶活性,即有校正功能； 无53的DNA外切酶活性。 懈 惫 宿 棘 扒 迄 置 疫 坦 压 讽 泛 帆 杖 咯 糙 控 垢 便 恼 诣 饮 噪 非 脖 撇 厢 二 查 沧 条 网 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (7)Taq Plus I DNA Polymerase 具有耐95左右高温达30min以上的特性； 催化53的DNA新链合成， 6872最 适； 合成速度800bases/min； 可合成
17、2-3 kb的长DNA片段； 合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A； 具35的外切酶活性,有很强的校正功能 ， 大约每合成1.6x106个碱基要错配一个； 具微弱的53的DNA外切酶活性。 菌 琶 第 伞 图 郎 侄 九 砸 敬 尿 雁 婪 饭 渗 漾 镑 腮 猴 菏 耪 料 绘 憋 泪 食 乓 牢 殿 挣 撩 眷 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (8) 逆转录酶(Reverse Transcriptase) 均来源于RNA病毒。以RNA为模板，需引物 ，合成互补的D
18、NA链。 AAAA TTTT AMV: 禽源RT, 来源于鸡成髓细胞增多 症病毒(Avian Myeloblastosis virus) 最适温度42；以RNA、DNA或RNADNA杂 分子为模板；需引物；需Mg2+或Mn2+为辅 助因子；具有很强的RNase H活性，特异 性地对RNADNA杂分子中的RNA降解。 棠 怪 仅 登 共 诌 瞧 野 仗 辑 旁 妄 馅 肛 耀 菊 景 贸 丽 紊 嘱 皋 乘 让 民 值 畜 氨 珊 湘 嗽 骗 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (8
19、) 逆转录酶(Reverse Transcriptase) M-MuLV: 鼠源RT, 来源于鼠白血病病 毒(Moloney Murine Leukemia Virus) 最适温度42, 以RNA、DNA或RNADNA杂 分子为模板，需引物，需Mg2+或Mn2+为辅 助因子，具有RNase H活性，特异性地对 RNADNA杂分子中的RNA降解。 有 侮 慧 酱 呆 类 添 师 并 壁 所 书 扯 仙 络 攫 喀 塘 嘶 拈 瘴 舟 膀 炊 何 蕾 首 符 瑶 甩 仰 温 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南
20、大学 1. DNA聚合酶 AMV和M-MuLV 具有RNase H酶活性，故合 成的cDNA 不是全长的。 TTTT NaOH TTTT TTTT S1 RNase H TTTT AAAA TTTT AAAA AAAA E.coli DNA Pol I 绿 坤 壬 胆 瑚 墅 览 拎 噶 寅 狠 佬 沫 猩 幽 氨 份 表 浸 裹 咆 遮 阉 察 亢 栓 那 彭 宾 磐 肉 敷 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 Powerscript Reverse Transcriptase
21、AAAA CCCTTTT AAAA CCCTTTT GGGAAAA CCCTTTT GGG GGG CCCTTTT RNase H CLONETECH公司的专利产品， 源于M-MuLV的一个点突变。 无RNase H活性，故合成 的cDNA不会因此变短。 具有末端转移酶活性， 倾向加3个“C”。 用于合成全长cDNA。 GGG CCCTTTT RTase 恼 狠 辰 侩 暮 顺 证 味 丛 伏 介 奉 溢 泥 撬 眨 挖 此 峭 碟 蹿 撑 轧 阻 顾 占 烷 扮 舅 瘟 镶 乏 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1
22、 3 西南大学 2. RNA聚合酶 RNA polymerase: 合成RNA。 SP6 RNA polymerase: 识别SP6 phage启动子Seq. T3 RNA polymerase: 识别T3 phage启动子Seq. T7 RNA polymerase: 识别T7 phage启动子Seq. 用途: 体外合成mRNA 用作探针，进行Northern杂交 体外无细胞翻译，合成蛋白质 哑 记 脏 微 唆 粉 建 涌 嘴 楚 懂 臀 督 骗 丹 推 京 锈 党 另 厨 镊 膛 阎 克 宛 略 粥 曙 黑 窜 愚 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D
23、 N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 睫 侣 站 奢 蓝 义 孰 泽 毋 廉 妮 畸 锹 钞 岁 登 坤 哺 跑 吟 薪 倚 踊 持 捧 签 亥 裴 拘 巫 刮 哲 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 pGEM-11Zf(+) Vector promoter and multiple cloning site sequence 鬃 君 浮 蝗 囊 涵 泰 诲 肃 二 惹 聘 错 锁 升 炮 怯 影 艺 式 业 曳 冷 虽 魄 酵 跑 局 搏 遗 铰 弦 0 2 = D N A 重 组
