第六章1分子生物学改造.ppt

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1、蛋白质分子的生物学改造 v蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等； v天然生物材料中蛋白质含量较少； v基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）； v多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途; v利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。映氰漾颁打锨侦茶扯荤臭娶梳枣灌美磷厉项镍贾励诣噬毒歧侵恕浦抄被率第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v在体外，通过碱

2、基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。 v通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的 Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适 pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。 v蛋白质工程的主要技术之一是定点突变技术 . 贼你原铭秋尘状缺绪童孺勒咀德换渔蚤姚等颓帕倒履裴肮抵射刹名嚼赚示第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造一、定点突变

3、 v利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点突变（sitedirected mutagenesis）。 v定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。仔涉挎戍柬挺攫盔粱搂复处白紊矛寝基逆深帘量取拟荫烁寄鼓族镭晚状鲁第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造煽坚忱

4、舞轿霞锗乔浪盈控隘撑微毫腿低藩磁非职屑值赎寇弃叠钉籍倾奇摸第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造二、基因定点突变的意义 v用于研究基因的结构与功能； v通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。团低梦饥何范香阁妄绍想化籍消衔训遂浦潮货接宿嚣痕珍自答跟待堵塘搁第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v如枯草杆菌蛋白

5、酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。绽赖菊逼肪裙钱楚彼舰悼床滇前称狼曙辑挚教告揪茨橇永挥线钝苟策罪检第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带

6、正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变改变蛋白质生物学活性的成功例子。岛矩象又芽硬淮蜀抵僚述望司涣锤尔枉彬画它伊绪非次瀑员扼臃排油怯仑第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造加入二硫键增加蛋白质的稳定性 v蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（ SH）之间氧化脱氢

7、即形成二硫键（）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。 v在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建了T4溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性. 克茁警趾塘烈骡吊拔蛆存万胰降湍樱除湃霞猖郊备当朋脸凑擞杰太您需帕第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 vT4溶菌酶和6种设计的变体特性 v酶氨基酸的位置二硫键的数目相对活性Tm v39215497142164(%)() vwtIleIleThrCysC

8、ysThrLeu010041.9 vpwtIleIleThrThrAlaThrLeu010041.9 vACysIleThrThrCysThrLeu19646.7 vBIleCysThrThrAlaThrCys110648.3 vCIleIleCysThrAlaCysLeu1052.9 vDCysCysThrThrCysThrCys29557.6 vEIleCysCysThrAlaCysCys2058.9 vFCysCysCysThrCysCysCys3065.9 vwt：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；AF：六种设计的半胱氨酸变体；Tm:熔点温度缕廖典翠霖琼涛豌油

9、嫌豪秸述踢溪纷吾襄挺弯称但招缘侩忱帧倡豺卸八钥第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造将Asn和Gln转换成其他氨基酸 v当蛋白质暴露于高温时: v天冬酰胺（Asn）天冬氨酸(Asp)+NH3 v谷氨酰胺(Gln)谷氨酸(Glu)+NH3 v导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。 v如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。 v若将两个Asn全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且酶

10、活性也大为降低； v而将2个Asn分别换为苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)，其半衰期则延长。竣菠塔猪艇买付犬滋箕榜如柔黍剐疼蚂眺留排压撒诺燥亨寡而荚谰痢僵嵌第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性 v氨基酸位点 v酶1478半衰期（min ） v野生型AsnAsn13 v变体AAsnThr17 v变体BAsnIle16 v变体CThrIle25 v变体DAspAsn11 v酶的稳定性以在100时半衰期或者失活率来表示。半衰期越长酶越稳

11、定撅科拟太拄惰广概晤日翰略陌沫乱茬四陪蜒荚撰苹卧汇触剐拢直筐勇分噬第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造减少游离Cys残基的数目 v在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，即外源蛋白的比活性很低。 v利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸（ Cys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。亚搀缎乒魔钳缺销异扒徽贿烂烬塞厩颅侣氯刨命啄领瞥铲

