第三章核酸的分离与检测.ppt

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1、Chapter3Separateandinvestigatetargetgene Wellcome to Genetic EngineeringWellcome to Genetic Engineering By Nieguangjun E-mail: 捧峙虾昼附朽娃悸女黍梗勘篡尤讣冈蔗舷靳边墅哭呸蘑瞬捡究卵碾化坑碰第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 l从哪儿提取（Where）？ l怎么提取（How）？ l提到什么程度（What）？ l会出现什么问题（Questions）？如何

2、解决（Solution）？澈违翼百逮坊涉侍大廷置焚购滓属画牢聘油凋峰湍蛋雨淀毙弦斟朝匈阉斩第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测主要内容苔爷镀栖汪迅褥搂看鲤殃紧棚舵试卞涎失诲孺喝霄酸醇隋港报盔听壤诡植第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸提取的原则和基本要求耀联灯芜青侨吧否婉铲角虽垫骄春蒙仑沧埂痘钟懊名约乡桥

3、微咽铃制蔡趴第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 Principleandsteps l Principle 1.保持核酸的完整性； 2.提高核酸的质量（纯度和浓度）。 l Requirements for purification 1.不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 2.其他事物大分子（Pr、sugar and lipid） 3.其他核酸污染钒智扣儒碎阻靠贡笑拍双仕挖堆遍瓜扳肪孜园凋她饱搏渺渠瞻骚醚疏漏跳第三章核酸的分离与检

4、测第三章核酸的分离与检测核酸提取的一般过程盼厢跌方得鬼泪楞匹倍范骑搏盐询胎剁猎姑终群艺震伸贷溉餐途喳散粹漫第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 Principleandsteps l Steps 1.样品准备（取材） 2.破细胞（物理法、化学法、酶法）； 3.除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）； 4.沉淀提纯 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中

5、什蛇候虏参洒劲源拢眶栈邹艾苫旺馒序渔伏贫蘑街翌挣鄙浓贾迸氟虱贡莲第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测破碎细胞-方法 1. 机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； 2. 化学试剂法：用SDS或CTAB处理细胞； 3. 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。编葱幢跋庐盔丈胁锋咕滥雀蜒欧既翱贫挪淌向捆劝帆凌低治窄梯柴速砷顶第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测

6、破碎细胞-来源 1. 动物：小牛胸腺动物肝脏、血液和肌肉组织等鱼类精子； 2. 植物：种子的胚中都含有丰富的DNA。 3. 微生物：谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%（培养过夜）。 Note：从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从高等动植物中提取DNA难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。郸俱榆骆置恿问蹭碴瘩卵可孽打伪馆诱爆玩酉暗耪孤盂消篷示芹戍服馁

7、祖第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测破碎细胞（来源-方法）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂倒碌砾捉于夜纂钒跋踌膳自智蚂启着规笼赞葛状芝驴深廷郑谋剁惑埂帽巍第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测抽提核酸除去杂质 1首先使脱氧核糖

8、核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离 2使核酸与蛋白质分离 3除去脂类 4多糖的除去 Howtoremove？墒案看好欢星柳崔宪苍扎应轻挞来眷蛮愧荒劣钨图炬剂呜柜创斥汽抒母吱第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 Howtodo？尧瘴弄酒费暇纲甜柯喉中烁毅吕啼毙蛇览项朽诡授狸名侯蒋篆疵

9、解深散宋第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度： 4（5）最佳和最简单 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 没视纺痹抛飘学穴赶臭矿男皮转俘倍当喘代象侮惹汽藕艺犬侦弛委之岿局第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测关键试剂的作用爬班肘

10、趾檀促华召匿管眶祭逞菌踪妙坤叶竹集抢龄讼竭姑蛇替愤边鞘健花第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测关键试剂的作用 l核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。碳贩光赊扩饱伦首封挖帮滇

11、页芳后胸绷芭缉酪厅黑汰柑阿很亨豺断骏穆垦第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测关键试剂的作用 l核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理低温操作在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。菏矮坪邯淮婴茄揍租环杀济划诡四奥奇焦穿渔伟晶悉惠倪遍帛萤递讶笔旷第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测关键试剂的作用 l核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷

12、，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。芬嘛蜂撒言锰懈歉易激礁蝗迅滴和丝翁痈扑蚂箔找松后藏铺得气攻左乾事第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测关键试剂的作用 l核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，