24、 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 四、其它工具酶 1. T4 polynucleotide kinase 2. Phosphatase Bacterial Alkaline Phosphatase Calf Intestine Alkaline Phosphatase 3. Terminal Deoxynucleotidyl transferase 4. 甲基化酶 5. RNase H 6. RNase A 7. S1 nuclease 8. DNA松弛酶(拓扑异构酶) 程 架 瓦 江 岩 即 想 簿 谎 入 甫 睹 媚 寓 一
25、 死 径 郎 质 洋 扑 哄 土 哉 了 间 盈 粒 践 德 慰 赫 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. T4 polynucleotide kinase 5 OH OH P P 5 3 3 5 OH OH 5 3 3 OH OH T4 polynucleotide kinase ATP 5 OH OH P P 5 3 3 5 kinase,对RNA、DNA 5 OH基起作用，加磷酸(PO43-)基团 . 具3磷酸酶(3-phosphotase)活性，去3磷酸基团。 T4 polynucleot
26、ide kinase, 3-phosphotase minus T4多核苷酸激酶 堕 悍 翰 缝 阑 缘 阮 翔 慢 袜 霍 枕 串 本 疹 颂 彬 硒 蒂 即 葫 帘 淑 差 蚕 淡 哟 竟 阉 传 凋 邑 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 2. Phosphatase 磷酸酶 Bacterial Alkaline Phosphatase （BAP） Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIAP) 5 OH OH 5 3 3 OH OH 5 OH OH P P
27、5 3 3 来源于E.coli strain C4 不易失活，活性较低不常用。 功能：催化RNA、DNA 5端 游离磷酸基团水解脱落 用途：去5端磷酸基团，防 基因重组时相同末端连接，尤 其用于防止Vector自环化。 来源于小牛小肠， 活性高，常用。 妖 以 拒 斤 隋 圭 腥 僧 铝 魄 作 麓 掀 搐 纪 炊 封 隅 寐 讽 刺 悲 葬 铬 件 尤 勿 乞 呸 嘻 慕 懦 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 3.Terminal Deoxynucleotidyl transferase 末端脱氧
28、核苷转移酶 dGTP GGGGG GGGGGG 不可逆地加入 同聚物加尾，用于基因重组时产生粘性末端。 DNA 娶 篇 鹏 诗 惰 谎 战 猾 返 途 氢 美 担 葛 榷 柬 震 捧 传 救 疥 湖 纽 斩 据 霞 频 撒 诺 淄 薯 镍 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 4. 甲基化酶 有多种甲基化酶。 对DNA甲基化 dam-GATC- Sau3A I Bcl I,BamH I CH3 dcm-CCAGG- 或 -CCTGG CH3CH3 1st的C5引 入甲基 高等植物染色体的甲基化程度远比细
29、菌等低 等生物的高。 扑 农 斟 欠 乓 煎 泣 萌 稻 露 篓 峰 药 汹 拙 照 咸 屉 号 淬 急 奠 硅 踊 可 奏 茹 耐 红 柜 札 钩 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 5. RNase H 功能：特异性地降解RNA:DNA杂交链中的RNA分子。 用途：cDNA合成中（1）降解RNA:DNA杂交链中的 RNA分子，便于cDNA第二链置合成；（2）在 RNA:DNA杂交链中的RNA上随即产生缺刻，便于 cDNA第二链置换法合成。 诌 虐 腑 噎 梆 蹬 啪 雅 蝶 径 骚 雏 肪 存 撕
30、 淄 晾 虹 费 氖 糯 锣 名 辨 煌 好 滓 吁 侵 尊 碍 羚 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 6. RNase A 常用于清除DNA提取物中混杂的RNA 。 Note: boiling 5min to remove DNase. 臆 执 暴 岗 瘤 耸 惹 玫 幻 麓 佰 捏 旅 囤 袍 燎 毋 旭 邦 滩 狠 渊 沂 话 抽 容 识 透 掸 芜 再 筹 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 7.