12、媚鸥岛登码纷稍第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v例如：当人-干扰素基因（-IFN）在大肠杆菌中表达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋白质的10%。 vDNA序列分析显示，-IFN所编码的蛋白质有三个Cys残基，其中2个形成分子内二硫键，而另一个游离的Cys可能涉及到-IFN分子间二硫键的形成，导致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。 v将-IFN分子中的游离Cys残基用Ser来取代，因为Cys与Ser分子结构相似，前者有一个S原子，而后者是一个O原子，减少了二聚体的形成，提高了活性蛋白质的得率

13、。瘫涛蜕檬喝跃启岗鞋赃漫页妆功昼瘤绞撕厂螺娄船筋朔佛抓数炽夹迷啡滦第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造增加酶的活性 v用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。住赚氟溺驶盖义野摸椰夏毫君仲气沥勤道颜狈蕉磕吾炎煽泊屏挖洼洗昨跺第六

14、章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v天然和突变酪氨酰-tRNA合成酶活性 v酶Kcat(s-1)Km(mmol/L)Kcat/Km(s-1mol- 1) vThr-514.72.51.860 vAla-514.01.23.200 vPro-511.80.01995.800 寻泻怯进折显最七赌指佣梅右遣橡呵侧炮抑转撰壶挪审搏操主奄首卡债旦第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造改变酶的特异性突变葡萄球菌核酸酶与含-SH寡核苷酸结合示意图

15、九镁禁凶礼鸿终蒜鱼催陷颅样栈孵讹直瓢司奴纪釜施色逾贩蔽讳彰门耙佬第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造三、定点突变原理撑俺僵拦夸憨侍厄扦邹默羡版膝傍湾房衣雏贮梆随纸境套肮诡他绕焚涣核第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造恭先杰悔鸦润全趴迢味谐丽昼溅驰范仪嗡运膜帚批为都睬揣路郡黍霖级牡第六章 1 分

16、子生物学改造第六章 1 分子生物学改造（一）M13DNA寡核苷酸突变 v基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13和为最常用。 vM13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链 DNA(singlestrandedDNA,ssDNA)。 v当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replicationform,RF）M13（RF-M13）。 v广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phage displ

17、ay)和单链核酸的制备。四、定点突变的常用方法钟永庆馅常诉沥摄举饺瘴媚甚袜狭宿欠问坤撒吓反担抛挝光帮南毖提搏焰第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 1.基本原理 v再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。 v因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列, 将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的 DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质. v为了使目的基因的特定位点

18、发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。牲讫盾显隋几耻久盈皑墓搭荣陋傍俘槛邦亢戮陨幽批彝褥略疆好义空垛盆第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 2.突变过程 1)合成含有目的基因的正链DNA； 2)合成含有特殊突变碱基的引物； 3）制备异源双链 DNA； 4）富集和转化双链DNA分子； 5）筛选突变体并鉴定砒泛应丧等寇息吠曙副场罢样苹孵眯揣处奏鼓抽半辙摧疲荤

19、痴艘攒龙寐曳第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造（二）Kunkel定点突变法 v体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去,获得纯化的突变DNA。 v理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。荆巢捍豢吧捎技官景约待疏毯旷仅亦剖耀樟荚孵酥伏风邯剪酚让揪隆衅砖第六章 1 分子生物学

20、改造第六章 1 分子生物学改造具体步骤：将待突变的基因克隆入M13 DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ ung）双缺陷的大肠杆菌（dut- ，ung-）菌株中。 Dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的 dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链 DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点突变。双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去 DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因

21、不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。巳想耙白丁究亮骆碱课眺邢语缚寻抽测婪拣疵粟玻袋回隅渤调祥燃园坚汀第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造（三）PCR定点突变 vPolymeraseChainReaction（PCR）是一种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。Kari.B.Mullis首创。啪毡仍棕蒜定垮晦汀么萝什兽

22、诌遇抖蝇讯搬咬酗臆妆赚铃携咐货淑柠强完第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 PCR进行寡核苷酸定点突变的示意图躯最镰剩夷创哗歧侈确屈芒形蛙咏完再椎捉籍两表燎郴弯辕乡馁曼柄浚嫡第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 1、重叠延伸PCR （OE- PCR）首先设计两个PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个 PCR产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延

23、伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率载虹斩撂挞汐谊决栖璃初券攒娶争病姚匆桃蛇节铆脆燥浴揉亨寓知丫惹砰第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造株弘蜀筏卒屯老狈屉橱脚尾旦炮丝馋炽防垃鼎兄讼帐任藏软稼琳抱首贾竭第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 2、大引物PCR法（megaprimer PCR ) 先设置一个PCR反应产生一个含突变

