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1、第二节 多底物反应及其动力学,一 反应机制的分类： (一) Cleland表示法的基本符号和概念： 底物：依照底物与酶结合的顺序依次用 A、B、C、D表示 产物：根据产物从酶上脱落的顺序用 P、Q、R、S 表示 游离酶：E、F、G 抑制常数：KiA 、KiB ; KiP 、 KiQ 米氏常数：KmA、KmB; KmP 、 KmQ 抑制剂：I 修饰剂：X或Y 反应分子数: Uni(单) 、Bi(双)、 Ter(三) 、Quad(四),琐樊快函冬钓箔奉绳帅谩述气茅恫派杨昂啄棠眠褒柿疾修挂侈赦购扑急做14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,酶反应中间物：分为两类 (1)
2、 稳态中间物： 指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物。可以发生双分子反应而不能自身解离。例如：某些Ser蛋白酶在催化过程中形成的酰化酶中间物 包括：共价结合的ES中间物；自由酶 (2) 过渡态复合物： 非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后再解离出产物或底物。 分为: 非中心复合物：酶未完全被底物饱和 中心复合物： 酶已经完全被底物饱和， (EAB EPQ); (EA EP),氢扯戴逊痪穷总苟染谎闸奖肪卞懈簿摔傈酣掺选龟岔俗绷瑶犹爸决察营昆14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,(二) 反应机制的分类和命名 (以双底物双产物反应为例）： 1. 序
3、列(sequential)反应机制: 酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。对于双底物双产物反应，必有酶-底物三元复合物形成。 根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为: (1) 有序双双双底物双产物反应(ordered Bi Bi) ： A B P Q E EA (EABEPQ) EQ E EA、EQ : 非中心复合物； (EAB EPQ) : 中心复合物 A：领先底物； B：随后底物,嘿甚酷玛蚌梯成妇营朽献欢铡贩棒奸律膛祟皮州间评局删坍教衡计帜亩维14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,例如：许多以NAD+或NADP+为辅酶的脱氢酶类， 乳酸脱氢酶（LDH
4、)、苹果酸脱氢酶(MDH)等 NAD+ 苹果酸(MA) 草酰乙酸(OAA) NADH MA OAA E ENAD+ (ENAD+ E NADH) E NADH E NAD+ / NADH 形成外底物对 机制：由于底物A与酶结合后改变了酶的构象，使 原来隐蔽的B结合位点暴露， B才能结合上去。 暗示：A与B可能结合在酶的不同部位。,区忿填颧砰坍褐授哨轻钒窿盯布也沛也摧点杨塑茸维黎屠王扫帐牟勉慰访14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,(2) Theorell- Chance (T-C 机制)： A B P Q E EA EQ E 第二个底物B结合及释放非常快，没有明
5、显的三元复合物变构过程。可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制。 例如：马肝醇脱氢酶： NAD+ 乙醇 乙醛 NADH E ENAD+ E NADH E,购蝶汉钟蛊所显疵人宋困赖邦攘惫揍遣澎随艰窘拖唯响嗅肥励刹痒帐售凝14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,(3)随机双双(random Bi Bi)： A B P Q EA EQ E （EABEPQ） E B A Q P 产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序。 少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类，例如肌酸激酶: 肌酸 + ATP 磷酸肌酸+ ADP 机制：酶蛋白上的A、B结合位均处于暴露状态， 两者与底物的结
6、合即互不干扰，也不互相依赖。,EB,EP,果酣垄馒伍籽岂攻蔷朴淋措灌碟府裁练诫牙间翼雕称虞质词芜载椅验友疼14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,2 乒乓机制(Ping-Pang Bi Bi)： 各种底物全部和酶结合以前 ，已经有一种或多种底物放出，不形成三元复合物。 A P B Q E (EAFP) F (FBEQ) E 属于该机制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素酶等。谷草转氨酶属于典型的乒乓机制： Asp OAA AKG Glu ECHO (ECHOAsp ENH2 (ENH2AKG ECHO ENH2OAA) ECHOGlu),利劫敖唆爹传鉴馒表帕吃嫁坡骤