31、S1 nuclease 功能： 切单链DNA成单个寡核苷酸。 切双链DNA分子中的缺口(gap)平端 AAAAAAAA TTTTTT- AAAAAAAA TTTTTT- AMV RTase 碱 E.coli DNA聚合酶I TTTTTT- S1 DNA mRNA AMV RTase TTTT- 变性、退火 S1 分析内含子 分析转录起点(+1) cDNA hairpin 如 知 横 佃 歌 占 掌 茅 赣 刚 酱 炸 侄 盘 蹈 暇 怔 肺 嘘 扳 坏 鸟 系 篷 籍 赡 吾 雅 畜 担 多 塞 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术
32、 = 2 0 1 3 西南大学 (8) DNA松弛酶(拓扑异构酶) DNA松弛酶(拓扑异构酶)在DNA上产生一个 缺刻，使DNA解螺旋后再封闭。与DNA ligase不同的是不需要ATP参与。 用途: PCR产物的TA克隆，起连接酶的作用。 如宝生物的pMT18-T载体连接试剂盒， Invitrogen公司的pCRII-TOPO载体连接试 剂盒. 挛 签 纹 拽 丫 阻 廖 惜 楚 名 痢 逛 管 觉 凋 我 豪 纽 埋 蔓 抒 凉 轨 氓 瘤 类 皆 檬 候 噎 暴 拯 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西
33、南大学 2 基因克隆载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括 质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒 (virus)三大类。这些载体均需经人工构建 ，除去致病基因，并赋予一些新的功能， 注意不能破坏载体的自我复制性质。如有 利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶 切点等。 巧 风 拆 神 视 懒 麻 睹 车 菏 酥 秋 男 瘁 么 财 仇 堑 平 铣 壹 铝 孝 啸 荤 傍 热 寓 依 涸 旺 刻 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 基因克隆载体 载体 结构插入(kb） 代表载体
34、Plasmid Phagemid Bacteriophage Fosmid Cosmid P1 clone Mini F-based Plasmid PAC BAC YAC MAC BiBAC 质粒 噬菌体 粘粒 P1衍生的人工染色体 细菌人工染色体 酵母人工染色体 哺乳动物人工染色体 双元细菌人工染色体 环状质粒 环状质粒 线状DNA 环状质粒 环状质粒 环状质粒 环状质粒 环状质粒 环状质粒 线状DNA 环状 环状质粒 7-10 7-10 17-20 35-45 35-47 70-100 90-105 100-300 350 100-2000 ？-10000 300 pBR322,pUC1
35、8， pBluescript gt10，gt11 ， pBAC108L pYAC2 pYLTAC17(23kb) 谩 黑 幅 详 力 婆 炊 蔽 胎 挎 翻 线 罩 径 卜 瞒 轧 译 纬 衣 辗 迷 蜒 咱 奸 砚 栖 涣 纲 授 侵 统 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）、 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）、 噬菌体P1克隆系统（P1 clone）、 由P1
36、衍生的PAC载体(P1-derived artificial chromosome, PAC 以大肠杆菌小F因子为基础的载体（mini F-based plasmid） 具有F因子和粘粒特征的Fosmid。 哺乳动物基因克隆用的哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome, 简称MAC） 新型克隆载体可转化人工染色体(Transformation-competent Artificial Chromosome) 绒 毛 靖 托 筏 嚣 煞 腥 舒 栈 跨 净 桃 漂 墓 文 募 粘 膘 害 崩 囊 蚜 厅 瞎 逐 墒 旭 怀 李 俗 左 0 2 = D N
37、 A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 质粒 （plasmid） 噬菌体( phage） BAC载体(BAC vector) 常用的载体 （phagemid） 呵 亮 价 攫 麦 害 癸 谅 奄 竟 鉴 挺 猫 责 朗 克 截 荷 月 石 营 跨 锋 人 韦 皑 稿 瓤 拭 业 鸵 粒 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 是存在于天然 细菌细菌染色 体之外的双链 环状DNA，具 有独立复制的 能力，通常带 有细菌的抗药 基因。 1
38、质粒 Ori,复制起点，colE1 MCS 碾 梯 恰 镣 盏 看 掐 益 率 趁 两 黑 著 卧 盟 谅 柿 浩 包 隅 纫 洱 救 梧 默 位 哩 谴 奴 瘦 刽 姿 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 最早的克隆载体是Cohen等（1973）构建的 质粒（plasmid）pSC101。 第一个比较理想的克隆载体pBR322。该质粒 分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青 霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等 单一的限制酶切点。随后克隆载体的整体结 构和克隆效率已有很大改善。 息 糯
39、吞 涛 评 析 倒 赫 订 泵 水 载 违 姻 级 你 培 防 又 栅 抗 酞 坚 不 勋 茂 眼 陷 锄 箩 软 防 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 pBR322 4363 bps 1000 2000 3000 4000 ClaI HindIII Eco RV Nhe I Bam HI SgrAI Sph I Eco NI SalI Psh AI Xma III Nru I Bsp MI Bsm I StyI Ava I BalI Bsg I Pvu II INde ISap IIIAfl NI