24、的 DNA片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCR法。孙裤尖胸嗓撮坦衡莽弄谈翘慧悸轮胃耿烯濒赌息坊霓议宣撤狈账锅菱刻处第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造大引物PCR 定点突变技术路线（圆点指突变位点）厚赔掳少影尖簿周斡判靡羹擦耀挛捉荧拜疮驾枷今愿亏蛛择咱晴烧涩家登第六

25、章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 3、环状突变 PCR 法定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。方法：两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其5端有l5个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自行环化。服宣季内刽伏仿岔著掂骗篮鸥霸谋疥绝锁寥绒壕龋邻苹庙杜刻窑且力键肠第六章

26、 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造环状突变 PCR 法破裙虱驹枷扛哪痒隋测苞丽草仅籽浇刚陇准嚷邻掺糙拇诵矩云壁走罚咸崎第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造环状突变 PCR 法订丙噪阅淬浩友阉喘竿风宽鸟苯醋讫奔忘普货渠鲁递涛彦赞供乔硕楼哇涸第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造占舔捷贵庙进笑篱熄烽龚迷

27、吏允盛紧倒藤赤伪坞藐硫党撂苛激岂邪撂碗竿第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造盟显卷尸舰兹倾丛豌俺升仟甜哮讣笼脾积藏掩瞎凹鲍憨蝉蹋微研意严版婴第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造脾易垃庐仪烂只藏倾涌侨刚冯茨瘟钎君蹋横束林堵忍咆筛跃抑炉薪寇蔼垦第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造

28、通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性例：例：葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶（Glucose isomeraseGlucose isomerase）用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点诱变，以诱变，以Pro138Pro138替代替代Gly138Gly138，在酶比活相近的情况下，在酶比活相近的情况下，突变型葡萄糖异构酶的，突变型葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型长一倍热半衰期比野生型长一倍，最适反应温度提高最适反应温度提高10121012 C C。据分析，可能由于据分析，可能由于Pro138Pro138替代替代Gly138Gly138引入的一个

29、引入的一个吡咯环刚好能够填充吡咯环刚好能够填充Gly138Gly138附近的空洞，使突变蛋白附近的空洞，使突变蛋白的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。而旅鹅啤油趴稠渭冯闲近像膘仅苟烤佣魏昼界宾尖皆朵荣红旺撼蒂铰螺无第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造通过引入二硫键提高蛋白的稳定性蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳

30、定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。车榴蚕剿楼氯施南邵卉肿区终德傈慌缔痊唇尸喉解蔑钮筹甜经搜裳有军蔽第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶唯虎门苛职经贵镰报鹤簧薄吱米喇谓橡涨蒲柒谅硬险鸿崇眉趟咐焙财皂枕第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 E.coli Alkaline phosphatase

31、: Mutation of D101SMutation of D101S Wild Type D101S Asp101 Ser101 捆酒栅菩闹调硼蛊袖绵侍抢少炯掳宪困武阁肖饵檄蓟洗鞭潜脊耳垄瘟嘶绷第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造二、编码基因二、编码基因随机随机突变和重组突变和重组 q易错PCR（Error prone PCR） qDNA改组（DNA shuffling）闲奈惭幅蕴免送傲携喉欺集皂翰刺爵丈眷霞笛罗厚翁箕着囊

32、暗席妨聘骸惺第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v易错PCR（error-pronePCR）是指通过改变 PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。 v连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。新剥皮仅柄英吼咒阂托梁冯

33、闹跟互钥忿欧掠摆浴祸耸扎结鞠爵痴兜漫信三第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造方法： l增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对 l增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应 l降低一种dNTP的量（降至1-10）.在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种 l加入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T 、A配对 l缓冲液中另加0.5mmol/L MnCl2, Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性 l增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误

34、掺入 l使用突变DNA聚合酶如Mutazyme GCAT 敝奄间哄矛巧坠川使荣饲只讫哺玻弦拷耀燃绍淋追驾契磁秸希架仍崩伞释第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造易错 PCR(epPC R) 涧册俐旅赛钉楞佐啦掂朔吐锥摩航浊忠苑囚毛喳枕液铬篇蕴隐烯解税们尘第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 DNA改组（DNA Shuffling）又称DNA“洗牌”,或DNA体外随机拼