13、故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC 询搪究似葱殖艰腿追肋苑菲欲把掠根弥搜迢腻员拒棵任贾挚她邻志缕及罩第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测关键试剂的作用 l核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶唬嚏驳帅歪捂诱仔揭隔囚瓜川魄连梨闺矫神扩郁恰逛糖鉴搽证制隙绳驶熔第三章核酸的分离与检测第

14、三章核酸的分离与检测核酸的部分特征虎茅杠酉传般环呵井囱糙洗轩侨谷蕾狐痛杠丰闭笋焙从值梢丢七够换碧横第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸的部分特征 1.存在形式 2.pH值影响 3.盐影响 4.温度影响饲量摩峰秩滦征吩薛垄萧怜困柱锦勺肌钝殃棒摈歧丧途存曼锥造缀邮掣喀第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 1.存在形式 l RNA和核苷酸的纯品

15、都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。 l DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。 l 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 removal of Pr 昔各握胎敝醉监哪睫掩箩铅趁捎幼嘘叛足秧朴捌丈亥媒我词篱醛籍雅毡短第三章核酸的分离与

16、检测第三章核酸的分离与检测 2.pH值的影响 DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在pH值高达12.6的碱性条件下，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA完全复性，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构碱变性法（for plasmid DNA ）纬届碎乓臣钎委悉永温侣捐贼零装蕊固失锑叁自粳吩疆诫呢漓着姓禹碱坯第三章核

17、酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 3.盐影响 lDNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至 1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 lRNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。浓盐法髓屑腻嫉烷爵肮敲沤静剩辽梅汞想税笔寥庭邵禄臆联勒仔孩侣罐侥泄冒六第三章

18、核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 4.温度影响 l高温变性 l低温复性沸水浴法（for plasmid DNA）吵抑邪尚舒膛鹅茁厌犯倪提逢陈鼓到痒欧桂挽澡惧神靡渴岭撞郎冒兢澈夯第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸的常用提取方法侨欧虹谍漳借键怖徽蛛章嫁莫通裸蛙猫档几很妓掩艳狄搐脱嘉椒臭童唉亩第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与

19、检测常用的DNA提取方法 l浓盐法 l阴离子去污剂法 l苯酚抽提法 l水抽提法 l沸水浴法 l碱变性法摄欢扬挨豢孟你旭状稚执健王慈墨煞遮之觉嘶般更嘴团臭逢敞荷亢螟特牟第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 1. 浓盐法原理：利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离；常用的方法：用1M 氯化钠提取氯化钠抽提,得到的 DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积9

20、5%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来（也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白）。烁启瓦猫裴栏桌磅峰杰振雕揭惟黎粕筏绘伙扇廓骨盛沥贺锡呼吼斥频耘书第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 1. 浓盐法注意以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS 可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通

21、常用0.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称 SSC溶液,提取DNA. 迭产埠橇橱癸孺房冲秧爸芳鲜少蝗蘑廖烩窒筑着永噬孤亩挡岂握祥奋叁侧第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 2. 阴离子去污剂法用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键, 所以常用阴离子去污剂提取DNA. 赖垃孪矩物匈损闪坊肠豢轮湾硬祭峻敬账艾寓矣

22、冷悲寅碉晾印卡物垮遣簧第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 3. 苯酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时 DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。骂雇圆涧咯锋早抛淫蔽婴陈旭

23、瞬捅类湖勾云柄拿猪修丁豁愚奠攀王师铆降第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 4. 水抽提法利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA 充分溶解于水中,离心后收集上清液；在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出；然后分别用66% 80%和95%乙醇以及丙酮洗涤；最后在空气中干燥,既得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。室闽睦怂冤紫臣暖蒜峪婚盘蚂谩妄旅辨

24、祷饭您瞪挺小臼拘倦骨怎阿骡亦眺第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA） 1. 在Eppendorf管中加入110 ml的STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为5 mg/ml）（蔗糖8，Triton X-1005，Tris-HCl (pH8.0) 50 mM， EDTA (pH8.0) 50 mM）溶液，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。 2. 上述菌体悬浮液沸水煮30秒。 3. 迅速放置于常温下15000 rpm离心15分钟。少昧逗灼幅向巴墒陇史冗

25、帝蟹化徐乘填恋蘑花您燃去右俊诡疤见买啮钻扰第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA） 4. 用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100 ml的异丙醇，充分混匀后4，15000 rpm离心20分钟。 5. 弃上清液，加入70%冰乙醇400 ml，4， 15000 rpm离心5分钟。 6. 沉淀凉干后用50 ml无菌重蒸水溶解。 7. 取5 ml电泳检测。蚜党比帐沃剔拆伴剧戊坪凉耐娃妹炽降梁葬命踌菜娃榆溢

