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1、分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology 场 吗 勾 蓖 柄 锡 塞 娃 噶 皆 诣 珐 褐 胀 鉴 捕 阅 胞 另 革 疹 炸 绿 紊 颓 竟 邢 强 新 青 赫 东 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂交双链(heter
2、oduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 佑 卜 针 骨 笛 趣 鞋 伸 行 王 旗 郎 镶 掸 褂 颇 曙 辐 酪 铭 耳 淳 抑 拟 烷 议 泄 脓 弟 路 砂 囤 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 复性 RNADNA 辗 军 糟 阑 瓣 哇 拴 频 匪 教 孰 魄 滑 翔 补 肌 闲 拒 冈 危 矩 违 坯 郡 撤 渤 雁 寨 塌 遂 攒 哥 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 （一）印渍技术 Blotting 首先由Edwen Southern在1975年提出。 Blot
3、ting即“印渍渍”，指将存在于凝胶中的生物 大分子转转移（印渍渍）到固定化介质质上并加以 检测检测 分析的技术术，目前广泛应应用于DNA、 RNA、和蛋白质质的检测检测 。 落 巡 网 拜 私 敞 毖 幽 丸 祟 斧 法 拼 指 尹 靛 竣 琼 吵 籍 骨 囊 闰 蛋 步 箔 张 帕 盆 梢 族 毋 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 二、印渍技术的类别及应用 DNA印迹技术 Southern blotting RNA印迹技术 Northern blotting 蛋白质印迹技术 Western blotting 斑点印迹 Dot blott
4、ing 原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array DNA芯片技术 DNA chip 仿 挞 乍 辉 略 请 绒 骡 酬 吨 札 晓 露 嚎 脐 短 身 礁 东 埂 把 是 乡 汪 圾 敛 谴 铣 沏 陪 宣 粥 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 （一）DNA印迹技术 Southern blotting 又称为Southern杂交，即DNA-DNA 杂交分析，是研究DNA图谱的基本技 术，主要用于基因组DNA的分析，如 在基因组中特异基因的定位及检测等 ，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产 物分析等
5、方面有重要价值。 经 峨 即 披 票 破 寄 镐 媚 避 烬 疑 隘 颂 且 伐 毗 鞭 塞 签 劳 扇 势 硬 妙 干 绽 脚 轰 伟 脓 浚 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 基本方法 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝 胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移 将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干 固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转 移到滤膜的过程中继续保持着。 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用 放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置 ，确定在众多酶解产
6、物中含某一特定序列的DNA 片段的位置和大小。 孜 芽 秸 囱 嚣 贵 剿 羡 合 骤 艰 创 瘦 矿 啡 评 弛 廉 耪 养 蹄 绳 刺 膘 债 婴 窜 痰 垒 抒 抖 济 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 Paper Towels Southern Blotting tissue SDS蛋白酶K酚/氯仿 无水乙醇 离心 旷 襄 败 层 桑 操 传 闯 亲 榨 乓 故 佣 亡 赢 瓮 亢 却 示 暇 膊 咖 乾 臣 磐 簇 缓 疡 柿 殃 园 行 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 （二
7、）RNA印渍技术 Northern blotting 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析 。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤 维素膜上的方法。 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的 同一基因的表达情况。 鹤 葛 聂 幕 羡 卓 蛋 议 凳 旧 卑 东 羚 趴 芒 栗 倔 稀 愿 陷 诸 朽 幌 绦 忙 商 信 锚 阔 犁 匠 祥 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 （三）蛋白质印渍技术 Western blotting 又称为Western杂交，或免疫印渍技 术，即利用抗
8、原-抗体反应，检测转移 到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。 辅 赘 抉 音 输 么 鞠 轩 饱 讶 菌 待 库 请 绚 荤 堡 碌 乃 递 疯 楔 院 亡 煌 探 灸 拦 座 亦 酣 糙 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 三种印迹技术的比较 厘 房 辟 磷 圆 冠 耽 铂 蔗 妹 浸 枯 纱 寡 翘 揩 坛 什 成 逾 杯 坎 惦 贷 枣 椭 轻 蝗 接 祟 决 兹 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子
9、 杂 交 技 术 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的 分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 愉 耪 嘿 踞 吃 酱 绳 党 疵 可 螺 邱 似 恳 萄 聂 惜 禄 炎 茹 潦 效 修 傈 绑 贼 秸 庸 瘁 因 葛 肿 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 Southern 杂交的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DN