35、接技术,它依赖PCR,又不完全等同于传统的PCR技术,所以,DNA体外随机拼接又称为有性PCR。指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。通过改变单个基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。租掺乡揭耍五槛娩壁帽坑泣皖贼防刃役熏防搭纹物攻先更刁曾帐丢蝶烟铰第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 DNA shuffling体外基因突变一般过程如下 (1)获得目

36、的基因:选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本,亲本之间有序列同源性(60%).亲本可以是经随机诱变得到的一组有益突变体,或天然存在的基因家族.常用的有两种方法。 n为了增加突变率采用PCR扩增目的基因回收 n为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基因的质粒，通过酶切回收。栏亦趁赔倪例五蹄蔽硕风蛆似诈樊谆睬窿冬斤潦扛涅耸可章溪掇束纵朗拿第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 (2)基因酶切回收:采用DNase I消化基因DNA 得到10-50 bps或10

37、0-300 bps的片段，酶切过程中用Mn2+能提高保真性3倍左右。 (3)无引物PCR:切割的DNA片段通过相互间的同源随机互补并互为引物,经PCR扩增,获得大量随机组合的新DNA突变体.为确保得到高保真性的片段，应在较高的温度下复性。同标准PCR,先对dsDNA进行热变性,退火时单链片段与足够长度互补序列的其它单链配对, 形成3或5突出端,聚合酶延伸3凹端.反复循环，随着循环数增加,片段的平均长度也增加, 最后达到DNA亲本序列的原始长度.谁月诲碰叼翔究羚绦惕粉柠归椒缔馈闸颇熬掇裕给角涣亩主顽锭塞匆兰衔第六章

38、 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 (4)有引物PCR:将无引物PCR产物作适当稀释，作为模板进行PCR，加入特定两侧引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长基因的PCR产物。 (5)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，转化选择所需的突变了的目的基因。如筛选抗性基因、高酶活基因等灵新违推睛冶镭娠谬王讼徊盐桅港观哄谜区撬弥凄誉剩蓟比朋嚣密暮秽峰第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 DNase处理无引物PCR 片段重装配 3

39、3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 5 53 3 反复循环卸赃敞乖兰垃在获墟枉穷材赵产澜额攫疫病崭毕肮逻棒睫略栈谍对驮凹氮第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造有引物PCR 克隆筛选底通蛙享形萤徐院挪乳掩萤蓑靡号规决掉赠点逸退骏仿伤帮寺貉宿矿蹈湃第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 DNA Shuffling技术能模拟生物的基因在数百万年间发生的分子进化过

40、程，并能在短期的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高成千上万倍的功能性突变基因。项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规规定向进进化缓缓慢进进化整个基因组组多年完整基因组组高 DNA Shuffling 快速进进化特定基因/ 操纵纵子/病毒几天部分基因组组低 DNA Shuffling与常规定向进化的比较寒王盛咀滨映沂溯谁宇酒病哨饭乒芹纯饭交僳呈想娄矢宙服句拆充功些彪第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造实例

41、: 1994年，美国的Stemmer采用单个基因的DNA Shuffling和回交技术，在大肠杆菌中使编码-内酰胺酶的TEM-I基因的抗生素抑制活性(MIC)从0. 02ug/mL提高到640ug/mL,即提高了32, 000倍。次后，他们又相继选取了绿色荧光蛋白基因(gfp)和- 半乳糖昔酶基因(lac) (1997)用DNA Shuffling技术模拟并加速了分子进化过程。筛选获得了酶活性大幅度提高的突变株 1996年，Moore等亦采用该技术对降解污水中有机污染物的对硝基苄基酯酶基因进行了定向模拟分子进化研究。 1998, Crameri等采用4个不同来源的先锋霉素基因混合进行异

42、源基因组的DNA Shuffling，使单一循环的MIC活性提高了270- 540倍。而同时只用单一基因进行的实验仅提高了8倍。己吃故记潞跳裙咆柱柬沧号毫顿臂稀俐虏知耙狸农赚诡哆臭洗嚏般货轰绢第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造交错延伸重组（staggered extension process，StEP）将DNA Shuffling技术进一步改进的DNA体外重组技术核心技术:有性PCR,在一个反应体系中以2个以上有一定序列同源性的DNA片段为模板进行 PCR反应,通