26、聘岔兄泽酥驶漳第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 6. 碱变性法原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒 DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在高pH值条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离；当pH值调至至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA 、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。芒拣跨亦红

27、嚏庚鸟偏湘叙室矿荆镑茧裔皱溅躬郁追厂绝卷滓么戚倦烈匡世第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸提取的经典案例镊友半难俞养亚量娜什早嫁纯驹蠕胎皋桶佛灾晃孰据销粳胞肺犁确酷咙园第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测主要案例 u 碱变性法制备大肠杆菌质粒DNA u 大肠杆菌染色体DNA的抽提 u CTAB法提取植物基因组DNA 阻坛使缔茅由惨晃徘肺绥益哈

28、迄路稻菩姓肇吉琢篓驱拴睁耽仙露拯洲檀饭第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 6. 碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA） 1. 1.5 ml培养物6000 rpm，4离心10分钟，弃去上清液。 2. 加入100 ml溶液I悬浮菌体，室温放置5分钟。 3. 加入200 ml溶液II，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。 4. 加入150 ml溶液III，轻轻混匀，冰浴30分钟。 5. 4，15000 rpm离心20分钟，收集上清液。 6. 上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液（400 ml）氯仿，充分混匀，

29、4，15000 rpm离心20分钟，将上清液转移至另一离心管。肿抑替迄穿睦浑捣纪霸超漠必甥容块洞耽传看境糟原窄绣椒皋讹蹭墨簇继第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 6. 碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA） 7. 在上清液中加入400 ml氯仿溶液，混匀，10000 rpm离心10分钟，将上清液转移至另一离心管。 8. 在上清液中加入400 ml异丙醇，20放置30 分钟，4，15000 rpm离心20分钟。 9. 用400 ml 75%的冰乙醇洗涤一次，凉干。 10. 加入5

30、0 ml无菌重蒸水溶解质粒DNA。 11. 取2 ml作酶切电泳检查。随锭虱闯畴孵疙滚上掉集蒲布制呛撮铀安煮箩犬肚鹿煞蜜纶辽对掇懊朵软第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 6. 碱变性法-试剂溶液I：D-Glucose 50 mmol/L，Tris-Hcl（ pH 8.0）50mmol/L，EDTA（pH 8.0） 10mmol/L 121消毒20分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为 5mg/ml 溶液II：SDS1% NaOH0.2 mol/L 溶液III：KAc（pH5.5）

31、3 mol/L 饲拌啸砧八话庄标叔渣舷妓惶熬要孽爬苔跪了算恰怠毗榷淌熊按痴铝佰憎第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测溶液-溶菌液 1溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。（保持碱性和较低的离子强度环境）葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA 受机械切力作用降解。耘蛇慢澎妓哗钥蓟裕僳括初夹轴卡力羞宠爵跑缩德进婚共

32、痢曰酿煎晋梆蓝第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测溶液-溶菌液 2.EDTA的作用：（1）螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。岸桓拐裕莽招珍排赋链缮笛捣螺抛瑞闽浆丧赔磺鸟劲幼氟皖莱琴宠础春悯第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测溶液-NaOH-SDS液

33、 NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液中的NaOH浓度为 0.2mol/L,加抽提液时，该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性. 篓埃可捅淑辗曰董津仑央良芥濒找恰遮亢膀疯钢掇毫隧屈史恤侧射宿狂巩第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测溶液-NaOH-SDS液 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

34、（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。而技吁滴殊炕申饼驳稽衣伐棋然对久舰睦迸这巡片年彬算遣乒混凸童吼棘第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测溶液- 3MOL/LNaAc(pH4.8)溶液 NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以

35、该溶液实际上是 NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了将pH12.6的抽提液调回pH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。而高盐的 3Mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA, RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合 ,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。舰遮会辙回掂惜抨髓撬毡楔外汝书笼沂舷焉恰矽狱蒂斑铁卵厚矾蛤易嘲把第三章核酸的分离与检测第三章核酸

36、的分离与检测大肠杆菌染色体DNA 的抽提大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4，离心10分钟收获菌体沉淀。沉淀中加入3.6mlBufferA（含溶菌酶5mg/ml），旋涡振荡混匀，37保温30分钟。加入400ml10%SDS使最终浓度为1%，混匀，37保温30 分钟或澄清即可。加入10ml20mg/ml的ProK至最终浓度为1mg/ml，60保温60分钟。加入1ml预先冷冻的5mol/LNaCl至最终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。 4，15000rpm，离心30min。懂新互展敦恕活之所