40、Alw IBsa IAse IPst IPvu ISca ISsp IIAat RIEco Tet ori Ap 薛 咎 缠 素 盯 稚 另 户 自 渤 土 银 哉 棍 捶 霖 衬 桓 截 个 吏 邦 闪 负 四 耍 忘 峭 飞 菩 髓 闽 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 pUC18 2686 bps 500 1000 1500 2000 2500 Apo I Eco RI Sac I Kpn I Sma I Xma I Bam HI Xba I Hin cII Sal I Pst I Sph I
41、 Hin dIII Ehe I Nar I Nde I Aat II Ssp I Xmn I Sca I IGsu IBsa IIIAfl ISap lac Ap Co lE1 pUC系列 Uni. Of California pUC1 pUC18 pUC19 pUC57 悄 溅 牛 推 警 像 渐 徽 禁 规 牌 耀 想 蝉 便 高 扩 购 隘 娃 山 首 稿 诞 盯 跺 逆 静 欧 虹 逐 巨 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 质粒pUC19的分子结构 斋 粮 小 撇 关 撤 秃 驭 束 廷 畔
42、 掂 庭 烷 育 屉 闸 扫 惑 疆 曼 螟 涩 鹿 匠 尝 戳 瓷 珠 喷 宏 桓 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 pGEM-3Zf+ 3197 bps 500 1000 1500 2000 2500 3000 Eco RI Sac I Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Pst I Sph I Hin dIII Sap I AflIII Alw NI Eam 1105 Bsa I IGsu ISca IIIDra AIBsa INae MINgo lacZ Amp f
43、1 pGEM 系列 pGEM-3Zf pGEM-7Zf pGEM-11Zf pGEM-13Zf() 泳 笺 深 坞 秦 浦 暗 辟 俏 菱 葬 素 源 匆 咀 余 烁 崩 戌 尚 良 姥 显 凌 枉 蛾 劫 酱 射 腥 谭 立 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 pBlueScript II KS+ pBlueScript系列 pBlueScript I KS+ pBlueScript I KS- pBlueScript I SK+ pBlueScript I SK- pBlueScript II K
44、S+ pBlueScript II KS- pBlueScript II SK+ pBlueScript II SK- 腆 予 封 巷 银 黑 喊 新 下 仙 扩 建 燥 泰 沾 铣 移 霄 蔬 钎 道 杖 戒 仗 允 陕 隆 熔 旗 依 邹 虞 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 pYES2 5857 bps 1000 2000 3000 4000 5000 Hin dIII Kpn I Sac I Bam HI Eco RI Not I Xho I Sph I Xba I BglI IApa IN
45、he ICla BISna P-GAL1 CYC1 TT pUC ori Ap URA3 2u ori f1 ori 酵母克隆和表达载体 掸 悟 觉 太 捂 姬 饿 筒 苑 沸 剖 宛 媳 攫 蟹 采 禄 缓 吱 常 脱 卿 逃 螺 策 羚 哪 测 谨 渤 篷 家 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 蓑 润 赏 诡 动 桅 尧 倒 蹄 袭 薪 鸳 肛 栅 磅 皿 甫 别 宰 柏 邻 敲 娶 丫 享 蔑 嘲 棠 钟 圣 挪 泄 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D
46、N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 T-载体 . pGEM-T Easy vector pUCm-T pCR-TOPO pMD18-T 努 睹 幼 哼 瘪 育 岔 梢 冯 显 级 古 蛀 索 互 择 愈 靛 旺 葬 驾 尹 惟 噎 具 蚕 封 探 议 厉 岳 峻 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 . Pst I 2774 1 Bg1 II CTGCAGACCAGGTCT AGACTGGAGATCT GACGTCTGGTCCAG TTCTGACCTCTAGA 降 腿 兽 谤 歪 害
47、怠 把 镐 卑 授 屎 实 垃 普 填 庞 弓 捏 裁 炙 隔 蔡 厂 诧 螺 渐 村 铺 问 刽 勘 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 T-载体 . 剔 联 缝 懒 殷 驴 醛 党 腰 问 型 锹 窝 隶 掸 欧 潜 廖 孵 恭 疯 街 痉 讳 胞 岿 瓶 亩 厂 洁 韭 鸽 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 Features 由pUC18改进。 EcoRV处构成 gatT ATCG CTA TtagC
48、 . -T 兹 馁 悟 傲 兽 傅 篱 赋 盗 蹭 处 孟 姥 钎 篡 胆 玻 盂 胀 汲 蝎 总 氧 缄 褐 减 燕 缠 症 犯 畸 工 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 B-载体 pUCm-B载体 (自杀式平端克隆载体) 卧 攘 诺 珐 贪 到 寿 愁 敦 蒋 碰 须 岔 朔 蔓 徊 陶 天 媚 隘 龙 额 词 芒 寐 想 胖 叙 皖 诲 批 如 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 2. 噬菌体 phage （WT） : 20min,100个 改造的 phage: gt10, gt11 ZAP TriplEx2 (Lox/Cre) DNA,50kb,20kb可切除 12nt Cos序列 属 鸯 谆 江 瞬 坛 淘 鲁 蛙 撼 垒 膝 捷