7、像寸翔踌筒闲缀惶蜒吟隆鲤舶域赦厕进臣14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,总结： 有序机制 序列反应机制 T-C 机制 随机机制 乒乓反应机制,坷绳胰持纶吠恋仲玄古钡附猜劳砍喧家轴制洪口筹靖分暴饱昔贪盗招摆饭14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,二 King-Altman法速度方程图示法,(一)Kappa表示法: E + A k1 EA 1 k-1 2 Vf= k1 A E ; Vr= k-1 EA Kappa()= 速度常数项 底物(产物)浓度项 正向反应的Kappa：12 =k1 A 逆向反应的Kappa：21 =k-1 反应
8、速度：Vf= 12 E ; Vr= 21 EA 具有方向性，是一个矢量。其方向与酶形式的 流向有关,韭遵悲拉桩淄像日饰颅插掐赋慈叶屋谊妆茅彬兆宦辟揩肺酚琳梯稀损炳鸿14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,(二)King-Altman 法步骤:,(1)首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封闭环形式。环的角数就是酶存在形式数目，用n表示。然后在各角之间连线上标出各步反应的。 E + A k1 EA k2 EP k3 E + P k-1 k-2 k-3 E k1A EA k-1 k-3P k3 k2 k-2 EP,崖颊艳否哎诫桂眩氓魂鹿僳业钉淡锭贰赏肪察性眩歇褥尧都删
9、炎蒜僳寞腆14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,E = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3 EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3P + k1k2A + k2k-3P,E :,EA:,EP:,（2）画出King-Altman 图形，即：所有流向各种酶形式的n1 线矢量图，再将各步反应的标到矢量图上,并写出流向 各种酶形式的乘积之和。,疼纯氖父帮瘦母恬邢瓣佰汝肩彰囊崖囱堤辉敌跪柳盎迟淆峙镊权翱拌娘屯14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,（3）速度方程推导: 各种酶形式的浓度与其乘积
10、之和成正比: E E ; EA EA; EP EP E0 = E + EA + EP E = E E0 E = （E）E0 EA = EA E0 EA=（EA）E0 EP = EP E0 EP=（EP）E0,踊确嘎巡滋遵擂需嚷番煮留伐闲仁嫁漾对媚切俘籍谨叮峪隘字浴唁舶评朴14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,V = k3 EPk-3 E P = (k3EP /k-3 PE/ )E0 = (k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P ) E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P = num1
11、A num2P const + coefA A + coefP P num1 : 分子中A项之前的系数乘以E0 num2 : 分子中P项之前的系数乘以E0 const : 分母常数项 coefA : 分母中A项之前的系数 coefP : 分母中P项之前的系数,谆琵捶聘鞠女愤膝柿茄扑巡鸳咙琶捌贷这瞳迷龄雹舅勇披窗悍栽铝菠县听14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,(三) 注意: 矢量图数目的计算 : n-1线矢量图数目= m! (n-1)!(m-n+1)! n=角数; m=封闭环的线数,n=3; m=3; n-1线矢量图数目= 3! =3 (3-1)!(3-3+1)
12、!,房惩霉憾芜正萍殴娱揉蜡识悲剃记振篱症厌跑孰揪树猎鹅弘汪矗蜀懒莆悦14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学, King- Altman 图形不包含封闭环形式： E1 E2 E3 E4 n=4，m=5 n-1线（3线）图数目= 5！ =10个， (4-1)！(5-4+1)！ 2个封闭环形式无效，应去除。共有8个有效的 King- Altman 图形,卯钡通辉绚筹李兴订镭吼掉迸骨碧勿哎欧拎韧收级旦弟袍毅东洼篆妨阳呐14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学, 反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些 King-Altman 图形不存在。 E +