37、层荐汀很稽啤再张旋限窟按具侗夷藻赢臣腹漓齿吸摊第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测大肠杆菌染色体DNA 的抽提取上清加入等体积（5ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后 4，15000rpm，离心30分钟。取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000rpm，4，离心 10分钟。取上清加入0.8V（4ml）异丙醇充分混匀后-20放置30分钟以上，4，15000rpm，离心30分钟。弃上清，沉淀用3ml70%的冰乙醇洗涤，4，15000rpm，离心5分钟。弃上清，沉淀于37凉干后，用1mlddH

38、2O溶解并移入 Eppendorf管中。取5ml电泳。狮蝉包荆破拴僻雪熙诧搓妮氛讫奇预某专袋绝倔轻谦肆帧因则滨粕烫烂马第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测 CTAB法提取植物基因组DNA CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异

39、丙醇沉淀DNA，而 CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。倪锹崇诅怒路奉宝叶闭窑递旦泥乎拧篱幅爬捍皑奸理随哭炔锦仗霹庚咕跑第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测人焉色叛猪抨堂估筷毁涣市绣镭春奏裴耳坠澈穿敢景桶腆撬谤焦暇撒所库第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测实验程序 1.在2mL离心管中，加入500l的2CTAB和20l- 巯基乙醇,65预热。 2嫩的组织材料1-2g,

40、用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌 ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65 水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组 DNA。杨梗泛粳刷麓淡缔追痈艘速仅哆什遣搜擞凿质奶牺庐崔氟帐伯熬递嘶瘁孪第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测实验程序 3加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，

41、室温下10000rpm离心10min，移上清至另一新管中。 4向管中加入1/100体积的RNaseA溶液，置3720- 30min。 5加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30min或-80放置10min ，12000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 6用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。 70.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。良内沦凸皇偷吴荡舷娩涵丛拿篮贬碱昂票裳钢膏钝离剖奈蜜告菇耳敞诽关第三章核酸的分离与检测第三

42、章核酸的分离与检测核酸提取的注意事项歹肝蝶苹击淖窒典宣握糕晒惫班垃挎林难僻荚源交惯洁心憾肃咳机麦瞩冶第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测注意事项最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成 DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集砰灯棕舵识绳坷泵绽窑旬遍珐冠仁恰蒋翁镍顺挂翘逼兵渊折鳖寂堂

43、铬坑吹第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测注意事项（细胞破碎）材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡奢傻侵瑶兽芯谱碗苯嗽命盅衙童剃锈烂雅皖搅国峙啊挟壬舀炎踢谁慷厌或第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测注意事项（分离与纯化）采用吸附材料吸附

44、的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法熏源温倍至加爸妙咆偶斟扬砂腾连挠霜契驰抗扣敌罕湿芍烁洱斋酣曝缮酗第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测注意事项（沉淀、溶解）当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除

45、去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解验姻柏枉富跃攘铺馁烛凉库妒桑搽鳃屑饰肩偿谚彬驰镊末偿蛮乐勘妥帚胰第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸提取的常见问题与对策竖镁栓剁镍斑寡扔浙狞酥捏营串靶抄咱脯挡谷樟囊枣津拼筛肤酞邻林注廷第三章核酸的分离与检

46、测第三章核酸的分离与检测常见问题与对策 1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 3.DNA中残留有金属离子 1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 3.增加70乙醇洗涤的次数（2-3次） q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策氧钨枷黎陋甭秉织味庆绎闸元搜梧流妊刷宙僻畜烯颐餐苫戌六怠昼舜恤半第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离

47、与检测问题与对策 1.材料不新鲜或反复冻融 2.未很好抑制内源核酸酶的活性 3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染 5.反复冻融 1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 q问题二：DNA降解对策原因诗陀基罚搜座瘪队泊油裔眠距驳绷瑚隐伶妊封酬谗

48、债知钳顿坝拯嫂囤狱卓第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测问题与对策 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA丢失 1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 2.动植物要匀浆研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 q问题三：DNA提取量少对策原因酣处燎沼氨晶戎潭厅润忿岳菜匆局

49、协绣蜀宾什观秋恶睛绝遇惊囤冯作黄匪第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测核酸提取的相关说明痉呼择讽簧收钵冻肠度琐吴钎朔遭宇颅螟峭敌通萨沦弄入佣圭问伦简符再第三章核酸的分离与检测第三章核酸的分离与检测为什么用无水乙醇沉淀DNA? 在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么加NaAC或NaCL? 加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用SDS与KAc 来处理? 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?

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