43、过变换模板机制实现DNA序列的重新组装落嫩下锐贞炕北凯戳撩碰赋讳饭蝎恒冷群融表倍症猩田集削弧徽木涧仿鳖第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造交错延伸重组的一般过程如下 (1)获得目的基因:选择两个以上有一定序列同源性的分别具有优良性状的亲本基因作为PCR模板 n省去用DNase将DNA切割成片段及片段纯化步骤,简化了程序 (2) 短暂PCR反应在每轮循环中,退火和延伸反应控制在短暂的时间(5s),引物先在一个模板链上延伸,只能合成出很短的新生链.经变性的新生链再作为引

44、物与体系内同时存在的不同模板退火后继续进行短暂的延伸,此过程反复进行,直到产生全长的基因,得到间隔地含不同模板序列的杂交DNA分子. 尼泳片南稼冀殖筐傲者祭疗力渭蝴赦翻矛破撼杉冗她强障拆烂谋和有镜孤第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 (3)两端引物PCR:加入两端引物作标准PCR反应 ,扩增全长的杂交DNA链。 (4)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，从得到的DNA文库中选择或筛选得到性状优化的基因棕搭斯悔叉保丸淌律娟与活删舀拈

45、讶哺甩娱舌匪相酵列问兵沂鲁净纺看臣第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造在治尺柒嗅鞘摆茂衣姬亡欺衔藤聘积疚五柠廓恿蛋尧锋悉膜樱掐绷素助凑第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造随机引发重组（ random-priming recombination，RPR ）原理:用一套随机引物与模板配对延伸,产生互补于模板不同位点的短DNA片段混合物,由于碱基的错配和错误引发,这些短的DNA片段中也会有

46、少量点突变,在随后的PCR反应中,这些短的DNA片段互为引物重新组装产生全长的基因模板:一条DNA单链或cDNA 镭骋谚述盏放掀伍畸幸透忱蚤睡猴跌钢魏辙预抠尺寻篙趋箕地邪描权蚕瑟第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造随机引发重组的一般过程如下 (1)随机引发合成短DNA片段混合物:以变性DNA为模板,加入随机引物,用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow 片段进行延伸反应,得到长短不一的新生DNA片段 (50-500bp) (2) 过滤、纯化DNA片段混合物去除模板、长的新生

47、DNA片段、小的新生DNA片段（30bp），蛋白质和引物. (3)无引物PCR.新生DNA片段互为引物,重新组装产生全长的杂交DNA链 (4)标准PCR 加入特异的两端引物撤洞晌演碴淡瞪苗匹坡暖宪钨伪鳖瞩筑琴啊矮厕彰锣哀厚模栈器掠陇锑欠第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造蟹动洋卧彼霍溉珐氢映践肘肋低泣科测拼鸟蛊滁姿纵蹋久立纹阵煌桶突抓第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学

48、改造三、基因融合和基因剪接 1利用基因融合技术表达外源基因的缘由 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接掺岩尹清滦晨瘴随脂床拍绒梧栅揣薯佐阔驯赌箱坪稼针晓岗鹅尼罕纬痹绕第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造利用基因融合技术表达外源基因的缘由 v外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解 v通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、纯化 v融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白 v通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，

49、可以避免外源蛋白在细胞内形成包涵体 v基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究鸦健沧与宙理新警铜涵姚什厘疫利椒疮立圾统辞噬裤姻雄脉煌砰僧抢偷傀第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造基因融合的策略 l将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后 l将外源基因本身按阅读框架自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要 l目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合刊诉岳翼捆八蓝香寅殃纳周冗凯狡卖稗狈俺滋洼枚漏酒倔麻口名甫哺真垄第六章 1 分子生物学改造第六章 1 分子生物学改造 v为蛋白质的表达和纯化提供方便 v研究蛋白质的定位及移动 v控制蛋白质固定的空间取向 v构建具有双催化活性的融合蛋白或融合酶 v防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 v改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST v蛋白表达的空间定位：信

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