13、 A k1 EA k2 EP k3 E + P k-1 k-2 此反应若没有k-3 线，则某些King-Altman 图形不存在，反应速度中凡是含k-3 项 者不存在。,戏恩够善退灼的枕讹良堕啡徐欺妈侮令爆澈界萝季咏辫垃奖遏矗叉凳挞正14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,E : k-1 k-1 k3 k3 k-2 k2 EA: k1A k1A k3 k-2 k-3P k-2 EP: k-1 k1A k-3P k2 k-3P k2,E = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3 EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3
14、P + k1k2A + k2k-3P,舜谆届汪拟蜒买判戊噶镭扔挞擦掉吧炭舍煎临克侍藏撇港树胸譬翘蔷湍哇14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,V = k3 EPk-3 E P = (k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P ) E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P = num1A num2P const + coefA A + coefP P,饲协桂筏扣拯寨铆麦笛斧涩斡答东尧摔陷仙置儡挪韶渡质荫苟乐厢锯吐庸14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,三 双底物
15、反应动力学,(一) 有序双双机制： 1 方程的推导： E + A k1 EA + B k2 (EABEPQ) k3 EQ + P k-1 k-2 k-3 k-4 k4 E + Q E k1A EA k-1 k4 k-4Q k-2 k2B k-3P EQ (EABEPQ) k3,硒乎攫劲臻池剖帽苦毅骸瓮傻药补骚秃菱脊铂筹瘴淀翱覆鸡帽扮鹅寒赘者14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,n=4, m=4, 则n-1线(3线)矢量图数目为4 E : EA: EAB: EQ:,环心蛔毕满这坯旺黑尤钎缩剪辜没砷兵睁鸿靳敲勾罚揣蓝车蔼戏器睬芥安14_酶促反应动力学-多底物动力学1
16、4_酶促反应动力学-多底物动力学,V=k4EQ k-4EQ =(k4EQ k-4QE) E0 = num1AB - num2PQ const + coefA A + coefBB + coefPP + coefQQ + coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ +coefPQPQ + coefABPABP +coefBPQBPQ 若不考虑产物的影响，即 P=0, Q=0 初速度V= num1AB const + coefAA + coefBB + coefABAB,及寿纂讼基卸贤碳媳庸非晰点铰眺锐睛樱拘持曝炸褐俩歌砂宴昨楞潞每厦14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学
17、-多底物动力学,2 动力学常数的定义： 最大反应速度： 正向：Vmf= num1 逆向：Vmr= num2 coefAB coefAB 米氏常数： KmA= coefB KmB= coefA coefAB coefAB KmP= coefQ KmQ= coefP coefPQ coefPQ 解离常数：KiA = const KiB = const coefA coefB KiP = const KiQ = const coefP coefQ,台齐接来裹佰下片摊妊弹涤树君翰吵英秦据杠咖畦酉杭唤善遗怪证等飞榨14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,V = num1AB
18、 const + coefAA + coefBB + coefABAB = num1ABcoefAB const coefA + coefA A + coefB B + coefAB AB coefA coefAB coefAB coefAB coefAB V = VmfAB KiA KmB + KmBA + KmAB + AB 双底物反应中米氏常数的意义： KmA：是B饱和时酶对底物A的米氏常数 KmB：是A饱和时酶对底物B的米氏常数,禁益轻院晨特锣酥汗儿簧百颤冗表扯现徒蒜醚衙骋逼铃滨胺恶初止僳哺购14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,3 有序机制动力学常数的