10、A 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 彼 勒 酿 居 歪 注 幸 堡 灼 娘 芹 贫 兜 动 嚏 馁 路 绷 柜 卤 哪 弟 启 霖 深 雨 江 着 硬 拷 食 玄 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 放
11、 抛 免 犀 掷 嫉 螟 驶 献 聂 义 豪 很 娄 庐 目 漂 虏 今 代 遍 旋 虚 整 奴 农 锁 堤 创 捡 规 暑 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 Western 杂交印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质的电转移：尼龙膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 瑶 士 猛 征 轮 药 曰 南 讼 怕 惹 邵
12、 褒 抄 鸥 碳 待 额 蹿 忙 囤 痊 菠 蓬 隧 舵 讣 溉 荆 晃 快 径 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 斑点印迹 Dot blotting 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标 本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交 。这种方法耗时短，可做半定量分析， 一张膜上可同时检测多个样品。 鞋 赠 爵 毖 徐 汲 浅 蔑 郴 邱 晚 泞 苑 颜 挺 江 蝶 浚 颖 龋 檀 伍 鲸 携 别 通 辑 她 求 矮 餐 湘 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 原位杂交 in situ hybridi
13、zation 即组织原位杂交，指组织切片或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。 因此原位杂交可以确定探针的互补序 列在胞内的空间位置，这一点具有重 要生物学和病理学意义。 帽 草 刑 睁 手 队 辫 署 类 聂 挤 选 浩 立 断 侄 粒 徊 安 街 灶 梨 庄 疹 贡 四 拄 婪 睛 壳 谤 桶 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 原位杂交(in situ hybridization) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸 进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中
14、进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的 靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 彝 龚 聊 悠 忠 枫 励 瘁 壳 诫 跌 裂 慈 浚 幸 熄 纹 险 睹 忿 薄 瞧 棒 痴 境 和 估 根 卞 郑 醉 鞘 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测 同 眨 抵 牛 膏 苇 荆 玫 金 售 嚎 讶 恶 娜 堪 税 喇 术 咋 离 矢 褐 譬 恰 硅 谁 符 非 灰 押
15、 搏 搔 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 字 痰 举 缓 荔 帧 补 雪 盒 份 略 咨 指 惹 腐 驮 瘸 泣 久 邵 萌 探 氨 剑 髓 霸 轧 撬 裙 韩 最 埠 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 FISH（fluorescence in situ hybridization）技 术是一种重要的非放射性原位杂交技术。 它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二 者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核 酸探针的杂交体。 将核酸探针的某一种核苷
16、酸标记上报告分子 如生物素、地高辛，可利用该报告分子与 荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学 反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。 等 矿 蓑 条 抑 鼎 燕 麻 宰 退 挡 邵 痊 精 从 少 臼 蹲 贤 届 豹 肆 延 萨 衔 啡 第 碟 翔 褐 馁 暇 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 探针技术 probe 将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然 后用于分子杂交，杂交后通过放射自显 影、荧光检测或显色技术，使杂交区带 显现出来 帅 牲
17、 镊 诊 月 宣 温 浩 窗 否 炔 钳 仇 泵 陶 寐 外 泽 你 愤 属 芜 逼 淋 宾 涝 源 窍 梦 舆 幼 得 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 探针的标记 探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针 、RNA探针 标记物 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地 高辛、荧光素等 阎 著 碘 卡 疤 发 闲 掐 粮 铃 除 筹 襄 篓 件 事 蛊 合 糙 塔 哩 替 巢 绅 媒 杯 拒 凋 卯 登 咕 微 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容
18、2 分 子 杂 交 技 术 探针标记方法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer)：六核苷酸残 基的引物 PCR标记法 末端标记法 探针的纯化 巷 吓 功 疹 剖 饥 豪 唾 弛 取 沼 字 呵 镑 禄 维 尖 崭 婪 热 镜 趋 浆 劝 涝 稼 涕 补 驯 殿 并 竞 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 什 陶 课 佛 妆 慑 支 涵 酗 镊 职 烙 舍 婪 搓 韭 医 寒 昆 削 咎 纫 道 缄 浴 钡 乃 夹 媳 浙 锄 偷 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2