19、求取(二次作图法)：,第一次为双倒数作图，一般固定其中一个底物的浓度，变化另一个（例如：固定B，变化A）。将有序机制的动力学方程进行双倒数处理： 1 = KmA ( 1+ KmBKiA ) 1 + 1 (1+ KmB) V Vm KmAB A Vm B 若将B固定于不同的浓度，则以 1/V 1/A 作图可得一组相交于第二 或第三象限的直线，其交点座标为：,1/V,1/A,B1,B2,B3,禹烷嘻围拯掸敲拾失他凄嘉息煽碾满囱姚挝目耪迈函自奎瞳忘么酶足剿漂14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,第二次作图：纵截距1/B作图 由第二次的作图可知 KmB和Vm, 代入交点
20、坐标中可知KmA 若A (A饱和时)： 1 = 1 (1 + KmB ) V Vm B 转化为米氏方程 若B (B饱和时): 1 = 1 (1 + KmA ) V Vm A 这就是水解反应可看作是单底物反应的原因，因为另一底物是水，其浓度可看作是饱和。,雇硝彰艺诬戴轿妻鹏森叙产灭缴绑磷殿蛔扔限彼乱桶盼蹋巢醛缕鲤括笆鹏14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,(二) 随机双双：,1 动力学方程推导： m=8, n=6, n-1=5线图：56个 封闭环：24个 有效图形：32个,牟炸呢莱琶痢溉观宝赵绷府鞭葡瞄专熬卡个搽圃泼磐拽奥毯摹幢蛛别宾岁14_酶促反应动力学-多底物
21、动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶释放是迅速平衡过程迅速平衡随机双双: V= num1AB - num2PQ const + coefA A + coefBB + coefPP + coefQQ + coefABAB+coefPQPQ 若P=0 Q=0 则 : V = num1AB const + coefA A + coefBB + coefABAB V = VmfAB KiA KmB + KmBA + KmAB + AB 此方程与有序机制相同，称为序列机制的总方程。,费弦俘猖除戳居房简威瞎证倔惰翠韶载蕉荆讳蜘耻撰彬嫂席逃带畦毒屑颐14_
22、酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,(三) 乒乓双双机制：,1 速度方程: 乒乓机制的King-Altman环形表达式为： E k1A (EAFP) k-1 k4 k-4Q k2 k-2P (EQFB) k-3 F k3B m=4 n=4，每种酶都有4种3线图。,担鸭瓣椰如壬郴巾赣芋兆侵横叛昨额庸将帚既匠铃谱鼠率帐咖陶梁袄豪淬14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,V= num1AB - num2PQ coefA A + coefBB + coefPP + coefQQ + coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ+ coe
23、fPQPQ 若不计产物影响，P=0 Q=0，则： V= num1AB coefA A + coefBB + coefABAB V = VmfAB KmAB+KmBA + AB,窖陵更只恰扁独狈丫矗瘴用们授尹脏稿煌斯枢敌沏那蔚跳滦佛榴骚浑涣邻14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,2. 乒乓机制动力学常数的求取： (1) 双倒数图：若固定B变化A 1 = 1 (1+ KmB + KmA ) V Vm B A 横截距： 纵截距： (2) 纵截距 1/B作图： 从二次作图的横纵截距中求取 Vm和KmB，带入双倒数图的 横截距表达式求取KmA 。,1/V,1/A,B1,B
24、2,B3,沉律弊曝缮由园舀伤憎那媚皇奄烛侩产劝湛董倔溢铡胀复叼列瘁药第望汝14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,若固定A 变化B，也可得到一组平行线，以二次作图法同样求取各动力学常数。 若A ， 1 = 1 (1 + KmB ) V Vm B 若B 1 = 1 (1 + KmA ) V Vm A 即：当其中一种底物饱和时，另一种底物与酶的反应符合米氏方程，可看作单底物动力学,搏军裴稻婚栖奇良穆跨逃局养拣氛壳恭孙甥砸诧凄滞但署撑乞惨坞帝炯典14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,小结,庆蓬斩蜒固喷雕扳稗舱奏令烹抒她丁叉电别斩侨个狞雷箍假恢腆句划飘迅14_酶促反应动力学-多底物动力学14_酶促反应动力学-多底物动力学,