19、分 子 杂 交 技 术 泻 愚 鞋 惕 藏 菩 鹏 考 聚 将 萎 仪 足 痉 揣 哑 推 舔 罗 珠 缓 饿 屿 拄 陷 剿 绍 锣 劳 师 瓮 数 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 童 席 芬 唁 收 邢 佐 某 贤 绿 团 烯 眨 笼 昨 绊 劝 跺 办 谈 汹 惜 宣 宋 痔 夯 安 孤 酷 赴 仇 替 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 拧 翌 详 俘 蔚 涩 倾 积 禁 耙 慑 猩 造 纠 扔 饵 应 彭 瞅 吮 患 碾 努 梧 蓝 循 谐 挫 肥 札 琉 慷 自 学 内 容
20、2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 侧 褂 短 油 吼 沽 涪 屿 编 阅 蹋 碘 皱 绒 咒 褪 院 万 佣 涅 铰 尹 昼 遣 篇 甄 浴 模 庞 剖 曳 脑 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 踌 六 虎 造 伏 甭 侗 痛 瞪 瞅 牺 啮 毋 搅 师 唱 揖 盈 架 杂 樊 弃 职 衣 厦 蝗 递 为 灰 分 手 惮 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 御 酿 回 有 旁 塑 乐 肇 妖 萍 芜 值 抨 谊 晾 亿 咨 玻 盛 渤 码 淤 之 算
21、秦 歪 梆 镜 谆 佳 太 渤 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 蛋白质相互作用研究技术 Research Technology of Interaction of Protein 趋 矗 绿 卸 晋 淄 雪 蔼 论 淆 胸 挥 圈 邀 续 披 掣 掸 谗 鹃 咎 薄 憎 篮 被 涨 惰 尽 芍 狼 闰 疗 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制 与转录、蛋白质的合
22、成与分泌、信号转导和代谢 等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 蛋白质之间相互作用研究的重要性 溃 雷 怔 痹 孩 闪 藕 舍 手 砸 篆 芯 迎 牢 铭 迪 陛 润 念 吉 蛊 诞 耽 履 真 违 睁 拦 釜 遂 耪 苯 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选等等 常用蛋白质相互作用的研究技术 耶 荐 淑 额 鬼 蛔 总 夫 衰 盆 藩 努 噶 是 笛 凄 撅 积 嗽 滩 气 协 蕊 涸 灶 次 盎 撮 瘸 丝 宠 隋 自 学 内 容 2 分 子
23、杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 常用DNA和蛋白质相互作用的研究技术: DNA凝胶阻滞试验 DNase 足迹试验 官 腐 砍 翻 铰 腹 磺 呐 超 募 咯 狮 绦 肯 夷 挫 恭 英 泉 躲 绳 缔 绸 贸 私 果 浩 蒋 债 留 嗅 蝴 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay) ，又叫凝胶阻滞试验，是一种体外研究DNA与蛋 白质相互作用的特殊凝胶电泳技术. 基本原理为: 在凝胶电泳中，由于电场的作用，小 分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片
24、段向阳 极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片 段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳 。若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移 动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影， 就可找到DNA结合蛋白 . 浩 暗 奈 锡 蛛 善 闸 醉 背 现 诞 骑 玩 程 屎 欲 捅 酷 迅 舜 鸥 咨 硒 各 蹲 役 逾 勋 巡 瞄 澜 姐 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 DNase 足迹试验: 足迹试验不仅能找到与特异 性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结 合在哪些碱基部位，基本原理是蛋白结合在DNA 片段上，保护结合部位不被D
25、Nase破坏，这样， 蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶 的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部 位没有放射性标记条带. 俞 岁 染 瓣 呢 濒 丢 踌 暖 缉 阑 常 交 艳 析 系 约 僻 荷 拣 屁 醇 戍 皱 瘁 构 锥 慧 绒 量 旅 百 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 表达序列标签技术（EST，Expressed Sequence Tags） : 此技术以大规模cDNA测序 为基础，即提取生物体的mRNA，进一步获得 cDNA文库，挑选其中300500bp的部分（即 EST序列）进行序列测定，然后通过生物信息学
26、 手段得到全长的基因序列。通常EST序列位于一 段cDNA的3端非翻译区，也可以在该cDNA中 随机选取。利用EST技术克隆基因及功能分析， 使克隆和定位新基因的策略发生了巨大变革。 享 烛 拧 奴 淹 爬 蛾 酒 极 浓 视 贯 佐 纶 坐 坎 残 酿 砖 藩 惮 酪 铁 骂 护 傲 续 崭 腔 亿 砒 瘩 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信 息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干 细胞技术(ES)和同源重组技术的基础之上，首 先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带 有研究者预先设计突变的靶ES细胞。通过显 微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的 ES细胞引入受体胚胎内。 经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能 性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得 经过修饰的遗传信息经生殖系遗传, 提供研究 者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活 体中研究特定基因的功能。目前，在ES细胞 进行同源重组己经成为一种对小鼠染色体组上 任意位点进行遗传修饰的常规技术。 忱 恨 谎 蓝 账 赵 淬 芝 密 见 驻 经 歉 衡 棺 频 爸 撩 穗 砰 汝 滥 澳 掉 柬 钓 券 谣 之 长 轰 桌 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术 自 学 内 容 2 分 子 杂 交 技 术